NPC人群VMAT治療前后鼻咽部菌群多樣性變化

張靜 李鵬 黃杰 黃靜

[摘要]?目的 探討鼻咽癌（NPC）人群行容積弧形動態(tài)調(diào)強(qiáng)放射治療（VMAT）前后鼻咽部菌群多樣性變化情況。方法 選擇武漢市普仁醫(yī)院2016年3月—2019年7月間收治的117例病人作為觀察組，均采用VMAT方案治療，以50例行普通放療方案治療的NPC病人為對照組。治療前后采集兩組鼻咽部樣本，使用ABI 3100型遺傳分析儀對樣本進(jìn)行測序，分析治療前后鼻咽部細(xì)菌菌群的變化。結(jié)果 病人采用VMAT治療過程中其器官受輻射劑量基本符合各部位限制劑量。觀察組病人共得到139種不同T-RFs片段，治療前共94種，治療后45種;對照組病人共得到110種不同T-RFs片段，治療前89種，治療后21種。兩組病人鼻咽部菌群多樣性指數(shù)均為治療前D最高、H最低，治療后E和D較高、H最低。與治療前相比較，觀察組治療后E明顯升高（t=17.675，P<0.001），對照組治療后E和D明顯降低（t=18.592、24.707，P<0.001）。觀察組治療后E和D較對照組明顯升高（t=13.293、58.657，P<0.001）。兩組治療前后E和D的差值比較，差異有顯著性（t=58.135、121.766，P<0.001）。觀察組放療前后T-RFLP圖譜樣品間相似性系數(shù)為0.57。照射部位（OR=2.020，95%CI=1.284～3.176）和VMAT（OR=1.982，95%CI=1.308～3.003）均是影響病人鼻咽部細(xì)菌菌群多樣性的獨立性影響因素（P<0.05），其中照射位置正常病人的細(xì)菌多樣性是非正常者的2.02倍，采用VMAT照射病人的細(xì)菌多樣性是常規(guī)照射的1.982倍。結(jié)論 經(jīng)VMAT治療后NPC病人鼻咽部菌群多樣性出現(xiàn)顯著改變且菌群多樣性明顯升高。

[關(guān)鍵詞]?鼻咽癌;放射療法，調(diào)強(qiáng)適形;菌群多樣性;基因檢測

[中圖分類號]?R739.63;R815

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]?A

[文章編號]?2096-5532（2021）04-0581-05

鼻咽癌（NPC）是臨床常見的鼻咽部惡性腫瘤，多發(fā)于我國華南地區(qū)[1]。目前，放射療法是臨床治療NPC的首選方法。然而，放療會引發(fā)口腔念珠菌感染、潰瘍性黏膜炎、牙齦炎及放射性中耳炎等多種并發(fā)癥[2]。有報道指出，這些并發(fā)癥的產(chǎn)生和放療導(dǎo)致病人鼻咽部細(xì)菌菌群發(fā)生改變密切相關(guān)[3]。在放療方法中，調(diào)強(qiáng)放療應(yīng)用最為廣泛，其中容積弧形動態(tài)調(diào)強(qiáng)放射治療（VMAT）具有可變機(jī)架轉(zhuǎn)速、運動精準(zhǔn)快速及可變劑量率的多葉準(zhǔn)直器等功能，可以在治療過程中連續(xù)旋轉(zhuǎn)而被逐漸應(yīng)用于NPC的治療[4]。然而，對VMAT治療后病人鼻咽部細(xì)菌菌群變化則鮮有研究報道[5]。此外，雖然放療方案對病人鼻咽部菌群結(jié)構(gòu)產(chǎn)生明顯影響，而菌群多樣性是評估菌群結(jié)構(gòu)的重要指標(biāo)之一，但放療方案對菌群多樣性的影響仍鮮有報道[6-8]。本研究對NPC人群采用VMAT進(jìn)行治療，觀察治療前后病人鼻咽部細(xì)菌菌群變化，從而探討VMAT與鼻咽部微生物構(gòu)成及變化之間的關(guān)系，旨在為NPC放療效果的改善及并發(fā)癥的降低提供依據(jù)。

1?資料與方法

1.1?對象與分組

經(jīng)武漢市普仁醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，將該院2016年3月—2019年7月間收治的符合入組及排除標(biāo)準(zhǔn)的117例病人作為觀察組，其中男63例、女54例，年齡19～72（41.28±6.74）歲。依照AJCC第8版分期標(biāo)準(zhǔn)[9]：T2N1M0期72例，T3N2M0期45例。VMAT治療周期6～7周，放療劑量68.40～74.00 Gy/30～33 f。入組標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理學(xué)檢查確診為NPC;②均接受VMAT治療方案;③無嚴(yán)重營養(yǎng)不良;④KPS評分均>90分;④對本研究知情并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并免疫系統(tǒng)功能異常;②入組前1個月內(nèi)有益生菌、抗生素、微生態(tài)活菌、益生元等服用史;③心肝腎等臟器功能異?；蚱髻|(zhì)性疾病;④合并嚴(yán)重營養(yǎng)不良;⑤存有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移病灶;⑥主動申請退出本研究。選取50例行普通放療方案治療的NPC病人作為對照組，其中男28例，女22例，年齡20～73（42.01±7.13）歲。T2N1M0期31例，T3N2M0期19例。

1.2?VMAT方法

觀察組病人均采取仰臥位并用熱塑膜固定頭頸肩。采用Elekta 16排螺旋CT進(jìn)行定位，勾畫包括鼻咽部大體腫瘤區(qū)（GTV）、高危臨床靶區(qū)（CTV1）、低危臨床靶區(qū)（CTV2）以及陽性淋巴結(jié)區(qū)（GTVnd）等靶區(qū)。各靶區(qū)均向外拓展5 mm。危及器官主要有腦干、垂體、脊髓、視神經(jīng)、視交叉、晶體以及腮腺等。其中GTV處方劑量為70 Gy，CTV1為60 Gy，CTV2為54 Gy，GTVnd為66 Gy。采用Monaco計劃系統(tǒng)（Elekta公司）對病人進(jìn)行VMAT計劃。對照組病人采用常規(guī)放療方案治療，先在前后頸切線照射36～40 Gy，后垂直兩側(cè)頸垂直照射，參與病灶追加10～20 Gy，分段治療，中間休息4周，每周照射5次，每次2 Gy。

1.3?樣本采集及處理方法

本研究中在所有病人放射治療前及治療結(jié)束1周后采用滅菌鼻咽拭子加套管采集鼻咽部樣本，避免鼻腔污染，保證采集樣本可靠性以真實反映局部細(xì)菌群落情況。使用核酸提取試劑盒并結(jié)合超聲破碎法及溶菌酶裂解法提取DNA。利用1492R和8F引物對16SrRNA基因可變區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，反向引物1492R（5′-GYTACCTTGTTACGACTT-3′）使用CY2熒光標(biāo)記，正向引物8F（5′-AGAGTTTGATCCTG-GCTCAG-3′）使用FAMTM熒光標(biāo)記。依照試劑盒說明書方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使用瓊脂糖凝膠純化并回收16SrRNA特異性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。以HhaⅠ/MspⅠ限制性內(nèi)切酶對純化后產(chǎn)物進(jìn)行酶切處理，采用ABI 3100型遺傳分析儀對酶切產(chǎn)物進(jìn)行測序，取50 RFU熒光強(qiáng)度作為基線，使用GeneScan Version 3.7軟件對T-RFLP圖譜進(jìn)行分析。

1.4?統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 21.0數(shù)理統(tǒng)計軟件包行統(tǒng)計學(xué)分析。采用Forward模式行Logistics回歸模型分析VMAT治療與病人鼻咽部細(xì)菌菌群多樣性的相關(guān)性。采用BIO-DAP程序分析相似性系數(shù)并計算菌群結(jié)構(gòu)多樣性參數(shù)，包括均勻度指數(shù)（E）、香農(nóng)指數(shù)（H）、辛普森指數(shù)（D）等。計量數(shù)據(jù)以X2±s表示，同一組內(nèi)治療前后比較采用配對t檢驗，組間治療前后差值比較采取成組t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2?結(jié)?果

2.1?觀察組病人器官劑量調(diào)查

調(diào)查結(jié)果顯示，觀察組病人采用VMAT治療過程中其器官受輻射劑量基本符合各部位限制劑量。見表1。

2.2?兩組鼻咽部菌群多樣性指數(shù)檢測

治療前后鼻咽部菌群調(diào)查結(jié)果顯示，觀察組病人共得到139種不同T-RFs片段，治療前共94種，治療后45種，且治療前鼻咽部菌群多樣性指數(shù)以D最高，H最低。對照組病人共得到110種不同T-RFs片段，治療前89種，治療后21種。治療前兩組病人T-RFs數(shù)量比較，差異無顯著性（P>0.05）。與治療前相比較，觀察組治療后E明顯升高（t=17.675，P<0.001），對照組治療后E和D明顯降低（t=18.592、24.707，P<0.001）。觀察組治療后E和D較對照組明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t=13.293、58.657，P<0.001）。兩組治療前后E和D的差值比較，差異具有顯著性（t=58.135、121.766，P<0.001）。見表2。

2.3?T-RFLP圖譜樣品間相似性系數(shù)比較

本文研究結(jié)果顯示，觀察組放射治療前后T-RFLP圖譜樣品間相似性系數(shù)為0.57，對照組為0.22，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=8.494，P<0.05）。

2.4?VMAT治療與病人鼻咽部細(xì)菌菌群多樣性的相關(guān)性

采用Forword模式進(jìn)行變量分析和篩選顯示，病人治療時的照射部位及采用VMAT計劃均是影響鼻咽部細(xì)菌菌群多樣性的獨立性影響因素（χ2=9.262、10.410，P<0.05），照射位置正常病人的細(xì)菌多樣性是非正常的2.02倍，采用VMAT照射病人的細(xì)菌多樣性是常規(guī)照射的1.982倍。見表3、4。

3?討?論

NPC是臨床常見的惡性腫瘤之一，其多發(fā)于鼻咽腔頂和側(cè)壁，發(fā)病率位于耳鼻咽喉腫瘤之首[10-11]。NPC的發(fā)病因素主要包括遺傳、病毒感染以及環(huán)境等，主要臨床癥狀有鼻塞、聽力下降、視力障礙、頭痛等[12]。因NPC對放射治療較為敏感，因此放射治療成為NPC的首選療法。目前臨床常用的放療手段有腔內(nèi)近距離放療、伽瑪?shù)斗暖?、三維適形放療等，其中適形調(diào)強(qiáng)放療因其療效顯著而被廣泛應(yīng)用于NPC的治療，其可以在殺死癌細(xì)胞的同時，保護(hù)周圍組織而減少并發(fā)癥的發(fā)生[13-15]。然而，在常規(guī)的靜態(tài)調(diào)強(qiáng)放療過程中，病人體位會發(fā)生改變，導(dǎo)致治療時間延長而影響最終治療效果[16-17]。VMAT具有可變機(jī)架轉(zhuǎn)速、運動精準(zhǔn)快速及可變劑量率的多葉準(zhǔn)直器等功能，以其在病人周圍旋轉(zhuǎn)的錐形束射線來實現(xiàn)放射治療，因而不受病人體位改變的影響，且其劑量率、機(jī)架轉(zhuǎn)速和子野形狀可以根據(jù)臨床實際需求進(jìn)行改變，從而可以更好地保護(hù)病人腦干、脊髓等重要器官[18-19]。放療后照射區(qū)域的鏈球菌屬、葡萄球菌屬、白色念珠菌和綠膿桿菌等檢出增加，而放線菌屬和奈瑟菌屬檢出減少。

雖然放射治療可以有效殺死腫瘤細(xì)胞，但同時會對周圍組織造成創(chuàng)傷而出現(xiàn)不良反應(yīng)[20-22]。常見的放療后并發(fā)癥有中耳炎、口腔黏膜反應(yīng)、骨髓抑制、放射性皮炎以及惡心嘔吐等[23-24]。雖然有多篇文獻(xiàn)報道，給予病人恰當(dāng)?shù)淖o(hù)理可有效降低并發(fā)癥的發(fā)生概率，但是無法從根本上預(yù)防并發(fā)癥的發(fā)生[25-27]。有研究表明，在放射治療過程中病人鼻咽部細(xì)菌菌群生長會發(fā)生改變，此時持續(xù)照射會加劇局部炎癥反應(yīng)從而導(dǎo)致并發(fā)癥的發(fā)生[28-29]。

本文研究結(jié)果顯示，病人采用VMAT治療過程中其器官受輻射劑量基本符合各部位限制劑量。觀察組病人共得到139種不同T-RFs片段，治療前共94種，治療后45種，且治療前鼻咽部菌群多樣性指數(shù)以D最高，H最低，放療治療前后T-RFLP圖譜樣品間相似性系數(shù)為0.57。本文研究結(jié)果還顯示，NPC病人在治療前其鼻咽部菌群結(jié)構(gòu)相對較為復(fù)雜，且菌群多樣性高、菌群種類豐富，物種優(yōu)勢大。病人采用放射治療后其鼻咽部菌群會出現(xiàn)明顯改變。研究顯示，相較于傳統(tǒng)放療方案，采用VMAT方案對病人進(jìn)行干預(yù)后可改善T淋巴細(xì)胞和吞噬細(xì)胞數(shù)量，有效避免病人全身抵抗力降低[30]。本文結(jié)果還顯示，照射位置正常病人的細(xì)菌多樣性是非正常的2.02倍，采用VMAT照射病人的細(xì)菌多樣性是常規(guī)照射的1.982倍;觀察組放射治療前后T-RFLP圖譜樣品間相似性系數(shù)為0.57，對照組為0.22。其原因可能為采用VMAT對NPC病人干預(yù)，可降低黏膜機(jī)械保護(hù)功能損傷和咽部物理屏障損害，避免厭氧菌的生長定植，改善菌群多樣性[31]。

本研究觀察NPC人群采用VMAT治療前后鼻咽部細(xì)菌菌群變化結(jié)果表明，經(jīng)VMAT治療后NPC病人鼻咽部細(xì)菌菌群出現(xiàn)顯著改變。有研究結(jié)果顯示，放療會改變NPC病人口腔菌群結(jié)構(gòu)和數(shù)量，且會損傷腮腺，放療造成菌落結(jié)構(gòu)改變、優(yōu)勢菌豐度變化與放療后并發(fā)癥的發(fā)生密切相關(guān)[32-33]。本研究結(jié)果表明，NPC病人行VMAT后鼻咽部細(xì)菌菌群總數(shù)減少，菌群多樣性降低。且照射部位及VMAT均是影響病人鼻咽部細(xì)菌菌群多樣性的獨立性影響因素。本文結(jié)果為VMAT的臨床應(yīng)用提供了數(shù)據(jù)支持。然而，本研究也存在如下不足之處：①本研究僅對病人鼻咽部進(jìn)行取樣來觀察細(xì)菌菌群的變化，沒有搜集牙齒菌斑及唾液，其樣本來源比較單一，研究結(jié)果僅能客觀反映鼻咽部的菌群變化;②本研究主要采用T-RFLP技術(shù)分析菌落結(jié)構(gòu)變化及多樣性特點，而不能實現(xiàn)菌屬的定性;③本研究并未對病人治療過程中的菌群變化情況進(jìn)行動態(tài)監(jiān)測，且為前期探索，樣本量較少，不具有廣泛代表性，且結(jié)果可能因為小樣本出現(xiàn)偏差。今后將擴(kuò)大樣本的種類與數(shù)量，并采用多樣化分析檢測技術(shù)對放療前后NPC病人細(xì)菌菌群變化進(jìn)行探索，深入全面地揭示放射與細(xì)菌菌群之間的關(guān)系，為減少NPC放射治療并發(fā)癥、提高治療效果提供依據(jù)。

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（本文編輯?于國藝）