低劑量輻射下土壤細(xì)菌群落及其功能基因的響應(yīng)?

吳娜，楊多，趙魯玉，岳海濤

(新疆大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830046)

0 引言

電離輻射是對生物體產(chǎn)生危害的重要因素之一，其主要來源有自然界放射源的本底輻射和人為放射源輻射.按照一般測算，日常生活中，室內(nèi)伽馬輻射的年平均有效輻射劑量為0.41 mSv/y，室外地面輻射的年平均有效輻射劑量為0.07 mSv/y，醫(yī)療來源的輻射量為0.4至1 mSv/y，其它來源的年輻射量小于0.02 mSv/y[1?3].而離開大氣層保護(hù)的飛機(jī)在12 km的飛行高度時(shí)，機(jī)體所受的輻射劑量約為14.32 mSv/y，機(jī)內(nèi)的機(jī)組人員按每年工作500小時(shí)計(jì)算，所受的年輻射劑量約1.64 mSv/y.自然界的輻射源主要包括234U、238U和226Ra等，對人類所造成的輻射劑量占比超過98%.這些放射性核素可以在環(huán)境中廣泛傳播，尤其在土壤中可以富集并產(chǎn)生影響[4,5].

輻射會影響生物膜組成和功能完整性，還導(dǎo)致單鏈DNA甚至雙鏈斷裂損傷，使相關(guān)蛋白質(zhì)變性、造成某些酶的減少或失活，利用這一特性，在食品工業(yè)中可以應(yīng)用放射源產(chǎn)生輻照來抑制微生物繁殖[6?12].土壤中的輻射源會對微生物群落組成、分布和代謝途徑產(chǎn)生持續(xù)且不可逆的影響[13,14].研究者通過對核試驗(yàn)核心區(qū)、高中低放射性廢液儲存罐、反應(yīng)堆和核廢物處置場、切爾諾貝利核電站廠址及周邊等不同劑量輻射場中的微生物組成及分布進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌、真菌在上述涉核、涉輻射環(huán)境中均有分布，且這些微生物對不同劑量的輻射均產(chǎn)生了抗性[15?17].這些環(huán)境中所蘊(yùn)含的微生物資源，經(jīng)過篩選可應(yīng)用于低濃度鈾污染的環(huán)境治理，與傳統(tǒng)的治理方法相比，微生物法具有價(jià)格低廉、二次污染低、效果好、能回收鈾等優(yōu)點(diǎn)[18?20].圍繞這一目標(biāo)，國內(nèi)外學(xué)者在高輻射劑量下（1～25 KGy）篩選了一些微生物菌種資源，并研究了其耐輻射特性及核素富集和轉(zhuǎn)化的機(jī)理[18]，但對于接近自然界本底輻射的低劑量（50倍以下累計(jì)劑量）輻射背景下的微生物區(qū)系影響的報(bào)道很少.

為豐富對不同劑量輻射背景下生物效應(yīng)及功能基因應(yīng)答的認(rèn)識，選取典型的低輻射環(huán)境采集土壤樣品.樣品采集地點(diǎn)位于新疆和布克賽爾蒙古自治縣因資源枯竭關(guān)閉回填的鈾礦場，在礦井口等少數(shù)地點(diǎn)，仍然可以檢測到連續(xù)的低劑量，使用蓋革（Geiger）計(jì)數(shù)器實(shí)地檢測，其土壤中平均輻射劑量約為7.71 mSv/y，最高輻射劑量可達(dá)到32.76 mSv/y，分別是自然界本底輻射劑量的17倍和71倍.對上述地點(diǎn)的土壤樣品進(jìn)行采集，通過Biolog Eco PlateTM微孔板、16SrRNA擴(kuò)增子測序和宏基因組測序等方法，對其中細(xì)菌群落碳氮源代謝情況、多樣性和輻射相關(guān)功能基因進(jìn)行分析，并在此基礎(chǔ)上篩選了可培養(yǎng)的藤黃微球菌等耐輻射菌株.

1 材料與方法

1.1 土壤樣品采集

土壤樣品采集自新疆和布克賽爾蒙古自治縣鈾礦填埋場，選取臨近區(qū)域正常土壤作為對照組（1.5 mSv/y以下）LR4.按照土壤樣品的不同輻射劑量，分為低輻射組（1.5～5.5 mSv/y）LR1、中輻射組（5～10 mSv/y）LR2、高輻射組（10 mSv/y以上）LR2共三組實(shí)驗(yàn)組.采樣深度為地面5 cm至20 cm以下的淺表層.同時(shí)對不同采樣點(diǎn)的地表植物進(jìn)行鑒定，該鈾礦填埋場可生長的植物主要是菊科、禾本科和藜科，在屬水平上豐度最高的為蒿屬.土壤樣品的輻射強(qiáng)度及地表植物分類見表1.

表1 輻射土壤樣品采集信息Tab 1 The information of radiation soil sample collection

1.2 土壤中細(xì)菌多樣性分析

微生物多樣性測序委托北京百邁克生物公司進(jìn)行.基于Illumina HiSeq測序平臺，選擇V3+V4區(qū)域進(jìn)行16Sr-RNA擴(kuò)增[21],擴(kuò)增引物為上游引物：5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′；下游引物：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT -3′.對各樣品進(jìn)行測序后，通過Reads的拼接和過濾[22?24]，對樣品OTU 聚類分析[25]，測序物種進(jìn)行注釋，并且對物種豐度進(jìn)行分析，進(jìn)一步對樣品α多樣性和β多樣性進(jìn)行分析[26].使用UCLUST[27]在QIIME[28]（版本1.8.0）軟件對所測得樣品序列按OTU（分類操作單元）進(jìn)行分析.

1.3 碳氮源代謝分析

利用Biolog Eco PlateTM對環(huán)境樣品中碳氮源的利用情況進(jìn)行分析[29].稱取5 g土壤樣品，將樣品加入20 mL滅菌ddH2O中.60 min后取1 mL上層污泥，12 000 rpm離心20 min，棄上清，加1 mL 生理鹽水（0.85%NaCl），振蕩5 min使之混勻；再次10 000 rpm離心20 min，重復(fù)以上步驟2次（除去其中的碳源），棄上清，加1 mL生理鹽水，振蕩5 min使之混勻，2 000 rpm離心1 min.取上清液加入20 mL滅菌生理鹽水的V型槽中，使其OD590在0.13±0.02.將V型槽中的稀釋液加入Biolog微孔板中，每孔加入150 μL，置于30°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4 h后測取初始數(shù)據(jù)，每隔12 h用Biolog細(xì)菌自動讀數(shù)儀讀取數(shù)據(jù)，連續(xù)讀數(shù)240 h.

1.4 可培養(yǎng)細(xì)菌篩選

分別稱取2 g土壤樣品分散于50 mLddH2O中，120 rpm振蕩1 h，靜置待分層后，用接種環(huán)蘸取上清液在TGYM培養(yǎng)基[6,30]上劃線，分別置于30°C和37°C培養(yǎng)7 d，期間按時(shí)觀察菌落生長情況并作好記錄，根據(jù)菌落形態(tài)、顏色等進(jìn)行分類統(tǒng)計(jì)，將篩選的菌株用10%甘油進(jìn)行保存，存放于-70°C.進(jìn)一步對保存菌株進(jìn)行16 SrDNA序列分析，取新鮮菌液1 μL作為模板進(jìn)行菌液PCR，擴(kuò)增所需上游引物PrimerF：5′-AGAGTTTGATCCT GGCTCAG-3′；下游引物Primer R：5′-ACGGCTACCTTGTTACGACT-3′.將測序結(jié)果在GenBank中進(jìn)行比對，使用MEGA7.0軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育樹.

1.5 代謝通路和功能基因分析

將土壤樣品宏基因組測序委托上海美吉生物有限公司進(jìn)行，測序平臺為Covaris M220測序儀.通過KEGG數(shù)據(jù)庫對獲得的基因進(jìn)行了功能注釋和匹配，將獲得的預(yù)測基因與KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較，得到相應(yīng)的KO-ID，從而獲得基因參與的特定生物學(xué)途徑.對這些基因的生物學(xué)功能及不同生物合成和分解途徑進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，篩選出修復(fù)和重組相關(guān)的關(guān)鍵基因.

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌多樣性分析

Alpha多樣性指數(shù)中的Chao1和ACE指數(shù)，Shannon指數(shù)和Coverage指數(shù)可用于估計(jì)群落中的物種總數(shù)，群落異質(zhì)性和數(shù)據(jù)庫的覆蓋率見表2.

表2 Alpha多樣性指數(shù)統(tǒng)計(jì)Tab 2 The statistics of alpha diversity indexes

結(jié)果顯示，Coverage指數(shù)表明該樣品中所注釋的微生物群落覆蓋率均高于99%，測序數(shù)據(jù)覆蓋度較好.高、中劑量輻射組土壤樣品的Chao1、ACE指數(shù)以及OTU數(shù)量，均顯著高于對照組，表明在輻射背景下，土壤微生物多樣性和群落豐度較正常土壤增加了.

以輻射劑量為主要影響因素，對樣品土壤中微生物組成差異進(jìn)行非度量多維尺度法(NMDS)分析(圖1(a))，結(jié)果顯示，對照組和低輻射組的樣本分布相對離散，而中輻射組和高輻射組的樣本集中，表明中、高輻射組之間的相似度較高，而對照組和低輻射組之間的相似度較低.從β多樣性角度對樣本進(jìn)行聚類(圖1(b))，中輻射組和高輻射組的樣本之間的距離相對較近，對照組和低輻射組的樣本之間的距離較遠(yuǎn).中、高輻射組聚為一個(gè)分支，低輻射組和對照組聚為另一個(gè)分支，中、高輻射組樣本之間的進(jìn)化距離相近，樣本的相似度更高.

圖1 beta 多樣性分析Fig 1 The analysis of beta diversity

使用UCLUST在QIIME（版本1.8.0）對土壤樣品微生物多樣性測序結(jié)果進(jìn)行分析，獲取OTU分類信息，以97%的相似性為對比閾值進(jìn)行聚類，對OTU進(jìn)行分類注釋.計(jì)算每個(gè)樣品中OTU的分布數(shù)量，分析不同輻射強(qiáng)度下土壤樣品中細(xì)菌共有和獨(dú)有的基因數(shù)目，繪制Venn圖（見圖2）.

圖2 土壤樣品Venn圖Fig 2 The venn diagram of soil sample

14個(gè)輻射土壤樣本中共注釋得到2 488個(gè)OTU，對照組的3個(gè)樣本中的OTU數(shù)量為266個(gè).其中低輻射組B組3個(gè)樣本共有341個(gè)OTU，占總數(shù)的20.6%；中度輻射組C組的5個(gè)樣本共有884個(gè)OTU，占總數(shù)的46.5%；高輻射組D組3個(gè)樣本共有856個(gè)OTU，占比為48.1%.輻射組和對照組土壤樣本共有OTU為73個(gè)，占總OTU的5.6%.對照組獨(dú)有的OTU為41，占OTU總數(shù)的3.2%.與對照組相比，高、中、低輻射水平樣本組獨(dú)有OTU數(shù)量分別為166、188、129，占OTU總數(shù)的12.8%、14.5%、10%，表明輻射樣品中的獨(dú)有微生物群體的數(shù)量顯著高于對照組.中度和高度輻射樣本共有455個(gè)OTU，占總OTU的35.1%，表明兩組的微生物群落相似性高于其它組.

通過門、綱、目、科、屬、種和OTU等水平對每組樣品分類情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)(表3).在門、綱、目和科水平，對照組的菌群豐度顯著高于輻射組，而在物種和OTU水平，中、高輻射組的菌群種類數(shù)量顯著高于對照組，低輻射組的菌群種類數(shù)量是四組中最低的.在門水平上，變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、綠彎菌門（Chloroflexi）和酸桿菌亞門（Acidobacteria）6個(gè)菌門的豐度為所有樣品的80%以上(圖3).與對照組相比，輻射組土樣中變形菌門數(shù)量降低，而酸桿菌亞門數(shù)量增多，此結(jié)果與報(bào)道的高劑量輻射土壤中微生物多樣性結(jié)果一致.

圖3 土壤樣品各菌門豐度圖Fig 3 The abundance map of each bacterial phyla in soil samples

表3 不同分類水平的物種豐度統(tǒng)計(jì)Tab 3 The statistics of species abundance on different taxonomic levels

2.2 碳氮源代謝分析

為了研究在輻射照射下土壤樣品中微生物碳、氮源的利用情況，利用Biolog Eco plateTM微平板方法，對31種碳、氮源進(jìn)行了測試.供試碳、氮源包括8種有機(jī)酸，7種糖，6種氨基酸，3種多元醇，2種聚合物，2種胺，2種酯類，每個(gè)碳、氮源設(shè)置三組平行.初始測試時(shí)間為4 h，每間隔12 h測量一次吸光度，橫坐標(biāo)為檢測樣品的時(shí)間點(diǎn)，縱坐標(biāo)為32種碳、氮源.隨著輻照強(qiáng)度的增加，土壤樣品中微生物群落的代謝強(qiáng)度增加，并且不同樣品中微生物群落可利用的碳、氮源和化合物的豐富度與輻照度呈正相關(guān)(圖4).輻射組在48 h開始快速生長，而對照組在60 h開始快速生長，中度和高輻射水平的碳水化合物、氨基酸、胺和酯的利用率顯著高于對照組，特別是β-甲基-D-葡糖苷、D-木糖、苯乙基胺、丙酮酸甲基酯.每個(gè)樣本對Tween 40和Tween 80均有較高的利用率，表明上述樣品中的微生物對聚合物類型的碳、氮源仍有利用能力，可作為潛在的高分子聚合物降解菌株的篩選來源.

圖4 環(huán)境樣品碳氮源利用情況分析Fig 4 The analysis of the utilization of carbon and nitrogen sources in environmental samples

2.3 可培養(yǎng)菌株分析

從連續(xù)的低輻射土壤樣品中共分離并測序145個(gè)單菌落（表4），對測序菌株構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹(圖5).分離樣品屬于30個(gè)屬，包括假單胞菌屬（Pseudomonas spp）、芽孢桿菌屬（Bacillus spp）、腸桿菌屬（Enterobacter spp）、節(jié)桿菌屬（Arthrobacter spp）、泛團(tuán)聚體屬（Pantoeaagglomerans spp）和微桿菌屬（Microbacterium spp）等.其中，假單胞菌屬數(shù)量最多，豐度最高，占31.0%；芽孢桿菌屬次之為11.0%，腸桿菌屬為10.3%.從輻射土壤樣本中，篩選了3株可培養(yǎng)的具有抗輻射和耐鹽堿脅迫特性菌株，其中1株經(jīng)16S rDNA鑒定為藤黃微球菌屬（Micrococcus luteus），將其命名為M.luteus R17.M.luteusSC1204可以在8 kGy劑量的伽馬射線照射下存活下來，與M.luteus DSM 20030T的相似性為99%[31].R17也可能具有類似的抗輻射性，R17可產(chǎn)生大量的多糖，可用于抗菌和抗真菌研究，它還具有抗氧化活性，可以吸收UVA射線[32].為了測試M.luteus R17對伽瑪射線的耐受性，我們用60Co輻射源照射了M.luteus R17和E.coli S17-1，結(jié)果顯示在4 kGy的輻射劑量下（細(xì)菌和輻射源之間的距離約50 cm），M.luteus R17菌落的存活率超過50%，而所有大腸桿菌菌落均死亡(關(guān)于M.luteus R17的耐輻射特性將另文報(bào)道).

表4 可培養(yǎng)菌株統(tǒng)計(jì)Tab 4 The statistics of cultivable strains

圖5 可培養(yǎng)菌株系統(tǒng)發(fā)育樹Fig 5 The phylogenetic tree of cultivable strains

2.4 功能基因和代謝通路分析

對照組（LR4）功能基因數(shù)為6 762，高輻射組（LR2）功能基因數(shù)為7 558，是對照組的1.12倍，低輻射組（LR1）功能基因數(shù)為7 289，是對照組的1.08倍.結(jié)果表明連續(xù)低輻射提高了功能基因的多樣性，并且隨輻射劑量升高，功能基因種類越豐富.在Venn圖（圖6）中，對照組和輻射組共有5 449個(gè)基因，占總基因的59.9%，表明各樣品間功能基因存在共性，也有很大的差異.其中高低輻射組共有6 261個(gè)基因，占68.8%；高輻射組與對照組共有基因?yàn)? 716個(gè)，占62.7%；低輻射與對照組共有基因?yàn)? 988個(gè)，占65.8%.而高輻射組、低輻射組、對照組特有基因?yàn)? 040、489、517，分別占11.4%、5.4%、5.7%.表明連續(xù)低輻射環(huán)境對功能基因有一定的趨同性，而輻射組與對照組功能基因存在差異，其中輻射劑量越高差異越大.

圖6 KEGG注釋的功能基因Venn圖Fig 6 The Venn diagram of the KEGG annotated of functional genes

KEGG注釋的6大通路(圖7(a))中，代謝通路所占比例高達(dá)68%～70%，遺傳信息處理通路所占比例約10%.在代謝通路(圖7(b))中，輻射組中乙醛酸、二羧酸代謝、丙酸代謝、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解、脂肪酸降解、氮代謝、色氨酸代謝、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成的比例均高于對照組，其中碳代謝、氨基酸的生物合成、嘌呤代謝所占比例最高.在遺傳信息處理通路和復(fù)制修復(fù)通路(圖7(c)、圖7(d))中，高輻射組DNA復(fù)制，核苷酸切除修復(fù)，堿基切除修復(fù)和非同源末端連接途徑的比例均高于對照組.然而，在低輻射組中，只有DNA復(fù)制和核苷酸切除修復(fù)途徑的比例高于對照組.

圖7 各樣品代謝通路分布差異圈圖Fig 7 The circle diagram of the distribution difference of metabolic pathways for each sample

KEGG注釋了各樣品基礎(chǔ)代謝通路，并對各代謝通路包含的基因個(gè)數(shù)進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)，其中對照組基因數(shù)目高于輻射組，且輻射劑量越高基因數(shù)目越少，高輻射組在各代謝通路中基因數(shù)目約是對照組的一半.輻射對細(xì)菌種群的整體代謝通路活性具有抑制作用.

進(jìn)一步研究了三組不同土壤樣品的宏基因組學(xué)數(shù)據(jù)，重點(diǎn)研究了與DNA修復(fù)相關(guān)的功能基因，結(jié)果表明，在高輻射劑量組中，ko03410（堿基切除修復(fù)）通路中的功能基因的數(shù)量―mug(TDG/mugDNA糖基化酶家族蛋白)顯著高于對照組和低輻射組.但是，在DNA復(fù)制、修復(fù)和重組相關(guān)的功能基因中，對照組的基因數(shù)量要高于輻射組(表5).輻射組總功能基因的豐富度高于對照組，但基因數(shù)量卻少于對照組.輻射損傷的主要修復(fù)方法是堿基切除修復(fù)、直接損傷修復(fù)、核苷酸切除修復(fù)、堿基錯(cuò)配修復(fù)、重組修復(fù)和SOS修復(fù).隨著輻射值的增加，每個(gè)修復(fù)途徑中功能基因的數(shù)量減少.

表5 基于宏基因組學(xué)復(fù)制、修復(fù)和重組相關(guān)編碼基因分析Tab 5 The analysis of coding genes related to replication,repair and recombination based on metagenomics

續(xù)表5

3 討論

電離輻射是常見的對生物體造成危害的環(huán)境因素之一，但由于自然輻射環(huán)境在自然界中并不多見，且具有一定的危險(xiǎn)性，因此此類環(huán)境樣本較難獲取，對微生物的影響研究報(bào)告較少.現(xiàn)有的報(bào)告主要集中在從切爾諾貝利核電站的核泄漏中收集的高輻射環(huán)境、內(nèi)華達(dá)州核試驗(yàn)基地的高輻射環(huán)境、中國新疆放射性核輻射試驗(yàn)區(qū)的高輻射環(huán)境樣品及其報(bào)道等，這些研究的電離輻射背景特征為高強(qiáng)度、短作用時(shí)間，目前較缺乏對長期且連續(xù)、低輻射背景環(huán)境下微生物區(qū)系影響的研究報(bào)道[15?17].本研究以采掘后回填的鈾礦為樣品采集地，研究了輻射背景下土壤中的細(xì)菌區(qū)系和宏基因組對輻射環(huán)境的響應(yīng).

研究結(jié)果表明，土壤細(xì)菌區(qū)系的多樣性豐富程度與輻射劑量呈現(xiàn)出正相關(guān).低輻射劑量的微生物多樣性與對照組相比，變形菌門、放線菌門、擬桿菌門、芽單胞菌門、綠彎菌門和酸桿菌亞門的豐度占所有菌門的80%以上[33,34].在OTU分類水平上，高和中等輻射組的OTU數(shù)量顯著高于對照組，這表明輻射增加了土壤微生物的多樣性和群落豐度.與多樣性水平相對應(yīng)，土壤樣品中微生物群落碳、氮源的代謝強(qiáng)度與輻射劑量呈正相關(guān).宏基因組測序的結(jié)果表明高輻射樣品中的MUG蛋白家族數(shù)目明顯高于低輻射組和對照組.Josef Jiricny實(shí)驗(yàn)室首次發(fā)現(xiàn)TDG/mug（胸腺嘧啶DNA糖基化酶）時(shí)，由于其能夠從G：T錯(cuò)配中去除T，因此被命名為胸苷糖苷酶[35].后來的研究表明TDG實(shí)際上屬于mug（錯(cuò)配導(dǎo)向的尿嘧啶DNA糖基化酶）蛋白家族，具有mug蛋白的一般特性，具有修復(fù)G：U錯(cuò)配的功能.越來越多的研究表明TDG不僅具有堿基切除修復(fù)的功能，而且還與人類的基因表達(dá)調(diào)控，CpG島甲基化，胚胎發(fā)育以及腫瘤的發(fā)生和治療密切相關(guān)[36,37].迄今為止，它已經(jīng)引起了學(xué)術(shù)界的廣泛關(guān)注，并取得了很多進(jìn)展.根據(jù)本文中的數(shù)據(jù)，在高劑量輻射組中，TDG/mug相關(guān)基因在響應(yīng)外部電離輻射壓力中起主要作用.

從低輻射土壤樣品中分離并鑒定了145株，這些菌株屬于30個(gè)屬，包括假單胞菌屬、芽孢桿菌屬、腸桿菌屬、關(guān)節(jié)桿菌屬、團(tuán)聚泛菌屬和微桿菌屬.假單胞菌屬物種數(shù)量最多，豐度最高，占31.0%.芽孢桿菌屬為11.0%，腸桿菌屬為10.3%.這些菌株因其具有良好的抗逆性，可作為潛在的高魯棒性底盤生物改造對象，應(yīng)用于工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)中.

目前，對于輻射背景下土壤微生物多樣性及其功能基因的響應(yīng)的研究，主要集中于高劑量輻射環(huán)境樣品的研究，如核試驗(yàn)場地核心區(qū)、高濃度鈾礦蒸發(fā)池、乏燃料存儲裝置等環(huán)境中.對于高于自然輻射背景50倍左右的低劑量輻射樣品研究報(bào)道很少[18?20].而此類低劑量輻射環(huán)境對于人類的醫(yī)療（如PET-CT檢查需要服用放射性核素18F-FDG葡萄糖等）、工業(yè)生產(chǎn)過程中可能遭受的輻射劑量更為接近，故本研究中MUG蛋白家族編碼基因的高響應(yīng)等結(jié)果也為相關(guān)輻射生物學(xué)研究提供了一些新證據(jù)，豐富了電離輻射對單細(xì)胞生物體影響的認(rèn)識.