牛肉中頭孢喹肟殘留的HPLC檢測方法的研究

阿力騰才斯克，盧 琳

（新疆維吾爾自治區(qū)獸藥飼料監(jiān)察所，烏魯木齊830063）

頭孢喹肟是一種動(dòng)物專用第四代頭孢類抗生素，抗菌譜廣、抗菌活性強(qiáng)并對β內(nèi)酰胺酶高度穩(wěn)定而被廣泛用于豬、牛呼吸道細(xì)菌性感染、急性乳房炎疾病的臨床治療，以提高藥物療效。畜禽養(yǎng)殖業(yè)是應(yīng)用抗生素的主要領(lǐng)域之一，降低畜禽的發(fā)病率與死亡率，促進(jìn)生長和提高健康養(yǎng)殖方面發(fā)揮著主要作用，但使用不當(dāng)危害很大。畜禽糞便通過施肥方式進(jìn)入土壤環(huán)境中，導(dǎo)致獸用抗生素從畜禽體到土壤和水環(huán)境轉(zhuǎn)移，對環(huán)境微生物形成持續(xù)性的誘導(dǎo)和篩選壓力從而導(dǎo)致獸用抗生素性基因的污染風(fēng)險(xiǎn)，對人類造成直接或間接的傷害，是人們面臨的巨大威脅。因此我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部對獸用抗生素頭孢喹肟在動(dòng)物源性食品中的最高殘留量（MRL）做出了嚴(yán)格規(guī)定。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀（Waters公司,紫外檢測器），高速冷凍離心機(jī)（德國sigma公司），（插入）EYELA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，Sartorius分析天平:（感量0.00001 g），渦旋混勻器，DELTA 320 pH計(jì)（METTLER公司）。對照品硫酸頭孢喹肟來源：德國Dr.Ehrenstorfer公司，含量93.9%，批號：G130285。HLB固相萃取柱（60 mg/3 mL），微孔過濾膜0.45 μm，移液器。試劑：高氯酸，乙腈為色譜純；正丙醇，正己烷，甲醇[1]。

1.2 溶液配制

1.2.1 對照溶液的配制

頭孢喹肟標(biāo)準(zhǔn)儲備液（1 mg/mL）:精確稱取硫酸頭孢喹肟對照品11.85 mg置于10 mL容量瓶中用50%乙腈水溶液溶解并稀釋至刻度，得到1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液。4℃保存，有效期1個(gè)月[2]。

頭孢喹肟標(biāo)準(zhǔn)工作液（2 μg/mL）:精確量取1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液0.1 mL置于50.0 mL容量瓶中用50%乙腈水溶液稀釋至刻度。

1.2.2 高氯酸-磷酸緩沖液

取濃磷酸3.4 mL，緩慢加適量的水稀釋再加入高氯酸鈉3.45 g，用三乙胺調(diào)至pH 3.6，用水定容至1 000 mL。

1.2.3 50%乙腈水溶液

取乙腈50 mL，用水稀釋至刻度100 mL，混勻。

1.2.4 5%乙腈水溶液

取乙腈5 mL，用水稀釋至刻度100 mL，混勻。

1.2.5 流動(dòng)相

0.1%甲酸：乙腈（88：12，V/V）[3]。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 方法原理試樣中殘留的頭孢喹肟經(jīng)高氯酸鈉緩沖液及乙腈混合提取，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后加水復(fù)溶，HLB固相萃取柱凈化，流動(dòng)相洗脫后經(jīng)高效液相色譜測定，并借助外標(biāo)法完成定量。

1.3.2 色譜條件色譜柱為Waters XTerr MS C18(4.6×250 mm)粒徑5 μm，柱溫35℃；流動(dòng)相為0.1%甲酸：乙腈（88：12，V/V），流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量50 μL，紫外檢測器，檢測波長270 nm。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍

無誤稱量2 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)工作液0.05 mL、0.25 mL、0.5 mL、1.5 mL、2.5 mL分別置于10.0 mL容量瓶中。濃度為10、50、100、300、500 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)液。將其一次上機(jī)測定，以峰面積與對應(yīng)的質(zhì)量濃度做出相應(yīng)的曲線見圖1，展開回歸分析。

1.3.4 牛肉組織樣品的提取

無誤量取均勻的牛肉組織試料4.0 g，并將其放進(jìn)50 mL具塞離心管內(nèi)，加入高氯酸-磷酸緩沖液2 mL，乙腈10 mL，渦旋混勻，震蕩8 min,10 000 r/min離心5 min，取上清液于茄形瓶中，再按上述步驟重復(fù)提取一次，合并兩次上清液，加正丙醇5 mL，在40℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)近干。殘?jiān)屑尤胨?0 mL溶解至，再加正己烷5 mL，渦旋混勻。轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，4℃下10 000 r/min離心8分鐘，取下層清液備用[4]。

1.3.5 凈化

HLB小柱一次用甲醇2 mL和水2 mL活化，備用液全部過柱，再依次用水5 mL和5%乙腈水溶液5 mL洗滌，抽干后用流動(dòng)相2.0 mL洗脫，收集于10 mL玻璃試管中，渦旋混勻后過0.45 μm微孔濾膜，共高效液相色譜測定。

1.3.6 方法準(zhǔn)確度和精密度

分別精密量取含有頭孢喹肟2 000 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)工作液0.02 mL，0.1 mL，0.2 mL，0.4 mL，1 mL加入4 g空白牛肉樣品中，制成頭孢喹肟為10、50、100、200，500 ng/g五個(gè)濃度相異的添加樣品，各濃度5個(gè)平行樣，重復(fù)5批次，將回收率算出。

1.3.7 靈敏度的測定

將頭孢喹肟標(biāo)準(zhǔn)工作液適量加入4 g空白牛肉組織樣品中，制成頭孢喹肟為10、15、25 μg/kg三個(gè)濃度相異的添加樣品，處理好之后，取50 μL進(jìn)樣分析，從而對檢測限、定量限加以清晰明確。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

在頭孢喹肟濃度為10～500 ng/mL的時(shí)候，峰面積和濃度具有較佳的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R=0.999969，線性方程是Y=3.45×106+6.02×103。標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.2 回收率與精密度

從表1數(shù)據(jù)可見，出頭孢喹肟在空白牛肉樣品力的回收率都在60%以上，批間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均≤20%，與有關(guān)規(guī)定相符[5]。

表1 頭孢喹肟藥物在牛肉中回收率和精密度的測定結(jié)果（n=5）

2.3 液相色譜圖

50 ng/mL頭孢喹肟標(biāo)準(zhǔn)品、試劑空白、牛肉樣品空白、50 ng/g陽性添加樣品的色譜圖如圖2、3、4、5。

圖2 添加50 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)品圖譜

通過色譜圖可以看出，圖2中在5.309 min處為頭孢喹肟的色譜峰，圖3試劑空白圖譜和圖4牛肉樣品空白譜圖在允許保留時(shí)間段內(nèi)均未出峰，說明所用試劑和空白樣品無污染。圖5牛肉空白樣品添加回收色譜圖中5.435 min處出現(xiàn)色譜峰，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品出峰保留時(shí)間可以判斷其為頭孢喹肟的色譜峰。

圖3 試劑空白圖譜

圖5 牛肉空白樣品添加回收（50 ng/g）陽性色譜圖

2.4 檢測方法的靈敏度

按1.3.4和1.3.5項(xiàng)方法處理，當(dāng)添加濃度25 μg/kg頭孢喹肟，測得頭孢喹肟藥物的信噪比s/n/<25,說明方法的檢測限可至25 μg/kg[6]。

3 討 論

3.1 紫外檢測器的選擇

對頭孢喹肟的標(biāo)準(zhǔn)溶液做紫外吸收分析，從吸光度數(shù)據(jù)可知，頭孢喹肟的最大系數(shù)出現(xiàn)在270 nm波長位置[7]。

3.2 提取溶劑的挑選

在提取藥物期間，將提取液擬定為有機(jī)溶劑，譬如乙腈、丙酮、甲醇等，通過數(shù)次實(shí)驗(yàn)探索嘗試之后，最終決定將提取劑選定為乙腈、高氯酸鈉緩沖液。

3.3 正己烷的運(yùn)用

在提取脫脂期間，分別對異辛烷、正己烷的脫脂效果展開對比，結(jié)果法案使用其中的后者脫脂之后，溶液的雜質(zhì)相對更少一些，這對目標(biāo)物的檢測十分有利，具有較佳的成效[8]。

3.4 提取液濃縮

在提取期間，需借助旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)來對提取液進(jìn)行濃縮，在濃縮的時(shí)候要防止蒸干，一旦全部蒸干，那么樣品就會被吸附于雞心瓶內(nèi)壁，從而導(dǎo)致回收率受到干擾，所以僅需濃縮至最小體積[9]。

4結(jié) 論

通過高效液相色譜-紫外檢測法對牛肉組織中頭孢喹肟藥物的殘留量進(jìn)行測定，此方法簡單易行、無誤性高、回收率高，檢測限亦可達(dá)成相應(yīng)的要求，而且值得信賴。所以，本文所建立的頭孢喹肟在牛肉組織中的殘留檢測方法從技術(shù)層面為以后該藥的殘留監(jiān)控進(jìn)行有力支持，這對提高牛肉食品的質(zhì)量、保障消費(fèi)者健康都具有重要的意義[10]。