FGF5基因編輯細(xì)毛羊的健康狀況評估

胡慧宇，任思睿，劉晨曦，韓 冰，李忠慧，瑪依拉，劉明軍，李文蓉*

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，烏魯木齊830052；2.新疆畜牧科學(xué)院生物技術(shù)研究所，烏魯木齊830011；3.新疆維吾爾自治區(qū)動物生物技術(shù)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊830011）

目前轉(zhuǎn)基因動物的潛在安全問題是人們廣泛關(guān)注的熱點(diǎn)問題之一。依照我國《轉(zhuǎn)基因生物安全評價(jià)管理?xiàng)l例》、《轉(zhuǎn)基因動物安全評價(jià)指南》，明確了轉(zhuǎn)基因動物評價(jià)應(yīng)包括分子特征、遺傳穩(wěn)定性、健康狀況、功能效率評價(jià)、環(huán)境適應(yīng)性、轉(zhuǎn)基因動物逃逸（釋放）及其對環(huán)境的影響和食用安全7個(gè)主要方面。其中，轉(zhuǎn)基因及基因編輯動物健康狀況用一般指標(biāo)、生理學(xué)指標(biāo)和其他適合的指標(biāo)進(jìn)行評價(jià)。

基因編輯技術(shù)是一項(xiàng)在生物體基因組水平上對DNA序列進(jìn)行定向改造的新型技術(shù)，主要包括鋅指核酸酶（zinc finger nuclease，ZFN）、類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸內(nèi)切酶（transcription activator-like effector nucleases，TALEN）和規(guī)律成簇的短回文重復(fù)序列／Cas9（clustered regularly inter-spaced short palindromic repeats／Cas9，CRISPR/Cas9）等介導(dǎo)的技術(shù)[1-3]。其中，CRISPR/Cas9技術(shù)只需較短的sgRNA序列便可引導(dǎo)Cas9蛋白在內(nèi)源性基因組特定位點(diǎn)進(jìn)行切割、精準(zhǔn)編輯，相較于其它基因編輯技術(shù)具有更加高效便捷的特點(diǎn)[4,5]。同時(shí)，該技術(shù)不導(dǎo)入外源DNA序列進(jìn)入動物基因組中。因此CRISPR/Cas9從理論上更加安全、更易為公眾所接受。成纖維細(xì)胞生長因子5（Febroblast Growth factor 5，F(xiàn)GF5）是23個(gè)FGF家族的成員之一，具有阻止毛乳頭細(xì)胞的激活和增殖，有效抑制毛發(fā)生長發(fā)育的作用[6]。目前的研究表明，F(xiàn)GF5與毛囊的發(fā)育和被毛的生長密切相關(guān)，能有效控制毛囊從生長期向休止期的轉(zhuǎn)化[7]。羊毛長度是綿羊重要的經(jīng)濟(jì)性狀之一，屬復(fù)雜數(shù)量性狀，利用常規(guī)遺傳手段改良難度大、周期長[8]。利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)對細(xì)毛羊FGF5基因進(jìn)行靶向修飾，能有效阻斷FGF5功能，從而促進(jìn)羊毛生長。

本課題組前期采用CRISPR/Cas9技術(shù)對中國美利奴細(xì)毛羊的FGF5基因進(jìn)行InDel突變，成功獲得了一批相較于野生型細(xì)毛羊（即非轉(zhuǎn)基因正常細(xì)毛羊），其毛長和毛產(chǎn)量顯著提高的基因編輯羊[9]。為了評價(jià)FGF5基因突變后細(xì)毛羊的健康狀況，本研究比較分析了基因編輯羔羊和同齡野生型細(xì)毛羊羔羊的0、2、4、6、8月齡生長發(fā)育性狀，比較了周歲及成年的基因編輯羊與野生型羊的生理生化指標(biāo)，分析了周歲基因編輯羊、成年基因編輯羊以及成年野生型羊的直腸微生物群落結(jié)構(gòu)組成，旨在通過對基因編輯羊與野生型羊健康狀況的全面檢測分析，闡明FGF5基因編輯羊的生物安全性，為基因編輯動物安全評價(jià)相關(guān)法規(guī)政策的制定提供理論依據(jù)，推動FGF5基因編輯細(xì)毛羊的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

本實(shí)驗(yàn)所用FGF5基因編輯羊（genetically modified，GM）、野生型細(xì)毛羊（wild-type，WT）群體均飼養(yǎng)在新疆畜牧科學(xué)院生物技術(shù)研究所綿羊繁育基地，羊只飼養(yǎng)管理一致、體況健康、自由采食和飲水。挑選同一時(shí)期（相差不超過15 d）出生的FGF5基因編輯羔羊（GM，n=40）和野生羔羊（WT，n=25）用于生長發(fā)育性狀測定；分別選取成年羊（GM 54只，WT 22只）和羔羊（GM 36只，WT 13只）用作生理生化指標(biāo)檢測；隨機(jī)選取3組公羊用作直腸微生物群落分析，其中成年野生型羊（A組）8只、周歲FGF5基因編輯羊（B組）6只、成年FGF5基因編輯羊（C組）8只。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

一次性使用真空注血管（抗凝管）、一次性使用真空采血管（普通管），購自南昌市贛達(dá)醫(yī)療器械有限公司；大動物血清生化加強(qiáng)診斷試劑盒，購自天亮醫(yī)療器材股份有限公司；BC2800Vet全自動動物血液細(xì)胞分析儀、BS-180邁瑞全自動血清生化檢測儀，均為深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司的產(chǎn)品；臺式低速離心機(jī)TD-4M，為博科控股集團(tuán)有限公司的產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 羔羊生長發(fā)育性狀測定

分別在FGF5基因編輯羔羊和野生型羔羊的0、2、4、6、8月齡時(shí)，測量其體高、體斜長、胸圍和體重。具體方法如下：用尺子從測量羔羊的肩隆高到地面的垂直距離，即體高；肩胛前端至坐骨結(jié)節(jié)后端的直線距離，即體斜長；在肩胛骨后端，圍繞胸部一周的長度即胸圍。

1.3.2血液樣品采集及檢測

將羊只保定，采集約3 mL血液，立即分別注入含肝素鈉的抗凝采血管和無抗凝劑的采血管中。將抗凝血輕輕顛倒混勻，用于血常規(guī)測定。該樣品須在采血4 h內(nèi)進(jìn)行檢測；用于血清生化檢測的樣品需帶回實(shí)驗(yàn)室，3 000 r/min離心10 min后，吸出的血清送往檢測機(jī)構(gòu)進(jìn)行分析。血常規(guī)檢測和血清生化檢測均由新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所動物中心完成。

1.3.3 直腸糞便采集及測定

清洗羊只肛門后，戴上無菌手套從肛門伸入直腸，用手指將糞摳出。使用無菌培養(yǎng)皿接取直腸處糞樣，再移入50 mL無菌離心管中，封口后將盛有糞樣的離心管放入預(yù)先備好的冰袋上。樣品低溫運(yùn)送至北京諾禾致源生物科技有限公司，進(jìn)行16S rDNA微生物群落測序。

1.3.4 統(tǒng)計(jì)分析

GM羊與WT羊的生長性狀、生理生化指標(biāo)利用SPSS軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P<0.05表示差異顯著；直腸微生物群落測序結(jié)果利用諾禾致源生信分析云平臺對測序有效數(shù)據(jù)進(jìn)行OTU聚類和物種注釋、樣本復(fù)雜度分析、多樣本差異分析，同樣以P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 羔羊生長發(fā)育性狀分析

將FGF5基因編輯羔羊（GM，n=40）和野生羔羊（WT，n=25）分別于出生、2月齡、4月齡、6月齡和8月齡測定的體重、體高、胸圍和斜體長進(jìn)行了數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和比較。從表1結(jié)果顯示，GF5基因編輯羊與野生型羊的各項(xiàng)指標(biāo)隨羔羊月齡增長均呈上升趨勢，F(xiàn)GF5基因編輯羊與野生型羊不同月齡的各項(xiàng)生長性狀均無顯著差異（P>0.05）。

表1 羔羊的生長發(fā)育速度統(tǒng)計(jì)（平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）

2.2 血常規(guī)及血清生化結(jié)果

血常規(guī)檢測各項(xiàng)指標(biāo)中紅細(xì)胞數(shù)、血紅蛋白濃度、紅細(xì)胞壓積、平均紅細(xì)胞體積、平均血紅蛋白含量、平均血紅蛋白濃度和紅細(xì)胞體積分布寬主要檢測羊是否存在貧血；平均血小板體積、血小板分布寬度和血小板計(jì)數(shù)主要檢測羊是否存在血液疾??；白細(xì)胞數(shù)、淋巴細(xì)胞百分比、中性粒細(xì)胞百分比、嗜酸性粒細(xì)胞百分比和單核細(xì)胞百分比主要檢測羊是否存在炎癥及細(xì)菌病毒感染。血清生化檢測所選的加強(qiáng)診斷試劑盒中，針對羊的腎功能檢測項(xiàng)目有血尿素氮和肌酐，肝功能檢測項(xiàng)目有堿性磷酸酶、白蛋白和總蛋白，醣類代謝檢測項(xiàng)目有葡萄糖，電解質(zhì)檢測項(xiàng)目有鈉、鉀、無機(jī)磷、鈣。

分別對FGF5基因編輯羊與野生型對照羊的生理生化檢測結(jié)果進(jìn)行T檢驗(yàn)分析。結(jié)果顯示，不論是羔羊組還是成年組，F(xiàn)GF5基因編輯羊與野生細(xì)毛羊的血常規(guī)各項(xiàng)指標(biāo)以及血清生化各項(xiàng)指標(biāo)均無顯著差異（P>0.05），如表2和表3所示。

表2 FGF5基因編輯羊與野生細(xì)毛羊血常規(guī)指標(biāo)（平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）

表3 FGF5基因編輯羊與野生細(xì)毛羊血清生化指標(biāo)（平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）

2.3 直腸微生物群落分析

2.3.1 樣品測序結(jié)果及OTU分析

將直腸糞便送至北京諾禾致源生物科技有限公司進(jìn)行16S rDNA微生物群落測序。根據(jù)測序結(jié)果得出每個(gè)樣品至少產(chǎn)生174 476條有效數(shù)據(jù)，平均測序長度為409～413 bp。測序質(zhì)量值Q20%、Q30%分別達(dá)到98%和94%以上，GC含量在52%～55%之間，測序質(zhì)量合格。得到原始數(shù)據(jù)后以97 %的相似度作為一個(gè)OTU的劃分標(biāo)準(zhǔn)，對所有樣品的有效序列進(jìn)行聚類，對每個(gè)OTU的代表序列進(jìn)行物種注釋。共計(jì)得到了29個(gè)phylum（門），49個(gè)class（綱），99個(gè)order（目），181個(gè)family（科），344個(gè)genus（屬）和177個(gè)species（種）。

在門水平上（圖1），按照組（圖1a）和樣本個(gè)體（圖1b）分別展示，相對豐度較高的菌門均為Firmicutes（厚壁菌門）和Bacteroidetes（擬桿菌門），其次是Fibrobacteres（纖維桿菌門）、Verrucomicrobia（疣微菌門）、Proteobacteria（變形菌門）、Spirochaetes（螺旋體門）。以上菌門豐度占據(jù)總豐度96.2%以上，A、B、C、三組間無顯著差異。

圖1 羊直腸糞便菌群門水平的分布

在科水平上（圖2），按照組（圖2a）和樣本個(gè)體（圖2b）分別展示，在三組樣本中Ruminococcaceae（瘤胃菌科）、Ruminococcaceae（理研菌科）、Ruminococcaceae（克里斯滕森菌科）、Lachnospiraceae（毛螺旋菌科）、Prevotellaceae（普雷沃氏菌科）、Akkermansiaceae（疣微菌科）、Bacteroidaceae（擬桿菌科）是豐度最高的菌科。不論是基因編輯羊還是野生型羊的直腸微生物群落中Ruminococcaceae、Ruminococcaceae、Ruminococcaceae和Lachnospiraceae這四個(gè)菌科均占優(yōu)勢。

圖2 羊直腸糞便菌群科水平的分布

2.3.2 α多樣性分析

將所有樣本繪制稀釋曲線（圖3）和等級聚類曲線（圖4），每個(gè)圖中右上角標(biāo)出每個(gè)樣本所對應(yīng)的曲線顏色。在稀釋曲線圖3中，每個(gè)樣本使用對應(yīng)顏色的曲線表示，用來反映測序深度情況。橫坐標(biāo)代表了隨機(jī)抽取的測序條數(shù)，縱坐標(biāo)為根據(jù)測序條數(shù)量可構(gòu)建的OTU數(shù)量。如圖所示每個(gè)樣本的曲線已經(jīng)趨于平緩，說明測序數(shù)據(jù)量漸進(jìn)合理，增加測序深度和數(shù)據(jù)量只會產(chǎn)生少量新的物種，對觀測新的OTU的影響不大。在等級聚類曲線圖4中，每個(gè)樣本使用對應(yīng)顏色的折線表示。橫坐標(biāo)為OTUs豐度排序的序號，縱坐標(biāo)為對應(yīng)OTUs的相對豐度。如圖4所示，每個(gè)曲線在橫軸的寬度和在縱軸的平滑程度所反映的豐富度和均勻度差異不大，沒有陡峭曲線所反映的優(yōu)勢菌種。

圖3 樣本稀釋曲線

圖4 樣本等級聚類曲線

在分析樣本內(nèi)多樣性中，常用的α指數(shù)有Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)、Chao指數(shù)、Ace指數(shù)、Goods_coverage指數(shù)。其中用來反映菌群豐富度的有Chao指數(shù)和Ace指數(shù)；用來衡量群落多樣性的有Shannon指數(shù)以及Simpson指數(shù)；Goods_coverage指數(shù)則是用來反應(yīng)測序深度。為分析基因編輯羊與野生對照羊的群落差異和基因編輯羊成年與周歲間群落差異，按照A組（野生型成年羊）與C組（基因編輯成年羊），B組（基因編輯周歲羊）與C組（基因編輯成年羊）的分組模式進(jìn)行α多樣性指數(shù)組間差異分析Ttest檢驗(yàn)（表4），可以看到每組的Ace，Chao1，Simpson，Goods_coverge和Observed_species指數(shù)P值均大于0.05，均無顯著性差異。

表4 各指數(shù)組間T-test檢驗(yàn)結(jié)果

2.3.3 β多樣性分析

通過主成分分析（PCA分析）比較組間群落結(jié)構(gòu)差異。分析結(jié)果如圖5a所示，A組野生型成年羊?qū)?yīng)實(shí)心正方型，C組基因編輯成年羊?qū)?yīng)空心正方型，兩組各樣本分布趨勢較近，群落組成較相似。但存在個(gè)別偏離樣本，如C組的GM18022、GM18090；如圖5b所示，B組基因編輯周歲羊?qū)?yīng)實(shí)心正方型，C組基因編輯成年羊?qū)?yīng)空心正方型，兩組樣本間分布趨勢較近，群落組成較相似。但同樣存在偏離樣本，如C組的GM18090。在兩組比較中，GM18090個(gè)體都與主群較遠(yuǎn)，但其它個(gè)體無論是GM羊還是WT羊均聚為一類。

圖5 PCA分析

進(jìn)一步利用ANOSIM相似度分析進(jìn)行評價(jià)，計(jì)算A、B、C組間差異大小及顯著性。R-value是ANOSIM檢驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)量，介于-1和1之間。R-value大于0且越接近1，說明組間差異越大、組內(nèi)差異越?。籖-value小于0且越接近-1，說明組內(nèi)差異大于組間差異；當(dāng)R-value=0時(shí)，說明樣本的分組屬于隨機(jī)分配，分組無統(tǒng)計(jì)意義。統(tǒng)計(jì)分析的可信度用P-value表示，P<0.05表示統(tǒng)計(jì)具有顯著性。由表5可知，成年的基因編輯羊與野生型羊的組間比較（A-C）R-value為0.193說明分組具有統(tǒng)計(jì)意義，且P值為0.069大于0.05，組間差異不顯著；基因編輯羊成年與周歲的組間比較（B-C）R-value為-0.053，說明樣本分組屬于隨機(jī)分布，且P值為0.665大于0.05，組間差異不顯著。這說明基因編輯成年羊與周歲羊的直腸群落結(jié)構(gòu)基本無差別。提示，基因編輯羊的腸道微生物群落結(jié)構(gòu)與其年齡無關(guān)。

表5 ANOSIM結(jié)果

2.3.3 組間差異物種分析

LEfSe(LDA Effect Size)能夠在組與組之間尋找具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的Biomarker，從而能夠識別不同豐度的特征以及相關(guān)聯(lián)的類別。在閾值為3的情況下，從下圖6可以看出C組（基因編輯成年羊）的彎曲桿菌科（f_Campylobacteraceae）和彎曲桿菌屬（g_Campylobacter）為優(yōu)勢菌，均屬于革蘭氏陰性菌，常與綿羊腸胃炎等疾病相關(guān)；A組（野生型成年羊）的瘤胃菌屬（g_unidentified_Ruminococcaceae）和另枝菌屬（g_Alistipes）為優(yōu)勢菌。其中，瘤胃菌屬為腸道內(nèi)常見益生菌，另枝菌屬為革蘭氏陰性菌，與炎癥疾病相關(guān)菌。

圖6 LEfSe分析

為了進(jìn)一步證實(shí)基因編輯羊腸道群落與年齡無關(guān)，本實(shí)驗(yàn)又進(jìn)行了基因編輯羊不同年齡組的LEfSe分析。在閾值設(shè)為3的情況下，沒有找到具有顯著差異的Biomarker。

LDA值分布柱狀圖中展示了LDA Score大于設(shè)定值3的物種，即組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的Biomarker。展示了不同組中豐度差異顯著的物種，柱狀圖的長度代表差異物種的影響大?。礊長DA Score）。

3 討 論

轉(zhuǎn)基因動物的健康評估一直是轉(zhuǎn)基因動物安全評價(jià)最重要的組成部分之一。目前我國對轉(zhuǎn)基因動物健康狀況評價(jià)一般分為表型評價(jià)和非表型評價(jià)[10]。首先對轉(zhuǎn)基因動物的表型如外貌、行為、生長發(fā)育速度等進(jìn)行評價(jià)；其次對已知表型健康的轉(zhuǎn)基因動物進(jìn)行生理學(xué)檢測、腸道微生物檢測、生殖激素檢測等一系列技術(shù)手段對其進(jìn)行非表型評價(jià)。為此，本研究采用了生長發(fā)育性狀檢測、生理生化指標(biāo)檢測以及直腸微生物群落結(jié)構(gòu)分析對FGF5基因編輯羊進(jìn)行綜合性健康評估分析。

血液生理生化指標(biāo)能在不同程度上反映出器官功能的變化及疾病的發(fā)生與發(fā)展情況，對了解動物的生理狀態(tài)具有重要意義。血常規(guī)通常檢測紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板等多項(xiàng)指標(biāo)。其中紅細(xì)胞具有黏附、殺傷抗原，清除免疫復(fù)合物，參與集體免疫調(diào)控等作用，其功能發(fā)揮主要靠血紅蛋白[11]；白細(xì)胞包含淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞等，是動物血液中極為重要的免疫細(xì)胞。可以很大程度上反映動物是否存在炎癥及細(xì)菌病毒感染；血小板等參數(shù)在正常范圍內(nèi)是恒定的，對炎癥反應(yīng)、傷口愈合、血栓形成等生理過程中具有重要作用[12]。血清生化指標(biāo)可以反映動物機(jī)體的健康情況。如肝功能損害型疾病可檢測血清中的白蛋白、白蛋白和堿性磷酸酶；腎功能疾病可檢測血清中的血尿素氮和肌酐[13]；葡萄糖水平檢測間接反映動物胰島功能[14]；血清中的無機(jī)鹽電解質(zhì)檢測也可以反映動物的多項(xiàng)生理功能。本研究比較了基因編輯羊與野生對照羊的成年時(shí)期和幼年時(shí)期的生理生化檢測結(jié)果，其血常規(guī)檢和血清生化檢測的各項(xiàng)參數(shù)均沒有差異。揭示了FGF5基因的突變未對細(xì)毛羊的健康產(chǎn)生影響。這與蔡文濤[15]對轉(zhuǎn)ATⅢ基因、轉(zhuǎn)IFNβ基因、轉(zhuǎn)HBs Ag基因山羊與非轉(zhuǎn)基因山羊檢測的生理學(xué)指標(biāo)相似的結(jié)果一致。

腸道微生物群落對機(jī)體的免疫功能、消化功能和抗病力等有著重要的影響。在轉(zhuǎn)基因動物健康評估實(shí)驗(yàn)中，可以通過糞便間接獲取機(jī)體的腸道微生物群落結(jié)構(gòu)，從而反映機(jī)體的營養(yǎng)代謝水平。此外，腸道微生物群落還會受到許多其它因素的影響，比如動物年齡[16]、動物健康[17]和飼養(yǎng)模式[18]等。因此，本研究分別比較在同一飼養(yǎng)模式下基因編輯羊的成年與周歲之間的腸道群落差異和均已成年的基因編輯羊與野生對照羊的腸道群落差異。從結(jié)果來看，基因編輯羊與野生對照羊的腸道群落基本無明顯差異。李隴平[19]等人利用CRISPR/Cas 9介導(dǎo)的MSTN/FGF5基因編輯陜北白絨山羊與野生對照羊的腸道糞便菌群分析中發(fā)現(xiàn)，兩者之間不存在顯著差異，這與本研究結(jié)果一致；而在不同年齡的分組比較下，基因編輯羊的腸道群落也不存在差異，但其個(gè)體分組屬于隨機(jī)分布。由此推測，周歲基因編輯羊的腸道發(fā)育已經(jīng)完善，與成年羊基本無差別，但還需進(jìn)一步證實(shí)。從LEfSe分析結(jié)果看到，基因編輯羊具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的微生物標(biāo)志物為彎曲桿菌科和彎曲桿菌屬，彎曲桿菌可與宿主共生或致病，是世界上從細(xì)菌角度引起胃腸炎的最常見病因。目前還未有報(bào)道解釋內(nèi)源基因的改造與腸道內(nèi)彎曲桿菌增多之間是否有關(guān)。在野生型對照羊的微生物標(biāo)志物中，瘤胃菌屬為腸道內(nèi)常見益生菌，而另枝菌屬為革蘭氏陰性菌是一種較新的細(xì)菌屬，常與炎癥疾病相關(guān)。然而，上述四種菌均屬于反芻動物腸道內(nèi)的常見菌。說明FGF5功能的缺失未改變細(xì)毛羊腸道微生物菌群的總體結(jié)構(gòu)。

4 結(jié) 論

本研究分析結(jié)果初步證實(shí)，F(xiàn)GF5基因功能的缺失并未對羔羊的生長發(fā)育速度造成影響。FGF5基因編輯羊和野生對照羊的生理生化各項(xiàng)指標(biāo)和腸道微生物群落無顯著差異。FGF5基因編輯羊自身健康狀況良好，為轉(zhuǎn)基因動物生物安全評價(jià)奠定基礎(chǔ)，推動了FGF5基因編輯細(xì)毛羊的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。