培本固疏方對去卵巢大鼠炎性因子、骨生物力學(xué)及JNK/p38信號通路的影響

李佳洋，沈沐瑤，孫菁，王馨詣，郭海英*，徐道明，朱媛媛

（1. 南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210023；2. 鹽城第一人民醫(yī)院，江蘇 鹽城 224006；3. 南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210029；4. 南通第六人民醫(yī)院，江蘇 南通 226001）

骨質(zhì)疏松（osteoporosis，OP）是一種常見的全身性骨病，其表現(xiàn)為骨量下降、骨微結(jié)構(gòu)破壞，進而導(dǎo)致骨脆性增加，易發(fā)生骨折［1］，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松（postmenopausal osteoporosis，PMOP）主要病因為雌激素的缺乏［2］，本病嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。由于西藥治療骨質(zhì)疏松存在一定不良反應(yīng)，開展中醫(yī)藥治療骨質(zhì)疏松的研究具有一定意義，目前對OP的中醫(yī)療法多以滋補肝腎等治法為主，本課題組結(jié)合“絡(luò)病學(xué)說思想”提出“正虛絡(luò)瘀”的骨質(zhì)疏松病機關(guān)鍵，并確立了“培本補元、通絡(luò)固疏”的治則。培本固疏方在臨床中治療骨質(zhì)疏松療效較佳。本研究通過去卵巢法建立絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松模型，觀察培本固疏方對其骨生物力學(xué)指標(biāo)、血清炎性因子、JNK/p38通路的影響，以探索培本固疏方治療PMOP的機制。

1 材料與方法

1.1 動物

健康6 月齡未孕SPF 級雌性SD 大鼠36 只，體質(zhì)量（290 ± 20）g，購于上海西普爾-必凱公司，許可證：SCXK（滬）2018-0006。本實驗大鼠飼養(yǎng)在南京中醫(yī)藥大學(xué)清潔級動物實驗中心，經(jīng)過南京中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗倫理委員會監(jiān)督并批準(zhǔn)，倫理號：201905A002。

1.2 藥物與試劑

以人的6.3倍用量計算大鼠用藥等效劑量，制備藥物。于南京中醫(yī)藥大學(xué)百草堂購入人參、龜甲、鹿角、仙桃草，按比例配伍煎煮濃縮制成相應(yīng)生藥濃度的制劑，低、中、高劑量組分別為1.060 5、2.121、4.242 g/mL；阿侖膦酸鈉（阿拉?。┡c相應(yīng)量生理鹽水配制成相應(yīng)濃度的溶液（0.21 mg/mL）；青霉素G鈉鹽（索萊寶）；水合氯醛（阿拉丁）；大鼠TNF-α、大鼠IL-1β 試劑盒（翼飛雪）；JNK、p38抗體（abcam）。

1.3 研究方法

1.3.1 模型建立

用去卵巢法獲得PMOP 大鼠模型。將SD 大鼠隨機分為兩組假手術(shù)組（Sham，n= 6）與手術(shù)組（OVX，n=30）。過程于無菌環(huán)境操作，麻醉后固定大鼠使其呈俯臥位，OVX 組在雙側(cè)背部做切口，翻出卵巢并切除，分層縫合。Sham 組同樣在雙側(cè)背部切口，但不切除卵巢，而是僅切除卵巢旁少量脂肪。手術(shù)后給予后肢肌內(nèi)注射青霉素8萬U/只，密切觀察7 d。

1.3.2 分組及干預(yù)

將OVX 組大鼠隨機分為5 組，每組6 只，即模型組（Model）、培本固疏方低劑量組（Low）、培本固疏方中劑量組（Medium）、培本固疏方高劑量組（High）和阿侖膦酸鈉組（Alen）。大鼠常規(guī)飼養(yǎng)，每2 周進行稱重。手術(shù)后第5 周開始對大鼠分組干預(yù)，各組均連續(xù)灌胃8 周。假手術(shù)組與模型組均給予生理鹽水1 mL/200 g；培本固疏方低、中、高劑量組分別給予培本固疏方低、中、高劑量制劑1 mL/（200 g·d）（中劑量組相當(dāng)于人類臨床用量100 g 生藥/d）；阿侖膦酸鈉組給予阿侖膦酸鈉 溶 液1 mL/（200 g·d）（相 當(dāng) 于 人 類 臨 床 用 量10 mg/d）。

1.3.3 標(biāo)本采集及測定

大鼠末次給藥結(jié)束，禁食24 h 后稱重、取材，麻醉方法同造模，腹主動脈抽血處死，收集標(biāo)本。MEIX-90 雙能X 線骨密度儀檢測L5腰椎密度；三點彎曲試驗儀檢測左側(cè)股骨屈服載荷、斷裂載荷、剛度；HE切片染色法觀察右側(cè)股骨微結(jié)構(gòu)；ELISA 法檢測血清TNF-α、IL-1β；Western Blot 法檢測右側(cè)股骨JNK、p38。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

本實驗結(jié)果均為定量資料，采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，用SPSS 22.0進行統(tǒng)計。組間比較采用單因素方差分析，若方差齊，組間多重比較采用LSD 法，若方差不齊，組間多重比較采用tamhane 法，P≤0.05 為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 骨密度

與假手術(shù)組相比，模型組L5腰椎骨密度顯著降低（P＜0.01）；與模型組相比，低劑量組骨密度上升，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，培本固疏方中、高劑量組與阿侖膦酸鈉組骨密度均顯著升高（P＜0.01），三者間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表1和圖1。

表1 各組去卵巢大鼠L5腰椎骨密度的影響比較（±s）

表1 各組去卵巢大鼠L5腰椎骨密度的影響比較（±s）

注：與Sham比較，#P ＜0.01；與Model比較，*P ＜0.01。

組別Sham Model Low Medium High Alen n 6 6 6 6 6 6 BMD（g/cm2）0.270±0.028 0.205±0.018#0.207±0.013 0.253±0.028*0.255±0.023*0.267±0.052*

圖1 各組去卵巢大鼠L5腰椎骨密度的影響比較

2.2 骨生物力學(xué)

與假手術(shù)組相比，模型組屈服載荷、斷裂載荷、剛度均顯著降低（P＜0.01）；與模型組相比，低、中、高劑量組、阿侖膦酸鈉組的屈服載荷均顯著上升（P＜0.01）；低、中劑量組斷裂載荷上升但無統(tǒng)計學(xué)意義，高劑量組、阿侖膦酸鈉組斷裂載荷顯著上升（P＜0.01，P＜0.001）；低、高劑量組剛度上升但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，中劑量組、阿侖膦酸鈉組斷裂載荷均上升（P＜0.05）。見表2和圖2。

首先，從表中可以看到在《中國日報》和《紐約時報》中出現(xiàn)最多的是物質(zhì)過程、關(guān)系過程和言語過程。這三個過程主要是一種客觀的描述，這也間接反映了新聞報道的客觀性與真實性。

圖2 各組去卵巢大鼠股骨生物力學(xué)的影響比較

表2 各組去卵巢大鼠股骨生物力學(xué)的影響比較（±s，n=6）

表2 各組去卵巢大鼠股骨生物力學(xué)的影響比較（±s，n=6）

注：與Sham 比較，#P ＜0.01；與Model 比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01，***P ＜0.001。

組別Sham Model Low Medium High Alen屈服載荷（N）97.500±4.970 56.833±7.305#69.833±2.639 75.167±1.941**82.167±3.125**90.000±1.673**斷裂載荷（N）123.000±5.933 94.167±9.827#99.167±9.827 103.667±7.062 111.000±14.199**116.667±7.501***剛度0.341±0.043 0.219±0.063#0.257±0.051 0.278±0.025*0.273±0.066 0.295±0.033*

2.3 骨組織形態(tài)學(xué)

假手術(shù)組骨組織結(jié)構(gòu)完整，大量成熟骨組織，骨小梁（TB）粗細(xì)均勻，結(jié)構(gòu)完整，排列致密有序；模型組骨小梁可見面積減少，分布錯亂且有斷裂、暴露骨髓腔（BM）現(xiàn)象；各個干預(yù)組骨小梁逐漸完整，且培本固疏方各組療效與濃度相關(guān)，高劑量優(yōu)于中、低劑量；阿侖膦酸鈉組骨組織結(jié)構(gòu)完整，骨細(xì)胞排列較整齊，骨小梁致密，形態(tài)結(jié)構(gòu)改善，連續(xù)性好。見圖3。

圖3 各組去卵巢大鼠骨微結(jié)構(gòu)的影響比較（HE，×200）

2.4 血清TNF-α、IL-1β

與假手術(shù)組相比，模型組血清TNF-α、IL-1β 含量顯著升高（P＜0.01），與模型組相比，低劑量組含量降低但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，其他各藥物組大鼠血清中TNF-α、IL-1β 含量顯著降低（P＜0.01），其中培本固疏方中劑量組、高劑量組與西藥組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表3和圖4。

圖4 各組去卵巢大鼠血清TNF-α、IL-1β的影響比較

表3 各組去卵巢大鼠血清TNF-α、IL-1β的影響比較（±s，n=6）

表3 各組去卵巢大鼠血清TNF-α、IL-1β的影響比較（±s，n=6）

注：與Sham比較，#P ＜0.01；與Model比較，*P ＜0.01。

組別Sham Model Low Medium High Alen TNF-α（ng/L）23.870±4.516 145.302±5.169#98.015±4.207 75.520±7.668*38.103±6.173*28.920±4.585*IL-1β（ng/L）6.388±0.901 35.501±3.258#28.150±2.392 19.125±1.583*9.750±0.972*9.139±0.975*

2.5 骨組織JNK、p38

與假手術(shù)組相比，模型組右側(cè)股骨組織中JNK、p38 蛋白表達量均升高（P＜0.05），與模型組相比，低劑量組骨組織JNK 含量降低但無統(tǒng)計學(xué)意義，中、高劑量組、阿侖膦酸鈉組骨組織JNK 含量均有所下調(diào)（P＜0.05），低、中劑量組骨組織p38 含量下降但無統(tǒng)計學(xué)意義，高劑量組、阿侖膦酸鈉組骨組織p38 含量下降（P＜0.05）。見表4和圖5。

圖5 各組去卵巢大鼠骨組織JNK、p38的影響比較

表4 各組去卵巢大鼠骨組織JNK、p38的影響比較（±s，n=6）

表4 各組去卵巢大鼠骨組織JNK、p38的影響比較（±s，n=6）

注：與Sham比較，*P ＜0.05；與Model比較，#P ＜0.05。

組別Sham Model Low Medium High Alen JNK 0.250±0.095 1.057±0.190*1.000±0.400 0.803±0.199#0.687±0.129#0.457±0.101#p38 0.180±0.104 1.033±0.351*0.640±0.030 0.622±0.458 0.503±0.116#0.287±0.130#

3 討論

PMOP與雌激素缺乏的關(guān)系較緊密［2］，炎性反應(yīng)是骨質(zhì)疏松病理過程的重要機制。中醫(yī)藥療法由于療效較佳與不良反應(yīng)少等優(yōu)勢，日漸被患者群體所接受［3］。本病主要以腎脾虧虛為本，兼以肝郁、痰凝、血虛等［4］。《讀醫(yī)隨筆》［5］中論述：“經(jīng)絡(luò)之中，必有推蕩不盡之瘀血……元氣終不能復(fù)”，說明久虛當(dāng)兼見血瘀，進而導(dǎo)致元氣虧虛。筆者針對老年人的生理特點，提出PMOP“正虛絡(luò)瘀”的中醫(yī)病機，自擬固本培元、祛瘀固疏的培本固疏方治療。培本固疏方組方為人參、鹿角、龜甲、仙桃草，臨床療效較好，但其治療OP的機制尚未發(fā)掘。人參具有抗炎、抗氧化作用，可抑制破骨細(xì)胞增殖，抑制骨吸收［6-7］，在骨質(zhì)疏松治療中，人參常組成復(fù)方應(yīng)用。龜甲與鹿角是較常用的補腎中藥，林嘉輝等［8］發(fā)現(xiàn)龜鹿聯(lián)合用藥，可下調(diào)豚鼠軟骨細(xì)胞的JNK、p38 水平，使其凋亡得到抑制。目前對于仙桃草應(yīng)用于骨質(zhì)疏松的研究較少，但其有效成分中槲皮素、木犀草素等已被證實具有抗骨質(zhì)疏松能力，高壓氧聯(lián)合仙桃草可促進鈣沉積，促進成骨細(xì)胞的分化［9］。因此筆者推測，培本固疏方治療骨質(zhì)疏松，是通過調(diào)節(jié)炎性因子，調(diào)控JNK/p38通路進行的。

c-jun 氨基活化激酶通路（JNK）、p38 絲裂原蛋白活化激酶通路（p38）是MAPK 通路的兩大組成部分，與OP 進程相關(guān)，可被IL-1、TNF-α 激活，產(chǎn)生級聯(lián)反應(yīng)，JNK（MEKK1/TAK1-MEK47-p-JNK-c-Jun，

CaMK，Semaphorin-3D……），p38（TAK1-MEK3/6-p-p38-NFATc1，MITF，TRAP，CTSK，p65，RANK，STAT1，MIG，MK2），進而誘導(dǎo)破骨前體細(xì)胞分化，導(dǎo)致骨量下降［10］。

骨生物力學(xué)性能是評價骨骼質(zhì)量的有力指標(biāo)［22］。三點彎曲實驗中，骨骼受載荷外力作用而產(chǎn)生位移，彈性階段中，骨組織位移隨載荷呈線性成比例增加，撤銷載荷后骨組織可恢復(fù)原狀態(tài)，屈服載荷指彈性階段所能承受的最大載荷。而塑性階段骨組織已產(chǎn)生結(jié)構(gòu)上的損壞而永久性的變形，當(dāng)載荷達到極限程度，骨組織發(fā)生斷裂而產(chǎn)生骨折，斷裂載荷指骨斷裂前所能承受的最大載荷。剛度是反映骨組織抵抗變形的能力，用彈性階段的“載荷-位移曲線”的斜率來表示，當(dāng)斜率越大，骨組織受力產(chǎn)生的位移越小，說明骨強度越大。

目前，PMOP 的國內(nèi)外研究中，去卵巢大鼠為學(xué)術(shù)界公認(rèn)且較多使用的造模方式，而動物模型的造模干預(yù)持續(xù)時長并無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，多使用3～6 月齡雌性未孕大鼠，且6月齡大鼠的PMOP 模型復(fù)制效果優(yōu)于3月齡大鼠，研究持續(xù)時間多為2～3 個月［23］。鄧琳課題組［24］的研究發(fā)現(xiàn)，去卵巢大鼠的腰椎骨密度較對照組從第6 周即開始下降但無統(tǒng)計學(xué)意義，第10 周測量發(fā)現(xiàn)去勢組骨密度較對照組降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。此外，有研究認(rèn)為術(shù)后8 周血清骨代謝指標(biāo)即出現(xiàn)改變，術(shù)后12 周變化更加突出［25］。本研究在保證造模效果的前提下，綜合考慮實驗成本、結(jié)果準(zhǔn)確性、大鼠骨形成周期等因素，選取了手術(shù)后4 周后為干預(yù)開始節(jié)點，持續(xù)干預(yù)8周后測取實驗數(shù)據(jù)。

本研究結(jié)果顯示，低劑量培本固疏方對大鼠未產(chǎn)生明顯的骨質(zhì)疏松改善作用，而中劑量組與高劑量組大鼠骨密度明顯提高，同時骨生物力學(xué)反映了各中藥劑量組均能不同程度地改善模型大鼠的骨骼質(zhì)量，染色切片顯示其骨微結(jié)構(gòu)明顯改善，證實了培本固疏方對骨質(zhì)疏松大鼠的治療效果。筆者進一步檢測了大鼠血清中炎性標(biāo)志因子TNF-α、IL-1β 與骨組織JNK、p38蛋白的含量，發(fā)現(xiàn)培本固疏方中、高劑量組可以顯著下調(diào)大鼠TNF-α、IL-1β、JNK和p38的含量。

綜上所述，本研究建立了大鼠PMOP 模型，模型組大鼠骨密度降低，骨生物力學(xué)指標(biāo)下降，病理切片見骨小梁排列稀疏、不規(guī)律，提示造模成功，其發(fā)病機制與JNK/p38 通路上調(diào)，TNF-α、IL-1β 異常分泌有關(guān)。通過培本固疏方治療后，中藥各劑量組大鼠骨密度增加，載荷能力、剛度明顯提高，同時血清中炎性因子TNF-α、IL-1β 含量減低，骨組織中JNK、p38 蛋白表達水平下調(diào)。說明培本固疏方治療OP，可能是通過抑制TNF-α、IL-1β 而實現(xiàn)的，JNK/p38 通路在當(dāng)中起到重要作用。