基于WGCNA分析和風險評分建模的骨肉瘤轉(zhuǎn)移標志物篩選和預后研究*

仲 濤 朱英會 仲偉俍 王志堅 于英楠△ 田 康

【提 要】 目的 應用WGCNA分析篩選骨肉瘤轉(zhuǎn)移標志物，通過風險評分建立骨內(nèi)瘤預后的預測模型，為評估骨內(nèi)瘤轉(zhuǎn)移和預后提供方法指導。方法 基于GSE14359數(shù)據(jù)集(n=20)，WGCNA法確定骨內(nèi)瘤轉(zhuǎn)移模塊中的中心基因；獲取TARGET公共數(shù)據(jù)庫骨內(nèi)瘤樣本(n=86)，在單因素Kaplan-Meier預后分析基礎上，Cox多因素計算風險評分構(gòu)建評估患者生存的預測模型。結(jié)果 中心基因HLA-DRA和FLI1與骨內(nèi)瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(P<0.05)；風險評分=0.149×G0S2-0.572×ARHGDIB+0.048×CD74+0.242×HLA-DMA-0.473×MGAT1-0.813×PLD3+0.230×EPAS1，有較好的預后評估能力(P<0.001；HR=2.72)。結(jié)論 WGCNA分析能夠有效篩選OS轉(zhuǎn)移標志物，風險評分能識別更靈敏的預后模型。

骨肉瘤(Osteosarcoma，OS)是骨骼系統(tǒng)中一種侵襲性惡性腫瘤，其病情發(fā)展迅速且預后不良，已經(jīng)成為兒童和青少年的主要致死性疾病[1]。雖然近年來的新輔助化療不斷發(fā)展，手術(shù)切除技術(shù)不斷進步[2]，但是由于缺少早期篩查標記物，約20%OS患者在診斷時就已經(jīng)出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，特別是肺轉(zhuǎn)移[3]，因此其5年生存率仍然沒有得到顯著提升[4]。因此，尋找潛在的生物標志物來評估OS的轉(zhuǎn)移和預后具有重要的臨床應用價值。

WGCNA分析[5-6]，即加權(quán)基因共表達網(wǎng)絡分析，首先通過計算基因之間的表達相關(guān)性，將具有相似表達模式的基因聚類到一個模塊中并篩選出中心基因，然后再分析該模塊與樣本特征(包括臨床病理參數(shù)和治療方法等)之間的相關(guān)性。目前，由于骨肉瘤的異質(zhì)性，基于小樣本的差異表達分析的骨肉瘤轉(zhuǎn)移生物標志物往往敏感度和特異度較低，因而缺乏臨床應用價值[7]。WGCNA則從復雜的多樣本轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中快速地提取出與轉(zhuǎn)移相關(guān)的模塊及基因，在比較模塊內(nèi)連接性和基因重要性基礎上，獲得適用性更廣泛的生物標志物[8-9]。風險評分建模基于Cox回歸賦予多個基因的風險系數(shù)后計算個體預后風險高低[10]，并分析其與患者生存的相關(guān)性，多項研究證實多基因模型預后評估的準確性往往高于單一基因[11-13]。

本研究將WGCNA分析用于骨肉瘤轉(zhuǎn)移標志物的篩選；采用風險評分建模進行預后模型的構(gòu)建，同時繪制ROC曲線評估多基因模型的準確性。

材料與方法

1.數(shù)據(jù)來源

本研究收集的數(shù)據(jù)分別下載自GEO和TARGET數(shù)據(jù)庫。其中，GEO來源的GSE14359數(shù)據(jù)集包括2例正常樣本和18例OS組織，后者中有8例是轉(zhuǎn)移瘤；GSE32981包括5例未轉(zhuǎn)移OS及11例轉(zhuǎn)移瘤樣本。從TARGET數(shù)據(jù)庫獲取的86例OS患者中，有57例生存，29例死亡，中位生存時間為1323(0～5840)天。

2.統(tǒng)計分析方法

(1)基因差異表達分析：使用R語言limma包分析差異表達基因，并繪制火山圖進行可視化。

(2)加權(quán)基因共表達網(wǎng)絡分析(WGCNA)：通過計算尺度獨立性(R2)和平均連通性以確定表征基因符合無尺度分布的軟閾值，Pearson法選定與“轉(zhuǎn)移”相關(guān)的模塊及其中心基因。

(3)預后分析：風險評分是通過多因素Cox回歸計算風險系數(shù)得到的[14]，繪制受試者工作特征曲線(ROC曲線)來表征預后模型的靈敏度；log-rank單因素Kaplan-Meier法用于分析單個指標或者風險評分與OS預后的相關(guān)性[15]。

結(jié) 果

1.識別OS樣本構(gòu)成的模塊

分析GSE14359數(shù)據(jù)差異基因發(fā)現(xiàn)，相比于正常樣本，OS中有上調(diào)基因1108個，下調(diào)基因1419個(圖1A)。進一步WGCNA分析顯示，通過尺度獨立性和平均連通性比較發(fā)現(xiàn)基因間聯(lián)系軟閾值為5后(圖1B)，繪制聚類樹狀圖得到了29個關(guān)鍵模塊(圖1C)。

圖1 WGCNA法基于差異基因確定的軟閾值并識別共表達網(wǎng)絡模塊

2.確定OS轉(zhuǎn)移相關(guān)的中心基因

深入分析發(fā)現(xiàn)綠色、藍色和棕色模塊與骨轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(圖2A)；為了進一步驗證模塊中參與調(diào)控OS轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵基因(n=48)，將其與OS轉(zhuǎn)移和非轉(zhuǎn)移的差異基因取交集，結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有HLA-DRA和FLI1在OS轉(zhuǎn)移過程中表達失調(diào)(圖2B)。

圖2 篩選與OS轉(zhuǎn)移相關(guān)的中心基因

3.分析中心基因與OS患者預后的相關(guān)性

通過單因素Kaplan-Meier法分析48個中心基因與OS患者預后的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，PLD3、ARHGDIB、G0S2、MGAT1、CD74、HLA-DMA高表達時，患者生存時間延長；而EPAS1高表達時，患者預后不良(圖3)，ROC曲線分別評估它們，預測預后1、3、5年的靈敏度和特異度(圖4)。

圖3 中心基因和OS預后的Kaplan-Meier曲線

圖4 中心基因預測預后的ROC曲線

4.構(gòu)建OS患者預后評估最佳模型

將上述7個基因納入多因素Cox回歸分析后得到預后模型：風險評分=0.149×G0S2-0.572×ARHGDIB+0.048×CD74+0.242×HLA-DMA-0.473×MGAT1-0.813×PLD3+0.230×EPAS1(圖5A)。ROC曲線顯示該模型具有較好的準確性(AUC>0.7)(圖5B)。此外，相比于單因素，七基因組合與預后的相關(guān)性更顯著，提示更強的評估能力(P<0.001；HR=2.72)，見圖5C。

圖5 通過計算風險評分構(gòu)建預測OS患者生存的高效模型

討 論

OS是最常見的原發(fā)性骨惡性腫瘤，在年輕患者中表現(xiàn)出高度侵襲性和早期轉(zhuǎn)移性[3]。為了實現(xiàn)OS的及時診斷和治療，尋找潛在的生物標志物已經(jīng)成為目前亟待完成的任務。本研究基于GSE14359和GSE32981數(shù)據(jù)集，采用WGCNA法篩選出2個與OS轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)的中心基因(HLA-DRA和FLI1)；進一步分析TATGET數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，通過Cox回歸風險評分得到的“七基因預后模型”有更好的評估能力。

在本研究中，通過WGCNA法篩選得到三個與OS轉(zhuǎn)移特性密切相關(guān)的模塊中的48個中心基因(P<0.05)。新近研究發(fā)現(xiàn)，Tian等同樣基于OS樣本的差異表達基因通過WGCNA法篩選出能分型轉(zhuǎn)移的SVM過濾器[16]；此外，Zhang等使用WGCNA法分析GSE21257數(shù)據(jù)來確定區(qū)分OS轉(zhuǎn)移的預測標記[17]；Wang等則通過分析收集的52例OS樣本的RNA-seq結(jié)果[18]，采用WGCNA法模塊性狀分析得到其與轉(zhuǎn)移正相關(guān)在內(nèi)的關(guān)鍵模塊及中心基因，為骨肉瘤的分子機制提供見解。值得注意地是，為了精確篩選預測因子，本研究進一步通過交集GSE32981中轉(zhuǎn)移與否樣本的差異基因，最終確認HLA-DRA和FLI1參與OS轉(zhuǎn)移調(diào)控。由此，本研究在WGCNA法的基礎上進行深入過濾，對篩選OS轉(zhuǎn)移潛在生物標志物方法進行了優(yōu)化。

本研究基于單因素Kaplan-Meier法探討OS轉(zhuǎn)移相關(guān)的中心基因?qū)颊哳A后的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PLD3、ARHGDIB、G0S2、MGAT1、EPAS1、CD74及HLA-DMA參與了患者生存時間的調(diào)節(jié)(P<0.05)。為了構(gòu)建出更好的預后標記，本研究進一步通過計算七個基因的風險系數(shù)賦予每個患者相應的預后評分。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，七基因模型的預后評估效能明顯提升(P<0.001；HR=2.72)。有研究報道，Niu等發(fā)現(xiàn)EGR1、CXCL10、MYC和CXCR4均可作為OS預后的潛在生物標志物[19]；Nakka等的結(jié)果也表明miR-21 和miR-221在OS中的表達差異對患者預后具有重要意義[20]。然而，以上證據(jù)只提供了單個基因的生存評估作用，本研究則與Liu等[11]基于Cox回歸模型發(fā)現(xiàn)兩基因(PML-EPB41)模型比單獨基因具有更好的預后預測價值相似。本研究通過計算風險評分將患者分為高或低風險組，并證實高或低風險組患者生存時間差異更顯著，從而進一步證實多基因模型能更有效地評估OS預后。