人參和酶解人參中的人參二醇和人參三醇的含量比較

張念潔，曲新砉，劉洪亮

（1.延邊朝鮮族自治州產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)所，吉林延吉133000；2.琿春綠源參業(yè)生物科技有限公司，吉林琿春133300）

人參和酶解人參中的人參二醇和人參三醇的含量比較

張念潔1，曲新砉2，劉洪亮1

（1.延邊朝鮮族自治州產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)所，吉林延吉133000；2.琿春綠源參業(yè)生物科技有限公司，吉林琿春133300）

建立了高效液相法色譜測定人參和通過酶解工藝處理后的人參中的人參二醇和人參三醇的含量比較的方法。色譜條件：DiamonsilC18色譜柱，流動相為甲醇∶水，（95∶5）檢測波長為230 nm。結(jié)果樣品經(jīng)提取，水解和衍生化等前處理后，人參二醇平均回收率為92.87%，RSD為2.18%（n=6）；人參三醇為平均回收率91.7%，RSD為2.10%（n=6）。人參二醇1.6 ug～16ug內(nèi)有良好的線性關(guān)系，r=0.9997。人參三醇1.6 ug～16ug內(nèi)有良好的線性關(guān)系，r=0.999 1。

酶解人參二醇；人參三醇；衍生化；高效液相色譜

人參的主要成分是人參皂苷（Ginsenoside），人參皂苷中人參二醇和人參三醇具有脂溶性活性成分，毒性低、分子量小、易于通過血腦屏障的特點(diǎn)，對動脈粥樣硬化的形成有預(yù)防作用[1]，人參二醇和人參三醇不僅具有降血脂、抗脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、提高機(jī)體免疫力、預(yù)防感染等作用，還可產(chǎn)生抗疲勞、延緩衰老、調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)、提高機(jī)體免疫力、改善心腦血管供血不足、抑制腫瘤細(xì)胞生長等功效[2]。

現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，口服人參以后，主要人參皂苷在人的消化系統(tǒng)中被轉(zhuǎn)化成稀有人參皂苷后吸收起藥效，但因含量稀少大大限制了其應(yīng)用，因此制備稀有人參皂苷具有重要意義。獲得大量、高純度的稀有人參皂苷，并開發(fā)成可用于臨床防治腫瘤的制劑將具有重要的科研意義和社會價值，這將對先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)和創(chuàng)新藥物研究具有重要意義。

用于人參皂苷糖苷化合成的方法主要有化學(xué)合成法、酶解法和微生物轉(zhuǎn)化法[3]。酶解人參作為有效成分可直接被人體利用，且利用程度與腸內(nèi)微生物分解能力無關(guān)，有效避免了服用人參的效能個體差異，提高了人參藥用成分的利用率。

人參皂苷經(jīng)強(qiáng)酸水解得到人參二醇和人參三醇[4]。國內(nèi)外對人參二醇和人參三醇的含量測定方法報道，比色法[5]、薄層色譜法[6]、高效液相法[7]以及超臨界流體色譜法[8]。本文采用衍生化試劑[9]，反相高效液相色譜法對人參中酶解前后的人參二醇，人參三醇含量測定方法進(jìn)行了研究比較。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

日本島津LC-10AT型高效液相色譜儀：SPD-10AD紫外可見檢測器，SIL-10AD自動進(jìn)樣器，SCL-10A系統(tǒng)監(jiān)控器。

甲醇：色譜純；水：一級去離子水；甲醇配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液儲備液（1mg/mL）；甲醇稀釋相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液；人參二醇（＞99%）對照品Lot（AW017P）、人參三醇（＞99%）對照品Lot（AW 016P）：天津一方科技有限公司提供；3，5-二硝基苯甲酰氯（＞98%）：上海化成工業(yè)發(fā)展有限公司）；人參酶解前后的樣品由琿春綠源參業(yè)生物科技有限公司提供[10]。

1.2 色譜分析條件

液相色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)色譜柱為DiamonsilC18柱（4.6mm×250mm，5μm）；流動相：甲醇：水（95∶5）；流速：1.0mL/min；檢測波長為230 nm，色譜圖見圖1。

圖1 色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram

1.3 對照品的制備

精密移取人參二醇對照品和人參三醇對照品，置于25mL量瓶中，用甲醇溶解稀釋至刻度，搖勻，得0.4mg/mL的對照品溶液作為儲備液。精密吸取對照品2mL，加3，5-DNB 20mg，無水吡啶0.3mL，置75℃水浴回流1 h，取出后減壓用氮?dú)獯蹈桑瑲堅盟臍溥秽芙?，定?mL。

1.4 樣品的前處理

精密稱取人參提取物0.1 g，加入10mL45%乙醇超聲提取1 h，加濃硫酸2.0mL置75℃水浴回流4 h，冷卻后調(diào)pH6～7，環(huán)己烷提取3次，加Na2SO42 g脫洗液濃縮至近干，加入加3，5-DNB 20mg，無水吡啶0.3mL，置75℃水浴回流1 h，取出后減壓用氮?dú)獯蹈桑瑲堅盟臍溥秽芙?。定?mL。過0.45μL濾膜，進(jìn)樣。供液相色譜測定用。

精密稱取酶解人參提取物0.1 g，其余操作與人參供試品溶液制備相同，即得。

2 結(jié)果與討論

2.1 線性方程和方法檢測限

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密吸取人參二醇對照品和人參三醇對照品，2.0、4.0、6.0、8.0mL分別置10mL量瓶中，用四氫呋喃稀釋至刻度，搖勻，分別吸取20μL，注入液相色譜儀，按照1.2項(xiàng)下的方法測定，以對照品濃度為橫坐標(biāo)，對照品峰面積為縱坐標(biāo)，結(jié)果經(jīng)回歸分析，人參二醇1.6 ug～16 ug內(nèi)有良好的線性關(guān)系，回歸方程Y=119 914X＋32 955，r=0.999 7。人參三醇1.6 ug～16 ug內(nèi)有良好的線性關(guān)系，回歸方程為Y=86 139X＋23 535，r=0.999 1。見表1。方法檢出限按S/N=3計算，人參二醇最低檢出線以信噪比為3∶1計算，人參二醇的低檢出線是1ug/kg，人參三醇的低檢出線是1ug/kg。

表1 濃度與面積關(guān)系Table1 Relationship of concentration and peak area

2.2 精密度實(shí)驗(yàn)

按照對照品溶液制備方法（1.3），配制溶液，按照1.2項(xiàng)下的方法測定，連續(xù)進(jìn)樣5次見表2。精密度實(shí)驗(yàn)精密吸取人參二醇、人參三醇對照品溶液20μL，測定峰面積，結(jié)果人參二醇RSD為1.63%。人參三醇RSD為1.02%，見表2。

表2 精密度實(shí)驗(yàn)Table2 Precision experiment

2.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)樣品溶液，按照1.2項(xiàng)下的方法在0、2、4、8、16、24 h分別進(jìn)樣20μL，測定峰面積，結(jié)果人參二醇RSD為1.81%，人參三醇RSD為1.23%，表明樣品溶液在24 h內(nèi)保持穩(wěn)定。見表3。

表3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)Table3 Stability experiments

2.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

重復(fù)性實(shí)驗(yàn)取同一批樣品6份，按“1.2”項(xiàng)方法測定峰面積，人參二醇RSD為1.50%，人參三醇RSD為1.36%。見表4。

表4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)Table4 Repeated experiment

2.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

加樣回收率實(shí)驗(yàn)精密稱取人參樣品0.1 g，分別加入一定量的（3個梯度濃度）人參二醇，人參三醇對照品溶液，按“1..4”的制備方法及“1.2”項(xiàng)條件方法進(jìn)行測定，結(jié)果見表5。

表5 加樣回收率的實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=6）Table5 Results of recovery ratio

人參二醇平均回收率為92.87%，RSD為2.18%（n=6）；人參三醇為平均回收率91.7%，RSD為2.10%（n=6）。

2.6 樣品的含量測定

取樣品按照1.2項(xiàng)下的方法測定，人參樣品中含有人參二醇的含量、人參三醇的含量見表6。

表6 樣品中的人參二醇和人參三醇的含量Table6 The contents of Panoxadiol and Panaxatriol in samples

3 結(jié)論

1）經(jīng)過多種實(shí)驗(yàn)方法的比較，最終選擇該檢測方法同時測出樣品中的人參二醇和人參三醇的含量，本方法快速靈敏，酸水解引起苷元結(jié)果的變化，主要得到人參二醇（Panoxdiol，PD），人參三醇（Panaxatriol，PT）及C-20差向異構(gòu)體[9]。衍生化方法、回流的時間、溫度是整個實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵一環(huán)。經(jīng)實(shí)驗(yàn)對比，衍生化方法解決了人參二醇和人參三醇在無紫外吸收的情況下無法測定的問題。

2）最近十幾年來除了傳統(tǒng)的化學(xué)合成法外，酶解法和微生物轉(zhuǎn)化法被應(yīng)用到這個領(lǐng)域中來，采用酶解法具有反應(yīng)條件容易控制、酶系豐富、等許多化學(xué)合成法所不具備的優(yōu)點(diǎn)。在工業(yè)化大規(guī)模制備稀有人參皂苷時首選酶解法和微生物轉(zhuǎn)化法[10]。通過本次試驗(yàn)，樣品的含量測定結(jié)果顯示，酶解工藝處理過的人參中的人參二醇和人參三醇的含量均大大超過了普通人參中的人參二醇和人參三醇的含量，這與酶解工藝有關(guān)，提高了稀有人參皂甙的含量。這次試驗(yàn)的結(jié)果為以后的制備人參皂苷制品提供了一定的參考價值。

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Simultaneous Determination of Residual of Panoxadiol and Panaxatriol Ginseng and Enzymolysis Ginseng by High Performance Liquid Chromatography

ZHANG Nian-jie1，QU Xin-xu2，LIUHong-liang1
（1.Yanbian State Product Inspection，Yanji133000，Jilin，China；2.Hunchun Luyuan Ginseng Industry Scienceand Technology Co.，Ltd.，Hunchun 133300，Jilin，China）

To establisha high performance liquid chromatography （HPLC）method for simultaneous determination of residual panoxadiol and panaxatriol Ginseng and enzymolysis Ginseng by HPLC external standard method.HPLC gradient elution method was used withmethanol -water（95∶5）.DiamonsiC18 column was used，and panoxadiol and panaxatriol was determined at the detection wavelength of230 nm.The samples were treated by extraction，hydrolysis and derivation The averrage recovery and RSD of panoxadiol were 92.87% and 2.18%（n=6），respectively.The averrage recovery and RSD of panaxatriol were91.7%and 2.10%（n=6），respectively.The standard curve of panoxadiol was linear in the range of 1.6 ug-16 ug，r=0.999 7and The standard curve of panaxatriol was linear in the range of1.6 ug-16 ug，r=0.999 1.

enzymolysis；panoxadiol；panaxatriol；derivatization；HPLC

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.06.007

2014-09-19

張念潔（1979—），女（漢），工程師，研究生，研究方向：分析化學(xué)（食品質(zhì)量分析）。