水稻紋枯病菌對生物農(nóng)藥申嗪霉素和吩胺霉素的抗藥性初探

郝祥蕊 吳小珍 崔瑩 何亞文

摘??? 要：紋枯病是由立枯絲核菌侵染引起的一種真菌病害，是水稻發(fā)生最為普遍的病害之一。申嗪霉素和吩胺霉素是我國具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的微生物代謝產(chǎn)物農(nóng)藥。為了研究水稻紋枯病菌對這兩種生物農(nóng)藥的抗藥性，本研究開展了如下試驗(yàn)：（1）分別測定申嗪霉素和吩胺霉素在離體平板培養(yǎng)條件下抑制水稻紋枯病菌生長所需EC20和EC50;（2）紋枯病菌在含有EC20濃度申嗪霉素或吩胺霉素平板上連續(xù)傳代傳至20代、25代和30代時(shí)，分別測定了各自的EC50;（3）比較了在含有EC20濃度申嗪霉素或吩胺霉素平板上連續(xù)培養(yǎng)25代的紋枯病菌對水稻的致病性;（4）從相應(yīng)致病水稻再分離純化紋枯病菌，比較了所得紋枯病菌的菌落形態(tài)、菌絲顏色及其形成的菌核形態(tài)。結(jié)果表明：水稻紋枯病菌在含有申嗪霉素或吩胺霉素的平板上培養(yǎng)20～30代后，對申嗪霉素和吩胺霉素的敏感性與對照相比無顯著性差異。申嗪霉素和吩胺霉素可長期使用防治水稻紋枯病。

關(guān)鍵詞：水稻紋枯病;申嗪霉素;吩胺霉素;耐藥性

中圖分類號(hào)：S435.111.4+2???????? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A????????? DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2021.09.011

Evaluation of the Drug Resistance of Rhizoctonia to Two Metabolite Pesticides Shenqinmycin and Fenanmycin

HAO Xiangrui1，2， WU Xiaozhen1， CUI Ying2， HE Yawen2

（1.Shanghai Nongle Biological Products Limited Company， Shanghai 201419， China; 2.Shanghai Jiao Tong University-Shanghai Nongle Joint R&D center on Biopesticides and Biofertilizers， Shanghai Jiao Tong University， Shanghai 200240， China）

Abstract： Rice sheath blight is an important rice fungal disease caused by Rhizoctonia solani. Shenqinmycin and Fenanmycin are microbial metabolite pesticides with independent intellectual property rights in China. To investigate whether Shenqinmycin or Fenanmycin application caused drug resistance in Rhizoctonia solani， the following experiments were conducted in this study： （1） The EC50 （half maximal effective concentration） and EC20 values of Shenqinmycin and Fenanmycin on Rhizoctonia solani under in vitro plate culturing condition were determined; （2） After subculturing for 20， 25 and 30 generations on the plate supplemented with Shenqinmycin or Fenanmycin at EC20 concentration， the EC50 of the resultant Rhizoctonia solani was determined; （3） The virulence of the 25-generation sub-cultured Rhizoctonia solani on rice was determined; （4） The Rhizoctonia solani strains were isolated from the infected rice and compared in the colony morphology， hyphal color and sclerotioid morphology. The results suggested that no drug resistance against Rhizoctonia solani was observed after in vitro subculturing for 20-30 generations on Shenqinmycin-or Fenanmycin-containing plates. The Shenqinmycin-or Fenanmycin-treated Rhizoctonia solani remains virulent on rice as the original isolate.

Key words： Rhizoctonia solani; Shenqinmycin; Fenanmycin; drug resistance

水稻紋枯病是由立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）侵染引起的一種真菌性病害。水稻發(fā)病后葉片枯死，結(jié)實(shí)率下降，平均減產(chǎn)5%～10%，嚴(yán)重發(fā)病時(shí)可減產(chǎn)30%～50%，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1-3]。常規(guī)使用的防治藥劑，如愛苗（30%苯醚甲環(huán)唑·丙環(huán)唑乳油）、嘧菌酯懸浮劑、滿穗（噻呋酰胺懸浮劑）、己唑醇和嘧菌酯懸浮劑等，可用于防治水稻紋枯病，但易產(chǎn)生不同程度的抗藥性[4-5]。吸水鏈霉菌井岡山變種產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物井岡霉素在我國已使用40多年，防治水稻紋枯病效果顯著，但造成施藥量和施藥次數(shù)顯著增加，這一問題已經(jīng)引起有關(guān)部門的高度重視[6-8]。

申嗪霉素是上海交通大學(xué)與上海農(nóng)樂生物制品股份有限公司合作開發(fā)的一種生物農(nóng)藥，其活性成分是熒光假單胞菌產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物吩嗪-1-羧酸（phenazine-1-carboxylic acid，簡稱PCA，圖1-A）[9-10]。申嗪霉素兼具廣譜抑菌活性和促進(jìn)植物生長雙重功能。2008—2009年期間，在全國南方10個(gè)省、市完成的大田試驗(yàn)結(jié)果表明，1%申嗪霉素懸浮劑能有效防治水稻紋枯病，平均防效超過80%[11-13]。2011—2016年間申嗪霉素原藥和1%申嗪霉素懸浮劑先后獲得了農(nóng)藥登記證[14]。吩胺霉素有效成分為吩嗪-1-甲酰胺（phenazine-1-carboxamide，簡稱PCN，圖1-B），它是由綠針假單胞菌產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物，具有廣譜的抑菌、抗菌活性，還能有效誘導(dǎo)水稻和大豆等作物產(chǎn)生免疫抗性[15-16]。在中性和堿性pH環(huán)境條件下，吩胺霉素抗菌活性比申嗪霉素更穩(wěn)定[17-18]，適合我國西北部堿性土壤環(huán)境。目前高產(chǎn)PCN的工程菌株已經(jīng)成功獲得[14]，吩胺霉素原藥和3% 吩胺霉素懸浮劑登記正在進(jìn)行中，有望成為新一代生物農(nóng)藥。

病原菌產(chǎn)生抗藥性是農(nóng)藥防治效果下降的主要原因，為探討水稻紋枯病菌對申嗪霉素和吩胺霉素抗藥性，本研究將水稻紋枯病菌在含申嗪霉素或吩胺霉素的平板上連續(xù)培養(yǎng)30代后，測定其對兩種藥劑敏感性，以及病菌的致病性，為申嗪霉素和吩胺霉素的推廣使用提供理論支撐。

1 材料和方法

1.1 供試病原菌與供試藥劑

水稻紋枯病菌（Rhizoctonia solani） 浙江分離株來自上海農(nóng)樂生物制品股份有限公司菌種保藏中心，原始保藏菌株在本研究中簡稱CK0。根據(jù)需要本研究還用到如下菌株名稱。PSAY-20、PSAY-25和PSAY-30：在PSAY平板上繼代培養(yǎng)20，25，30代的紋枯菌;PSAYA20-20、PSAYA20-25和PSAYA20-30：在含有EC20濃度申嗪霉素的PSAY平板上繼代培養(yǎng)20，25，30代的紋枯菌;PSAYN20-20、PSAYN20-25和PSAYN20-30：在含有EC20濃度吩胺霉素的PSAY平板上繼代培養(yǎng)20，25，30代的紋枯菌。1%申嗪霉素懸浮劑和1%吩胺霉素懸浮劑，均由上海農(nóng)樂生物制品股份有限公司提供。

1.2 試驗(yàn)所用培養(yǎng)基

PSA培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g、蔗糖20 g、瓊脂20 g、蒸餾水定容至1 000 mL）;PSAY培養(yǎng)基（PSA+0.5%酵母膏）;PSA培養(yǎng)基和PSAY培養(yǎng)基經(jīng)高溫高壓滅菌后保存?zhèn)溆谩SAYA培養(yǎng)基（PSAY+2～10 μg·mL-1申嗪霉素）;PSAYA20培養(yǎng)基（PSAY + EC20濃度申嗪霉素）：PSAYN培養(yǎng)基（PSAY+2～10 μg·mL-1吩胺霉素）：PSAYN20培養(yǎng)基（PSAY+EC20濃度吩胺霉素）。

1.3 室內(nèi)抑菌活性的測定

采用平皿生長速率法測定藥劑對病菌的抑制效果[19]。在無菌超凈臺(tái)中將供試的藥劑與融化后冷卻至50 ℃左右的PSAY培養(yǎng)基均勻混合，倒入15×9 cm的培養(yǎng)皿中，每皿20 mL，凝固后得到含有不同濃度申嗪霉素的PSAYA平板和含有不同濃度吩胺霉素的PSAYN平板;以不添加藥液的PSAY平板作為空白對照，每個(gè)濃度重復(fù)5次。將保存的紋枯菌接種在PSA平板上，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，用打孔器取直徑為8 mm的菌絲塊，接種到上述不含或含有藥劑的平板上，置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待病原菌絲體在對照平板中長滿整個(gè)平皿時(shí)，采用十字交叉法[20]測定待測平板上菌落直徑。按下列公式計(jì)算抑菌率：

抑制率（%）=×100

利用GraphPad Prism8程序計(jì)算藥物抑菌率與濃度對數(shù)之間的線性方程，根據(jù)線性方程，計(jì)算EC20和EC50。

1.4 紋枯病菌在PSAY平板上培養(yǎng)和轉(zhuǎn)接繼代培養(yǎng)

根據(jù)試驗(yàn)所確定得EC20濃度，計(jì)算出所需1%申嗪霉素懸浮劑和1%吩胺霉素懸浮劑的使用量，用水定容到1 mL，對照為1 mL無菌水;快速加入9 mL 50 ℃左右的PSAY瓊脂培養(yǎng)基，混勻，倒入15×9 cm無菌培養(yǎng)皿。待平板冷卻后取直徑為8 mm的菌絲塊，接種到該平板上，置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。以菌核長好為準(zhǔn)（約8 d）。如此重復(fù)進(jìn)行，培養(yǎng)20～30代。

1.5 紋枯病菌在水稻上致病性測試

參考許文耀發(fā)表的接種方法[21]，采用菌絲塊或菌核接種。在奉賢公司總部試驗(yàn)地水稻種植小區(qū)（共4塊小區(qū)，每小區(qū)面積為13 m2）挑選未抽穗的健康水稻苗40株，在水稻葉鞘位置用針扎孔，將相同大小菌絲塊放置在已扎孔的葉鞘部位。先用脫脂棉進(jìn)行包扎，外用保鮮膜封住，并做好標(biāo)記。每株接種2～3部位，保持該部位處于濕潤狀態(tài)3 d，3 d后去掉脫脂棉和保鮮膜，接種7～10 d后，分別觀察和記錄紋枯病菌侵染病斑大小。

1.6 從發(fā)病水稻中分離紋枯病菌

參考許文耀發(fā)表的紋枯病菌分離方法[21]。切取發(fā)病、健康交界處的水稻組織一小塊（1.5 cm2），先置于70% 乙醇中浸泡5 s，后移入0.1% 升汞中浸泡5 min，再把水稻組織轉(zhuǎn)移到滅菌水中漂洗3遍，最后轉(zhuǎn)移到PSA平板上培養(yǎng)直到長出病原菌。

1.7 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

每組試驗(yàn)至少設(shè)5個(gè)重復(fù)，統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果后計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)方差（SD）。利用T-test統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，以P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。相同字母代表不同處理之間不存在顯著性差異（P>0.05），不同字母則代表二者之間存在顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 申嗪霉素和吩胺霉素抑制紋枯病菌株生長的EC20和EC50

通過前期預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，分別準(zhǔn)備含有2～10 μg·mL-1申嗪霉素的PSAYA平板開展試驗(yàn)。接種活化的原始紋枯病菌（簡稱CK0）菌塊，培養(yǎng)8 d后，統(tǒng)計(jì)菌落直徑。結(jié)果表明：在不含申嗪霉素的PSAY平板上紋枯病菌CK0的菌落平均直徑為7.36 cm，而在含有2 ～ 10 μg·mL-1申嗪霉素的PSAYA平板上紋枯病菌的菌落平均直徑分別為6.65，4.48，3.71，3.40，3.26 cm（表1），相應(yīng)的抑菌率分別為10.82%，43.9%，55.64%，60.37%，62.50%。利用GraphPad Prism8擬合出申嗪霉素抑菌率與濃度對數(shù)之間的線性方程為：Y=74.86×lgX-7.016（圖2-A）。據(jù)此，申嗪霉素抑制水稻紋枯病菌生長CK0所需EC20和EC50確定為2.30，5.77 μg·mL-1（表1）。

利用同樣的方法，吩胺霉素對紋枯病菌原始菌株CK0抑菌率幾率值與濃度對數(shù)之間的線性方程為：Y=77.18×lgX-4.262（圖2-B）。吩胺霉素抑制水稻紋枯病菌CK0生長的EC20和EC50確定為2.06，5.05 μg·mL-1（表1）。

2.2 連續(xù)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)20～30代后的紋枯病菌對申嗪霉素敏感性

新鮮原始紋枯病菌CK0菌塊分別接種到PSAY瓊脂平板及含有2.30 μg·mL-1（EC20） 申嗪霉素的PASY瓊脂平板（簡稱PSAYA20），培養(yǎng)8 d后，再分別取菌塊，轉(zhuǎn)接到新的PSAY平板及PSAYA20平板上，如此連續(xù)培養(yǎng)20，25，30代。所得紋枯病菌分別接種到含有2 ～ 10 μg·mL-1申嗪霉素的PSAYA平板上生長。記錄菌落直徑，換算成抑制率，分別得到相應(yīng)的回歸方程式（表2）。根據(jù)所得回歸方程式，確定申嗪霉素抑制這些紋枯病菌生長所需EC50。結(jié)果表明：在PSAY平板上轉(zhuǎn)接了20，25，30代的紋枯病菌（PSAY-20、PSAY-25和PSAY-30）對申嗪霉素的EC50分別為5.52，5.96，5.78 μg·mL-1（表2），而在含有EC20濃度（2.30 μg·mL-1）申嗪霉素平板上轉(zhuǎn)接了20，25，30代的紋枯病菌（PSAYA20-20、PSAYA20-25和PSAYA20-30）對申嗪霉素的EC50分別為5.61，

5.75，5.77 μg·mL-1（表2）。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明：兩種平板繼代培養(yǎng)后的紋枯病菌對申嗪霉素的EC50沒有顯著性差異，與原始菌株CK0的EC50（5.77 μg·mL-1，表1）沒有顯著性差異。

2.3 連續(xù)轉(zhuǎn)接20～30代后的紋枯病菌對吩胺霉素敏感性

運(yùn)用上述方法，原始紋枯病菌CK0菌快分別接種到PSAY瓊脂平板、含有2.06 μg·mL-1（EC20）吩胺霉素的瓊脂平板（簡稱PSAYN20），培養(yǎng)8 d后，再分別取菌塊，轉(zhuǎn)接到新的PSAY平板或PSAYN20平板上，如此連續(xù)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)20，25，30代。所得紋枯病菌分別接種到含有2 ～ 10 μg·mL-1吩胺霉素的PSAYN平板上生長，8 d后記錄菌落直徑，換算成抑制率。根據(jù)抑制率，分別得到相應(yīng)的回歸方程式和吩胺霉素抑制這些紋枯病菌生長所需EC50（表3）。結(jié)果表明：在PSAY平板上轉(zhuǎn)接培養(yǎng)了20，25，30代的紋枯病菌（PSAY-20、PSAY-25和PSAY-30）對吩胺霉素的EC50分別為5.08，4.89，4.88 μg·mL-1（表3），而在PSAYN20平板上轉(zhuǎn)接培養(yǎng)20、25和30代的紋枯病菌（PSAYN20-20、 PSAYN20-25和PSAYN20-30）對吩胺霉素的EC50分別為5.06，5.09，4.73 μg·mL-1（表3）。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明：轉(zhuǎn)接培養(yǎng)20～30代的紋枯病菌與原始菌株CK0對吩胺霉素的EC50沒有顯著性差異。

2.4 在PSAY、PSAYA20和PASYN20平板上轉(zhuǎn)接了25代的紋枯病菌對水稻的致病性和形態(tài)學(xué)分析

將原始菌種（CK0）、在PSAY平板上連續(xù)培養(yǎng)25代的菌株P(guān)SAY-25、在PSAYA20平板上培養(yǎng)25代的菌株P(guān)SAYA20-25和在PSAYN20平板上培養(yǎng)25代的菌株P(guān)SAYN20-25接種未抽穗的水稻葉鞘部位。接種7 d和10 d后，能明顯看到接種部位出現(xiàn)病斑（圖3-4），這些菌株在水稻上所引起的平均病斑面積沒有顯著性差異（圖5），說明申嗪霉素或吩胺霉素處理沒有影響紋枯病菌的致病性。

進(jìn)一步從水稻上發(fā)病部位分離紋枯病菌，經(jīng)純化培養(yǎng)后，所得菌株在菌落形態(tài)、菌絲顏色及其形成的菌核方面與原始菌種（CK0）基本一致（圖6）。

3 結(jié)論與討論

農(nóng)藥是農(nóng)業(yè)和林業(yè)等領(lǐng)域的基本生產(chǎn)資料，是維持人類社會(huì)穩(wěn)定的基本保障。病蟲害產(chǎn)生抗藥性是影響農(nóng)藥充分發(fā)揮功效的一個(gè)重要因素，病蟲害抗藥性的發(fā)生與農(nóng)藥的作用靶標(biāo)密切相關(guān)。申嗪霉素是一類微生物代謝產(chǎn)物農(nóng)藥，主要活性成分是假單胞菌產(chǎn)生的吩嗪-1-羧酸。這種代謝產(chǎn)物在自然界，尤其是作物根際微生物中廣泛存在，具有廣譜的殺菌活性，目前已獲得防治九種作物真菌性病害的農(nóng)藥登記證[14]。由于申嗪霉素對水稻白葉枯菌也有抑制作用，因此，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)周明國教授團(tuán)隊(duì)10多年前就開始以水稻白葉枯菌為對象，從不同角度研究了申嗪霉素的作用靶標(biāo)。Xu等[22]發(fā)現(xiàn)申嗪霉素處理能顯著提高水稻白葉枯菌活性氧（ROS）積累，降低過氧化氫酶（catalase，CAT）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性。Pan等[23]進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)申嗪霉素與其它農(nóng)藥無交互抗性，水稻白葉枯菌抗申嗪霉素風(fēng)險(xiǎn)較低。吩胺霉素是申嗪霉素的衍生物，在中性或偏堿性環(huán)境中抑菌活性更強(qiáng)更穩(wěn)定[17-18]。Xiang等[15]報(bào)道吩胺霉素抑制水稻紋枯病菌的EC50為9.093 4 μg·mL-1，作用靶標(biāo)包括幾丁質(zhì)合成酶、線粒體中電子傳遞和氧化磷酸化。Ma等[16]發(fā)現(xiàn)0.1 ～ 1.0 μM吩胺霉素即可誘導(dǎo)水稻產(chǎn)生抗病性。Chen等[24]發(fā)現(xiàn)在小麥赤霉病菌中PCN的作用靶標(biāo)之一是組氨酸?；?。

在以水稻白葉枯菌為對象研究申嗪霉素抗藥性過程中，雖然分離到了抗性突變體，但這些突變體基本上都是生長受到嚴(yán)重影響的突變體，沒有得到典型的農(nóng)藥抗性突變菌株[23]。本研究利用水稻紋枯病菌為研究對象，分別研究了不同培養(yǎng)繼代培養(yǎng)條件下所得紋枯病菌對申嗪霉素和吩胺霉素的EC50以及對水稻的致病性，發(fā)現(xiàn)經(jīng)20～30代繼代培養(yǎng)后的紋枯病菌對這兩種代謝產(chǎn)物農(nóng)藥沒有產(chǎn)生抗藥性。這一結(jié)論與目前其它生物農(nóng)藥抗藥性研究結(jié)果基本類似。雖然井岡霉素的用藥量越來越高，但至今沒有發(fā)現(xiàn)抗井岡霉素的紋枯病菌。

紋枯病菌對申嗪霉素或吩胺霉素不易產(chǎn)生抗藥性的分子機(jī)理值得進(jìn)一步研究。根據(jù)吩嗪類化合物的特點(diǎn)、生物學(xué)功能和申嗪霉素劑型等，紋枯病菌對申嗪霉素或吩胺霉素不易產(chǎn)生抗藥性可能有如下幾個(gè)方面的原因：（1）吩嗪類化合物具有多種生物學(xué)功能。申嗪霉素或吩胺霉素具有廣譜殺菌活性，是許多微生物定殖植物根際的重要手段[25];它們在假單胞菌胞內(nèi)還是一類特殊的信號(hào)分子，可以誘導(dǎo)基因表達(dá)，調(diào)控鐵代謝和生物膜等多種生物學(xué)功能[26];申嗪霉素或吩胺霉素還是重要的電子受體，參與微生物發(fā)電或微生物之間電信號(hào)傳遞[27];（2）吩嗪類化合物多樣化的生物學(xué)功能決定它們可能有多個(gè)靶標(biāo)或影響多種生物學(xué)功能。（3）申嗪霉素和吩胺霉素是多類土壤或植物根際微生物產(chǎn)生的非極性強(qiáng)的天然產(chǎn)物，通常都有多種結(jié)構(gòu)類似物存在，不是單一化合物，經(jīng)歷了長期的自然選擇，病原菌不易產(chǎn)生抗藥性。

綜上所述，生物農(nóng)藥申嗪霉素和吩胺霉素，長期使用防治水稻紋枯病，不易產(chǎn)生抗藥性，可在水稻主產(chǎn)區(qū)推廣使用，為我國化學(xué)農(nóng)藥減量使用，農(nóng)產(chǎn)品安全保障及品質(zhì)提升提供保障。

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