還原型和氧化型谷胱甘肽在化妝品領(lǐng)域的應(yīng)用比較研究

王婷　鄭云云　查建生　童莉

本文簡要介紹了還原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽在化妝品領(lǐng)域應(yīng)用的聯(lián)系，以及在清除自由基抗氧化性能和抑制酪氨酸酶美白性能方面的具體差異。

谷胱甘肽（Glutathione）是一種普遍存在于動物、植物和部分細菌體內(nèi)的抗氧化劑，能夠清除活性氧自由基，阻止脂質(zhì)過氧化，同時幫助代謝過氧化物和重金屬，防止有害物質(zhì)對細胞以及DNA造成損傷，因此被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品和化妝品等領(lǐng)域。

01谷胱甘肽結(jié)構(gòu)上屬于三肽，由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸構(gòu)成：首先，由L-谷氨酸和半胱氨酸合成γ-谷氨酰半胱氨酸，這個轉(zhuǎn)化需要谷氨酸-半胱氨酸酶（glutamate-cysteine ligase，GCL）的參與，這一步反應(yīng)是谷胱甘肽合成中的限速步驟;其次，被加入的甘氨酸和γ-谷氨酰半胱氨酸的羧基端進一步在谷胱甘肽合成酶（Glutathione synthetase）的催化作用下縮合。分子中的半胱氨酸的巰基是谷胱甘肽的主要功能基團。

人體中的谷胱甘肽有兩種形式，還原型態(tài)（Reduced GSH）和氧化型態(tài)（Oxidized GSSG），分別如圖1、圖2所示。

02還原型的谷胱甘肽和氧化型的谷胱甘肽在細胞中的比例，是測試細胞氧化應(yīng)激水平的一個重要指標，GSSG與GSH的比值越高表示細胞氧化程度比較高。在正常的細胞和組織中，大于90%的谷胱甘肽都是還原型的，剩下的才是氧化型的谷胱甘肽的二硫化物GSSG。在還原型的狀態(tài)下，谷胱甘肽中半胱氨酸的巰基是重要的還原基團，是主要起抗氧化作用的基團，而GSSG則在還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate，NADPH）的作用下，被轉(zhuǎn)化成還原型的GSH進而才能起到還原和抗氧化的作用：NADPH+GSSG+H₂O→2 GSH+NADP⁺+OH^-。

金春英等報道過適量的GSSG可協(xié)同催化GSH清除1，1-二苯基-2-苦肼基（DPPH·）自由基，因為GSH和DPPH·發(fā)生給電子作用后，本身氧化生成GS·自由基（GSH+DPPH·≒GS·+H++DPPH），由于GS·在水中具有較強的反應(yīng)活性，因此與水中的GSSG進一步發(fā)生氧化還原反應(yīng)，生成GSH和GS-OH（2GS·+2H₂O+GSSG→2GSH+2GS-OH），最終GSSG在谷胱甘肽池中還是依靠轉(zhuǎn)化成GSH起效，但是該研究并未探究單獨的GSSG是否對DPPH·自由基具有清除作用。

03目前的化妝品領(lǐng)域，氧化型谷胱甘肽GSSG由于氣味相較還原型谷胱甘肽GSH略淡，因而也被廣泛使用。但從結(jié)構(gòu)上來說，氧化型的谷胱甘肽中活性基團-硫醇（-SH）已經(jīng)被轉(zhuǎn)化為二硫鍵，理論上還原能力應(yīng)當(dāng)有所下降，因此有必要比較還原型和氧化型谷胱甘肽在化妝品應(yīng)用一抗氧化性能方面的區(qū)別。可以從對不同自由基的清除作用的角度，定量探討還原型和氧化型谷胱甘肽清除自由基（抗氧化性能）的差異，且由于谷胱甘肽具備還原能力，而黑色素則是通過一系列酶促氧化反應(yīng)而形成。因此GSH能在黑色素形成的過程中，還原已經(jīng)被氧化的多巴醌，轉(zhuǎn)化為谷胱甘肽多巴，進而生成顏色更淺的褐黑素而不是真黑素，如圖3所示，從而具備美白效果。因此有必要比較還原型和氧化型谷胱甘肽在美白方面的差異。

04實驗

4.1還原型谷胱甘肽（GSSG）和氧化型谷胱甘肽（GSH）對三種不同自由基的清除實驗

4.1.1對1，1-二苯基-2-三硝基苯阱（DPPH·）自由基清除實驗

實驗試劑：還原型谷胱甘肽（98%，南京斯拜科生化實業(yè)有限公司）、氧化型谷胱甘肽（98%，南京斯拜科生化實業(yè)有限公司）、無水乙醇（南京科貝化學(xué)技術(shù)有限公司，分析純）、DPPH（北京索萊寶科技有限公司）。儀器耗材：紫外分光光度計、比色皿、移液器、試管、容量瓶、電子分析天平。

試劑配制：準確稱取DPPH粉末3mg，用無水乙醇溶解，并定容至50mL容量瓶。

實驗步驟：在試管中分別依次加入1mL DPPH溶液和0.5mL不同濃度的待測樣品，混勻后于黑暗處放置60min，將上述溶液轉(zhuǎn)移至比色皿中，以無水乙醇為基準（調(diào)零）在517nm波長處測吸光值，吸光值記為A₁;空白對照：在試管中分別依次加入1mL無水乙醇和0.5mL不同濃度的待測樣品，黑暗處放置60 min，將上述溶液轉(zhuǎn)移至比色皿中，以無水乙醇為基準（調(diào)零）在517nm波長處測吸光值，吸光值記為A₂;控制組：在試管中加入1mL DPPH溶液和0.5mL無水乙醇，混勻后黑暗處放置60 min，將上述溶液轉(zhuǎn)移至比色皿中，以無水乙醇為基準（調(diào)零）在517nm波長處測吸光值，吸光值記為An。根據(jù)以下自由基清除率公式計算（K）：K（%）=[1-（A₁-A₂）/A₀]X100%試驗重復(fù)三次，取其平均值作為最后結(jié)果。

4.1.2對羥自由基（HO·）清除實驗

實驗試劑：還原型谷胱甘肽（98%，南京斯拜科生化實業(yè)有限公司）、氧化型谷胱甘肽（98%，南京斯拜科生化實業(yè)有限公司）、磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）（北京索萊寶科技有限公司）、硫酸亞鐵銨（國藥集團）、鄰二氮菲（國藥集團）、0.1%雙氧水溶液（國藥集團）、雙蒸水（ddH₂O）。

儀器耗材：紫外分光光度計、比色皿、移液器、水浴鍋、試管、容量瓶、電子分析天平。

試劑配制：鄰二氮菲溶液，用少量乙醇溶解0.148g鄰二氮菲，再用雙蒸水定容至100mL容量瓶。硫酸亞鐵銨溶液，取0.2941g硫酸亞鐵銨，用雙蒸水定容至100mL容量瓶。

所有試管依次加入表1中的試劑（雙氧水最后一步加入），置于37℃水浴反應(yīng)1h，以1號試管溶液為基準（調(diào)零），在536nm波長下分別測定2、3、4、5號試管溶液的吸光度。每次實驗做三次平行，結(jié)果取平均值。

實驗試劑：還原型谷胱甘肽（98%，南京斯拜科生化實業(yè)有限公司）、氧化型谷胱甘肽（98%，南京斯拜科生化實業(yè)有限公司）、鄰苯三酚（南京試劑，分析純）、鹽酸（國藥集團，分析純）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）（國藥集團）。

儀器耗材：紫外分光光度計、試管、移液器、比色皿、容量瓶、電子分析天平、水浴鍋。

試劑配制：鄰苯三酚溶液，準確稱取鄰苯三酚315.275mg，用10mmol/L HCl溶解，并定容至100 mL棕色容量瓶中。Tris-HCl緩沖液，準確稱取Tris 6.057g，蒸餾水溶解后用鹽酸調(diào)節(jié)pH至8.2，定容至1000m L。

實驗步驟：取4.5mL Tris-HCl緩;中液于試管中，25℃水浴預(yù)熱20min后，加入0.5mL不同濃度待測樣品和0.5mL鄰苯三酚溶液，混勻，25℃水浴反應(yīng)5min后，立即加入1001μL 8mol/L HCl來終止反應(yīng)，最后測定反應(yīng)液在335nm處的吸光度。

式中：An為不加樣品（用蒸餾水代替樣品）的反應(yīng)液吸光度;A.為加入樣品和鄰苯三酚的反應(yīng)液吸光度;A_j為加入樣品，不加鄰苯三酚（用蒸餾水代替鄰苯三酚）的反應(yīng)液吸光度。

4.2還原型谷胱甘肽（GSSG）和氧化型谷胱甘肽（GSH）對酪氨酸酶的抑制作用

實驗試劑：還原型谷胱甘肽（98%，南京斯拜科生化實業(yè)有限公司）、氧化型谷胱甘肽（98%，南京斯拜科生化實業(yè)有限公司）、磷酸緩沖液（Phosphate Buffer，PB）（國藥集團）、（蘑菇）酪氨酸酶（生工生物工程上海股份有限公司）、L-左旋多巴（生工生物工程上海股份有限公司）。

儀器耗材：酶標儀（ELx808）、移液器、96孔板、水浴鍋、電子分析天平。

試劑配制：L-左旋多巴標準溶液，稱取L-左旋多巴9.85mg，溶于10mL的PB中。酪氨酸酶溶液，稱取酪氨酸酶1.72mg;，溶于10mL PB中。

用移液器移取40 μL L-左旋多巴標準溶液和80μL的PB緩沖液到96孔板中，分別在待測樣品組和樣品空白組中加入40μL待測樣品，控制組和空白組中加入40μL溶劑，37℃溫育10min，最后在待測樣品組和樣品空白組中加入401aL酪氨酸酶溶液，37℃溫育5～10min，迅速在酶標儀490nm下測定吸光度。每個實驗做三次平行，取平均值。

酪氨酸酶活性抑制率（%）=（1-A_i/A₀）×100%

式中：A₀為控制組扣掉空白組的吸光度;A_i：待測樣品組扣掉樣品空白組的吸光度

05結(jié)果與討論

5.1還原型GSH和氧化型GSSG谷胱甘肽對DPPH·自由基的清除率結(jié)果

如圖4所示，還原型谷胱甘肽GSH清除DPPH·自由基的效果較好，且根據(jù)劑量-反應(yīng)曲線計算可得其半最大效應(yīng)濃度（EC50）值為0.11 mg/mL，即很低濃度下即可清除DPPH·自由基，表現(xiàn)出一定的氧化性能，當(dāng)GSH的濃度提高為0.5mg/mL時，其對DPPH·的清除率則提高為95.2%。而由圖5可知，氧化型谷胱甘肽GSSG在0.5mg/mL該濃度時，對DPPH·自由基的清除率僅為1.1%，僅為同濃度GSH對自由基清除效率的1.16%。

5.2還原型GSH和氧化型GSSG谷胱甘肽對羥自由基（HO·）的清除率結(jié)果

由圖6可知，還原型谷胱甘肽（GSH）清除羥自由基的效果比較好，根據(jù)劑量-反應(yīng)曲線計算可得其半最大效應(yīng)濃度（EC50）值為3.5mg/mL，即在比較低的濃度就具備較強的清除HO·自由基抗氧化的能力。當(dāng)GSH的濃度提高為10mg/mL時，其對羥自由基的清除率也升高至69.0%。而相比之下，由圖了可知，氧化型谷胱甘肽（GSSG）即使?jié)舛冗_到GSH濃度的5倍（50mg/mL），其對羥自由基的清除率也僅為40.3%，可見對于HO·自由基的清除效果而言，GSSG效果不及GSH。

5.3還原型GSH和氧化型GSSG谷胱甘肽對超氧陰離子自由基（0_2^-）的清除率結(jié)果

由圖8所示，當(dāng)還原型谷胱甘肽（GSH）濃度僅為5mg/mL時，其對O₂^-自由基的清除率可達89.6%。根據(jù)劑量-反應(yīng)曲線計算可得其半最大效應(yīng)濃度（EC50）值為0.50mg/mL。而如圖9所示，當(dāng)氧化型谷胱甘肽（GSSG）在同濃度（5mg/mL）條件下，其對超氧陰離子的清除率為0，即使GSSG的濃度為50 mg/mL時，其對超氧陰離子的清除率也僅有43.3%，遠不及GSH的清除效率。

5.4還原型GSH和氧化型GSSG谷胱甘肽對酪氨酸酶的抑制效果

由圖10可知，1.00mg/mL的還原型的谷胱甘肽（GSH）對酪氨酸酶活性抑制率可以達到92.5%，并且根據(jù)劑量-反應(yīng)曲線計算可得，半最大抑制濃度（IC50）值為0.32 mg/mL。即極低濃度則可有效抑制酪氨酸酶的活性，阻止黑色素的生成。而如圖11所示，100mg/mL的氧化型谷胱甘肽（GSSG）對酪氨酸酶活性抑制率可以達到88.3%，即100倍于GSH的濃度（1mg/mL）也達不到GSH對酪氨酸92.5%抑制率的水平，而根據(jù)劑量-反應(yīng)曲線計算可得，氧化型谷胱甘肽GSSG對酪氨酸酶的半最大抑制濃度（IC50）值為57.2mg/mL，約是還原型谷胱甘肽（GSH）IC50值的178倍，即GSSG通過抑制酪氨酸酶的活性從而抑制黑色素生成的能力是遠不及GSH的。

06結(jié)論

氧化型GSSG和還原型谷胱甘肽GSH在化妝品中均因其抗氧化清除自由基和抑制酪氨酸酶和黑色素生成的功效而被廣泛使用，且因為在氧化型谷胱甘肽GSSG中因為有特征氣味的巰基鍵轉(zhuǎn)化為二硫鍵，特征氣味變淡，而更為配方師和消費者接受，或者將GSH和GSSG二者按照一定比例混合使用。但從清除DPPH自由基、HO·自由基、O₂^-自由基的體外實驗結(jié)果來看，GSH的活性和功效性更加突出。同濃度（0.5mg/mL）下，清除DPPH自由基的抗氧化性能至少為GSSG的86倍，同濃度（10.0mg/mL）下，清除HO·自由基的抗氧化性能至少為GSSG的2倍，在同濃度（5mg/mL）條件下，清除O₂^-自由基的清除率GSH為89.6%，而GSSG為0%，由此可見，當(dāng)兩分子還原型谷胱甘肽通過二硫鍵結(jié)合為一分子GSSG后，因為強還原基團-SH的消失，其抗氧化性能大大降低。而根據(jù)抑制酪氨酸酶（抑制黑色素生成）活性（IC50）體外實驗結(jié)果來看，GSH至少為GSSG的178倍，因為還原性/抗氧化性能的下降，進一步影響了黑色素生成過程中的酶促氧化反應(yīng)，從而美白效果也下降。