壇紫菜HSP20基因家族成員的全基因組鑒定及生物信息學(xué)分析

張宛晨 朱靜 易樂(lè)飛

摘要：【目的】鑒定壇紫菜（Pyropia haitanensis）HSP20基因家族成員（PhHSP20s），并進(jìn)行生物信息學(xué)及表達(dá)譜分析，為揭示PhHSP20s基因在壇紫菜生長(zhǎng)發(fā)育和非生物脅迫下的調(diào)控機(jī)理提供理論依據(jù)。【方法】對(duì)壇紫菜基因組序列進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，利用隱馬爾可夫模型在壇紫菜蛋白序列中搜索含有ACD結(jié)構(gòu)域且分子量為12～43 kD的HSP20家族蛋白，并對(duì)其理化性質(zhì)、系統(tǒng)進(jìn)化及編碼基因啟動(dòng)子順式作用元件和表達(dá)特性進(jìn)行分析。【結(jié)果】從壇紫菜全基因組鑒定出8個(gè)PhHSP20s基因，其不均勻地分布在5條Scaffolds上，均只含有1個(gè)外顯子，無(wú)內(nèi)含子，開(kāi)放閱讀框（ORF）長(zhǎng)度為402～930 bp，其編碼蛋白的氨基酸殘基數(shù)量為133～309個(gè)，分子量為13.7～31.9 kD，理論等電點(diǎn)（pI）為5.50～10.49，多數(shù)蛋白呈酸性。系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果顯示，陸生植物（擬南芥）、紅藻（臍形紫菜和壇紫菜）和細(xì)菌（大腸桿菌）HSP20分別聚類為獨(dú)立的一支，但綠藻（萊茵衣藻）HSP20聚類為2個(gè)分支，分別與陸生植物和紅藻HSP20聚類在一起;紅藻（臍形紫菜和壇紫菜）HSP20蛋白高度相似，親緣關(guān)系近，可分為2個(gè)小分支，均與陸生植物HSP20的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，不屬于陸生植物中已報(bào)道過(guò)的任何HSP20亞族。PhHSP20s基因啟動(dòng)子上除了含有保守的通用元件外，還含有非生物脅迫響應(yīng)元件。在PhHSP20s基因中，除PhHSP32基因幾乎不在任何條件下表達(dá)外，其余PhHSP20s基因至少在1種條件下高表達(dá)，且部分PhHSP20s基因表現(xiàn)出相似的表達(dá)模式;部分PhHSP20s基因在不同生長(zhǎng)階段、光質(zhì)培養(yǎng)條件、失水脅迫和鹽脅迫下具有表達(dá)特異性，即在生殖細(xì)胞發(fā)育階段和單性生殖孢子發(fā)育期高表達(dá)，在低鹽脅迫下高表達(dá)。【結(jié)論】壇紫菜HSP20家族基因在基因數(shù)目、基因結(jié)構(gòu)及系統(tǒng)進(jìn)化上明顯不同于陸生植物HSP20家族基因，推測(cè)HSP20基因復(fù)制事件在紅藻和陸生植物分化之后獨(dú)立發(fā)生，且在壇紫菜生長(zhǎng)發(fā)育和非生物脅迫應(yīng)答中發(fā)揮作用。

關(guān)鍵詞： 壇紫菜;HSP20基因家族;系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化;表達(dá)譜;啟動(dòng)子;RNA-Seq

Abstract：【Objective】This paper aimed to identify HSP20 family members of Pyropia haitanensis（PhHSP20s），analyze their bioinformatic characteristics and expression profiles，and provide a theoretical basis for future exploring the function of PhHSP20s gene in development and biotic stress of P. haitanensis. 【Method】Gene structures of P. haitanensis genomic sequences were predicted. The HSP20 proteins containing ACD domain were scanned in the protein amino acid sequences of P. haitanensis and molecular weight was 12-43 kD with a hidden Markov model by HMMER. Their physicochemical properties，gene structures，phylogeny，cis-acting elements in promoter，and expression profiles were analyzed. 【Result】A total of 8 PhHSP20s genes were identified from the genome of P. haitanensis，which were unevenly distributed on 5 scaffolds. All 8 genes were composed of one exon and had no introns. The open reading frames（ORF） of PhHSP20s were 402-930 bp，encoding 133-309 amino acid residues， molecular weight was 13.7-31.9 kD with theoretical isoelectric points of 5.50-10.49.? Most proteins were acidic. The phylogenetic tree analysis showed that the land plant（Arabidopsis thaliana），red algae（Porphyra umbilicalis and P. haitanensis） and bacteria（Escherichia coli） HSP20s were clustered as an independent branch，respectively，but the green algae（Chlamydomonas reinhardtii） HSP20s were clustered as two branches，which were clustered with the land plant and red algae HSP20s，respectively.? The HSP20 proteins of red algae （P. umbilicalis and P. haitanensis） were highly similar and closely related，and could be divided into two small branches. The two branchesshowed a relatively distant relationship with terrestrial plants HSP20s，and were distinct from the HSP20 subgroups previously reported in terrestrial plants. The promoters of PhHSP20 genes contained both general cis-elements and abiotic stress response elements. Except for PhHSP32 gene，other PhHSP20s genes were highly expressed under at least one condition. Part of PhHSP20s genes showed similar expression patterns，and some of them had specific expression in different growth stages，light culture conditions，water loss stress and salt stress，that was，some PhHSP20s were highly expressed during reproductive cell development stage，parthenospore development stage，and under low salt stress. 【Conclusion】P. haitanensis HSP20 family genes are distinct from terrestrial plants HSP20 family genes in gene number， gene structure and phylogeny，indicating the HSP20 gene duplication events take place independently in the branches of red alga and terrestrial plants，and PhHSP20s are involved in both developmental regulation and abiotic stress response.

Key words： Pyropia haitanensis; HSP20 gene family; phylogeny evolution; expression profile; promoter; RNA-Seq

0 引言

【研究意義】壇紫菜（Pyropia haitanensis）是紅毛菜科（Bangiaceae）法紫菜屬（Pyropia）的一類大型海洋紅藻（Blouin et al.，2011），具有較高的營(yíng)養(yǎng)和藥用價(jià)值（張全斌等，2005），是我國(guó)重要的海水栽培藻類（Yang et al.，2017）。壇紫菜葉狀體生長(zhǎng)于潮間帶的中高潮區(qū)，每天的潮汐使其周期性經(jīng)歷低潮失水（干出）與高潮復(fù)水（覆水）的環(huán)境變化。干出時(shí)紫菜葉狀體常遭遇烈日或暴雨天氣，藻體面臨溫度、水分、高光和鹽脅迫，在覆水后又能迅速恢復(fù)正常生理和生長(zhǎng)（Davison and Pearson，1996;Blouin et al.，2011），說(shuō)明壇紫菜在長(zhǎng)期的自然選擇中演化出快速應(yīng)對(duì)突變極端環(huán)境的抗逆應(yīng)答能力（張晗晗，2016;陳天翔，2019）。這種抗逆能力促使壇紫菜成為了研究植物抗逆機(jī)制的理想材料。熱激蛋白（Heat shock protein，HSP）是生物體遭受環(huán)境脅迫時(shí)誘導(dǎo)產(chǎn)生的一類普遍且極為重要的保護(hù)性蛋白，其表達(dá)量與植物的逆境脅迫抗性呈正相關(guān)（Al-Whaibi，2011;楊誠(chéng)等，2018）。其中，HSP20（Heat shock protein 20）作為重要的分子伴侶，廣泛參與植物的發(fā)育調(diào)控及脅迫響應(yīng)（張寧和姜晶，2017）。因此，開(kāi)展壇紫菜HSP20基因家族成員的全基因組鑒定及其生物信息學(xué)和表達(dá)譜分析，不僅有利于揭示HSP20基因的調(diào)控機(jī)理，還能為壇紫菜的抗逆應(yīng)答研究提供理論依據(jù)。【前人研究進(jìn)展】面對(duì)環(huán)境逆境，植物在形態(tài)、生理和分子水平上采用多種機(jī)制來(lái)抵御逆境脅迫，如積累滲透調(diào)節(jié)分子、維持生物大分子和膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、清除活性氧自由基及表達(dá)抗逆基因等（楊獻(xiàn)光等，2006;劉鈴等，2018）。在抗逆基因表達(dá)的抗逆機(jī)制中，HSP的表達(dá)和積累是抗逆的關(guān)鍵環(huán)節(jié)（Al-Whaibi，2011;徐海等，2020），主要表現(xiàn)為在脅迫條件下，HSP參與穩(wěn)定蛋白結(jié)構(gòu)，防止蛋白凝聚、變性及修復(fù)受損傷蛋白，進(jìn)而增強(qiáng)植物對(duì)逆境的抵御能力（Al-Whaibi，2011;栗振義等，2016;Jacob et al.，2017）。HSP是一個(gè)龐大的基因家族，成員眾多，依據(jù)分子量的不同，可將其分成5個(gè)家族：HSP100、HSP90、HSP70、HSP60和小分子HSP（Gupta et al.，2010）。其中，HSP100在HSP70的輔助下能清除錯(cuò)誤折疊或變性的多肽;HSP90參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)和降解;HSP70能防止蛋白發(fā)生錯(cuò)誤折疊和聚集，輔助蛋白折疊;HSP60引導(dǎo)新生肽的折疊與再折疊;小分子HSP包括HSP40和HSP20，參與防止蛋白的大量聚集，促進(jìn)蛋白的正確折疊與轉(zhuǎn)運(yùn)（李廣隆等，2019）。這些HSP在高溫、冷害、干旱脅迫、鹽脅迫、高光脅迫、氧化脅迫及病原侵染等多種脅迫下參與維持植物細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)（Jacob et al.，2017）。其中，HSP20家族成員含量最豐富、分布最廣泛，不僅參與脅迫響應(yīng)，還參與植物正常的生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控過(guò)程（張寧和姜晶，2017）。在擬南芥（Arabidopsis thaliana）等模式生物中，HSP20的種類、結(jié)構(gòu)和功能已研究得較透徹（Al-Whaibi，2011）。已從擬南芥中鑒定出19個(gè)HSP20家族成員，13個(gè)位于細(xì)胞質(zhì)，6個(gè)位于細(xì)胞器（Scharf et al.，2001）。其中，HSP17.4和HSP17.6II基因受熱脅迫的誘導(dǎo)，并與HSP101基因共同保護(hù)翻譯因子（McLoughlin et al.，2001）;HSP17.4基因參與種子發(fā)育和干旱脅迫的耐受性（Wehmeyer and Vierling，2000）;HSP17.6A基因在熱脅迫、滲透脅迫及種子發(fā)育過(guò)程中被誘導(dǎo)過(guò)表達(dá)，以增強(qiáng)植株對(duì)鹽脅迫和干旱脅迫的耐受性（Sun et al.，2001）。相比之下，壇紫菜HSP基因家族僅有少量報(bào)道，從壇紫菜克隆獲得2個(gè)HSP90基因（代真真等，2014）、1個(gè)HSP40基因（陳玉婷等，2015）、1個(gè)HSP20基因（陳玉婷等，2015）和5個(gè)HSP70成員（Ji et al.，2015），且發(fā)現(xiàn)這些基因在部分脅迫誘導(dǎo)下高效表達(dá)，說(shuō)明HSP基因家族成員參與壇紫菜植株的抗逆應(yīng)答?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】雖然壇紫菜抗逆能力強(qiáng)，是研究植物抗逆機(jī)制的理想材料，但有關(guān)壇紫菜HSP20家族基因的研究相對(duì)較薄弱，鮮見(jiàn)針對(duì)壇紫菜HSP20家族成員數(shù)目、基因結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)進(jìn)化和表達(dá)譜進(jìn)行系統(tǒng)研究?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】采用生物信息學(xué)方法分析壇紫菜基因組的基因結(jié)構(gòu)，搜索含有ACD結(jié)構(gòu)域的HSP20蛋白，并對(duì)其理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)域、基因結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)進(jìn)化、啟動(dòng)子順式作用元件及表達(dá)特性進(jìn)行分析，為揭示HSP家族成員在壇紫菜發(fā)育調(diào)控和逆境應(yīng)答中的作用機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1. 1 數(shù)據(jù)來(lái)源

從NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov）下載壇紫菜全基因組數(shù)據(jù)（GCA_008729055.1）（Cao et al.，2020）及不同生長(zhǎng)階段和不同生長(zhǎng)環(huán)境下的壇紫菜RNA-Seq數(shù)據(jù)（GenBank登錄號(hào)為PRJNA572558、PRJNA566193、PRJNA283027、PRJNA510222、PRJNA428906、PRJNA386620和PRJNA503796）。

1. 2 HSP20基因家族成員鑒定

由于目前GenBank中尚缺乏相應(yīng)的基因組注釋信息和完整的蛋白序列，因此為了鑒定壇紫菜基因組中的HSP蛋白家族成員，首先須對(duì)壇紫菜基因組序列進(jìn)行注釋。使用EDTA分析流程找出基因組中轉(zhuǎn)座元件等重復(fù)序列，并在基因組中標(biāo)識(shí)出來(lái)（Ou et al.，2019），然后使用BRAKER2分析流程解析基因組，從中找出HSP20基因及其對(duì)應(yīng)的蛋白序列（Hoff et al.，2019）。為了增加BRAKER2解析的準(zhǔn)確性，利用不同生長(zhǎng)階段和不同生長(zhǎng)環(huán)境下的壇紫菜RNA-Seq數(shù)據(jù)及OrthoDB數(shù)據(jù)庫(kù)中所有紅藻的直系同源蛋白進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)信息解析（Kriventseva et al.，2019）。

獲得壇紫菜所有蛋白氨基酸序列后，首先使用隱馬爾可夫模型識(shí)別壇紫菜HSP20候選蛋白。以Pfam蛋白家族數(shù)據(jù)庫(kù)中HSP20的HMM Profile（PF00011）作為查詢序列（Punta et al.，2011），使用HMMER在壇紫菜的蛋白序列進(jìn)行搜索（Eddy，2011）。然后使用BLASTp以擬南芥HSP20蛋白序列為參考序列在壇紫菜的蛋白序列進(jìn)行搜索。從中篩選出E值≤1e-5的壇紫菜蛋白序列，去除冗余序列后，將蛋白序列提交至InterProScan進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析（Jones et al.，2014）。同時(shí)將蛋白序列提交至ExPASy（https：//web.expasy.org/compute_pi/）確定其分子量。將沒(méi)有ACD（α-crystallin domain）結(jié)構(gòu)域或分子量在12～43 kD范圍之外的蛋白序列剔除，剩余序列即判定為壇紫菜HSP20蛋白（PhHSP20s）。

1. 3 HSP20家族蛋白系統(tǒng)進(jìn)化分析

下載擬南芥、萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）、臍形紫菜（Porphyra umbilicalis）和大腸桿菌（Escherichia coli）的HSP20蛋白序列，結(jié)合鑒定出的PhHSP20s蛋白序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。其中，萊茵衣藻歸屬于綠藻，臍形紫菜歸屬于紅藻。采用Clustal Omega進(jìn)行多序列比對(duì)分析（Sievers et al.，2011），以FastTree的最大似然法（Maximum Likelihood）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)（Price et al.，2010），并進(jìn)行1000次的Bootstrap檢驗(yàn)。

1. 4 HSP20家族基因啟動(dòng)子順式作用元件分析

為了進(jìn)一步研究PhHSP20s基因在非生物脅迫反應(yīng)中的潛在調(diào)控機(jī)制，根據(jù)基因組注釋結(jié)果，提取PhHSP20s基因的上游1.5 kb序列，然后提交至PlantCARE在線網(wǎng)站，以分析PhHSP20s基因啟動(dòng)子的順式作用元件（Lescot et al.，2002）。

1. 5 HSP20家族基因表達(dá)分析

從GenBank中下載不同生長(zhǎng)階段和不同生長(zhǎng)環(huán)境下的壇紫菜Illumina RNA-Seq數(shù)據(jù)，以研究PhHSP20s基因的表達(dá)模式。首先使用STAR進(jìn)行有參比對(duì)（Dobin et al.，2013），獲得全部轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)量TPM值（Transcripts per million），然后提取PhHSP20s基因的表達(dá)量數(shù)據(jù)，并以log2進(jìn)行轉(zhuǎn)換，再使用MeV繪制聚類熱圖（Howe et al.，2011）。

2 結(jié)果與分析

2. 1 壇紫菜HSP20基因家族成員的鑒定結(jié)果

經(jīng)HMMER和BLASTp搜索初步得到9個(gè)壇紫菜HSP20家族候選蛋白，從中剔除無(wú)ACD結(jié)構(gòu)域或分子量在12～43 kD范圍之外的候選成員，最終鑒定出8個(gè)PhHSP20s蛋白，根據(jù)分子量對(duì)其對(duì)應(yīng)的編碼基因進(jìn)行命名，并綜合基因組注釋結(jié)果，提取PhHSP20s基因在基因組上的位置和內(nèi)含子數(shù)目，結(jié)果如表1所示。壇紫菜基因組包含194條Scaffolds，有8個(gè)PhHSP20s基因不均勻地分布在其中的5條Scaffolds上。其中，有3個(gè)PhHSP20s基因（PhHSP19-1、PhHSP 19-2和PhHSP26）分布在SDUX01000006.1（Super-Scaffold 27）上，且這3個(gè)PhHSP20s基因位于相鄰的基因間區(qū)域，具有成簇分布現(xiàn)象，推測(cè)串聯(lián)重復(fù)是PhHSP20s基因家族擴(kuò)展的因素之一。8個(gè)PhHSP20s基因的開(kāi)放閱讀框（ORF）長(zhǎng)度為402～930 bp，均只含有1個(gè)外顯子，無(wú)內(nèi)含子，其編碼蛋白的氨基酸殘基數(shù)量為133～309個(gè)，分子量為13.7～31.9 kD，理論等電點(diǎn)（pI）為5.50～10.49，除PhHSP14、PhHSP28和PhHSP32蛋白外，其余5個(gè)PhHSP20s蛋白的pI均小于7.00，說(shuō)明多數(shù)PhHSP20s蛋白為酸性。

2. 2 壇紫菜HSP20家族蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果

為了分析壇紫菜HSP20家族成員的親緣關(guān)系和明確藻類與其他生物HSP20的親緣關(guān)系，將8個(gè)PhHSP20s與5個(gè)臍形紫菜HSP20（PuHSP20s）、7個(gè)萊茵衣藻HSP20（CrHSP20s）、19個(gè)擬南芥HSP20（At-HSP20s）和2個(gè)大腸桿菌HSP20（E.coliHSP20s）蛋白的氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果（圖1）顯示大部分HSP20蛋白按物種分類地位聚類在一起，即陸生植物（擬南芥）、紅藻（臍形紫菜和壇紫菜）和細(xì)菌（大腸桿菌）HSP20分別聚類為獨(dú)立的一支，綠藻（萊茵衣藻）HSP20未聚類為獨(dú)立的一支，而是聚類為2個(gè)分支，分別與陸生植物和紅藻的HSP20聚類在一起;紅藻HSP20蛋白（PhHSP20s和PuHSP20s）高度相似，親緣關(guān)系最近，可分為2個(gè)小分支，每個(gè)小分支均含有PhHSP20s和PuHSP20s蛋白。PhHSP20s和PuHSP20s均與陸生植物HSP20的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，二者不屬于陸生植物中已報(bào)道過(guò)的任何HSP20亞族，故推測(cè)PhHSP20s和PuHSP20s構(gòu)成HSP20家族的新亞族，其三維結(jié)構(gòu)和功能尚待深入研究。

2. 3 HSP20家族基因啟動(dòng)子順式作用元件分析結(jié)果

為了明確PhHSP20s基因潛在的調(diào)控機(jī)理，將其上游的1.5 kb序列提交至PlantCARE網(wǎng)站進(jìn)行啟動(dòng)子順式作用元件分析，結(jié)果顯示，PhHSP20s基因啟動(dòng)子均含有CAAT-box、GC-motif和Sp1等通用作用元件。除這些通用作用元件外，PhHSP20s基因啟動(dòng)子區(qū)還含有一些非生物脅迫響應(yīng)元件，如表2所示。所有PhHSP20s基因啟動(dòng)子均含有ABRE（脫落酸響應(yīng)元件）、STRE（脅迫響應(yīng)元件）和WRE3（損傷和防御響應(yīng)元件），且大多數(shù)PhHSP20s基因啟動(dòng)子還含有DRE（干旱響應(yīng)元件）、G-box（光調(diào)控元件）和MYB（MYB結(jié)合元件），表明PhHSP20s基因在壇紫菜生長(zhǎng)發(fā)育和環(huán)境脅迫響應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

2. 4 壇紫菜HSP20家族基因的表達(dá)譜分析結(jié)果

基于RNA-Seq數(shù)據(jù)，用Mev繪制8個(gè)PhHSP20s基因在不同發(fā)育階段、光質(zhì)培養(yǎng)條件、失水脅迫和鹽脅迫下的表達(dá)熱圖（圖2）。除PhHSP32基因幾乎在任何條件下均不表達(dá)外，其余的PhHSP20s基因至少在1種條件下高表達(dá)，且部分PhHSP20s基因表現(xiàn)出相似的表達(dá)模式。PhHSP19-2、PhHSP32、PhHSP14和PhHSP21基因在不同發(fā)育階段的表達(dá)水平均較低，且無(wú)明顯差異，PhHSP26、PhHSP28、PhHSP19-1和PhHSP16基因在生殖細(xì)胞發(fā)育階段和單性生殖孢子發(fā)育期的表達(dá)水平較高（圖2-A）。除PhHSP16和PhHSP19-1基因在紅光下高表達(dá)外，不同光質(zhì)對(duì)其余PhHSP20s基因表達(dá)無(wú)明顯影響（圖2-B）。除PhHSP32基因外，其余PhHSP20s基因在失水脅迫下的表達(dá)量均降低，復(fù)水后其表達(dá)水平恢復(fù)至脅迫前水平（圖2-C）。此外，除PhHSP32基因外，其余PhHSP20s基因在低鹽脅迫下高表達(dá)，而在高鹽脅迫下低表達(dá)（圖2-D）。綜上所述，PhHSP20s基因參與壇紫菜的生長(zhǎng)發(fā)育和非生物脅迫應(yīng)答過(guò)程。

3 討論

HSP20是一個(gè)古老蛋白家族，廣泛分布于從細(xì)菌到高等動(dòng)植物的絕大多數(shù)生物中，且成員眾多。盡管遠(yuǎn)緣物種間HSP20蛋白序列及分子量（12～42 kD）差異明顯，但均含有保守結(jié)構(gòu)域ACD（張寧和姜晶，2017）。這些保守特征可用于不同物種HSP20家族新成員的鑒定，已從擬南芥中鑒定出19個(gè)成員（Scharf et al.，2001），從水稻（Oryza sativa）中鑒定出39個(gè)成員（Ouyang et al.，2009），從馬鈴薯（Solanum tuberosum）中鑒定出48個(gè)成員（Zhao et al.，2018）。本研究利用HSP20保守特征和高靈敏度的隱馬爾可夫模型，從壇紫菜基因組中鑒定出8個(gè)PhHSP20s基因，明顯少于上述陸生植物的HSP20基因家族成員數(shù)量。導(dǎo)致壇紫菜HSP20基因家族成員數(shù)量較少的原因可能是：（1）壇紫菜配子體有5條染色體（嚴(yán)興洪等，2008），但組裝出來(lái)的壇紫菜基因組有194條Scaffolds（Cao et al.，2020），即壇紫菜基因組組裝不完整性，導(dǎo)致少量HSP20基因家族成員遺漏;（2）與壇紫菜的進(jìn)化地位有關(guān)，通常生物越低等，其基因家族成員數(shù)量越少（Waters and Vierling，2020）。類似的現(xiàn)象在條斑紫菜（Pyropia yezoensis）、臍形紫菜、萊茵衣藻和溫泉紅藻（Cyanidioschyzon merolae）等藻類中也有發(fā)現(xiàn)，進(jìn)一步證明其HSP20基因家族成員數(shù)量明顯少于陸生植物的HSP20基因家族成員數(shù)量（Schroda，2004;Uji et al.，2019;Waters and Vierling，2020）?？梢?jiàn)，壇紫菜HSP20基因家族成員數(shù)量與其進(jìn)化地位相一致。

大量研究表明，陸生植物HSP20基因家族成員至少可劃分為11個(gè)亞族，且不同陸生植物的同一亞族HSP20在系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)上形成單系群，同一陸生植物的不同亞族HSP20在系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)上形成旁系群，暗示不同物種同一亞族HSP20成員的親緣關(guān)系較同一物種不同亞族HSP20成員的親緣關(guān)系更近（Ouyang et al.，2009;張寧和姜晶，2017;Zhao et al.，2018;何福林和張斌，2019）。本研究也發(fā)現(xiàn)，紅藻HSP20蛋白可分成2個(gè)分支，不同紅藻同一分支HSP20蛋白的親緣關(guān)系比同一紅藻不同分支HSP20蛋白的親緣關(guān)系更近。推測(cè)這2個(gè)分支的紅藻HSP20蛋白不同于陸生植物HSP20亞族成員，與Uji等（2019）的研究結(jié)果一致，其原因可能是紅藻HSP20基因復(fù)制事件發(fā)生在紅藻與陸生植物分化事件之后，即HSP20基因復(fù)制事件獨(dú)立地發(fā)生于陸生植物早期祖先和紅藻早期祖先，且陸生植物早期祖先發(fā)生了更多次數(shù)的HSP20基因復(fù)制事件（Waters and Vierling，2020）。

HSP20是一類重要的蛋白，不僅參與脅迫響應(yīng)，還參與植物正常的發(fā)育調(diào)控過(guò)程（張寧和姜晶，2017;李廣隆等，2019）。為了預(yù)測(cè)壇紫菜HSP20家族基因可能參與的生物學(xué)過(guò)程，本研究分析PhHSP20s基因啟動(dòng)子的順式作用元件，結(jié)果顯示8個(gè)PhHSP20s基因啟動(dòng)子不僅含有保守的通用元件，還含有非生物脅迫響應(yīng)元件，但不同啟動(dòng)子上所含元件不盡相同，說(shuō)明PhHSP20s基因參與的生物學(xué)過(guò)程既有重疊又有區(qū)分。此外，本研究通過(guò)序列比對(duì)和表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)，雖然PhHSP19-1和PhHSP19-2基因的核苷酸序列高度相似，且在基因組上緊密串聯(lián)排列，但二者在不同生長(zhǎng)階段和非生物脅迫下表達(dá)水平差異明顯，其原因可能是二者啟動(dòng)子所含的順式作用元件存在差異所致。

盡管大量研究證實(shí)，HSP20廣泛參與生物的脅迫響應(yīng)過(guò)程，但本研究發(fā)現(xiàn)PhHSP20s基因在高鹽脅迫和失水脅迫下呈下調(diào)表達(dá)或表達(dá)水平不變。類似的現(xiàn)象在番茄（Solanum lycopersicum）中也有發(fā)現(xiàn)，即在高鹽和干旱脅迫下多數(shù)番茄HSP20基因（Sl-HSP20s）下調(diào)表達(dá)（俞佳虹，2017）。在高鹽脅迫和失水脅迫下PhHSP20s基因下調(diào)表達(dá)，推測(cè)壇紫菜還具備其他的防御應(yīng)答機(jī)制，比如隱生（Cryptobiosis）（周向紅等，2013）等?？梢?jiàn)，壇紫菜防御應(yīng)答機(jī)理十分復(fù)雜，具體機(jī)理尚有待進(jìn)一步探究。

4 結(jié)論

壇紫菜HSP20家族基因在基因數(shù)目、基因結(jié)構(gòu)及系統(tǒng)進(jìn)化上明顯不同于陸生植物，推測(cè)HSP20基因復(fù)制事件在紅藻和陸生植物分化之后獨(dú)立發(fā)生，且在壇紫菜生長(zhǎng)發(fā)育和非生物脅迫應(yīng)答中發(fā)揮作用。

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（責(zé)任編輯 陳 燕）