基于HPLC指紋圖譜的白芍及酒白芍比較分析△

楊艷玲，劉彩鳳，黃嘉怡，楊海菊，李花花，杜守穎，白潔

北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，北京 102488

白芍始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為毛茛科植物芍藥Paeonia lactifloraPall.的干燥根，性微寒，味微苦、酸，具有養(yǎng)血調(diào)經(jīng)、斂陰止汗、柔肝止痛、平抑肝陽等功效[1]。現(xiàn)代研究表明，白芍所含的化學(xué)成分有單萜類、三萜類、黃酮類、鞣質(zhì)、多糖等化合物[2]，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、保肝、抗氧化等多種藥理作用[3-6]?！吨腥A人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2020 年版白芍項(xiàng)下收載了炒白芍、酒白芍2 種炮制品，炒白芍長于養(yǎng)血斂陰，酒白芍長于緩急止痛、緩和酸寒之性[7]。宋代《扁鵲心書》中首次出現(xiàn)白芍“酒炒”炮制[8]，一直沿用至今。與炒白芍相比，酒白芍的炮制工藝有更多的影響因素，如黃酒用量、浸潤時(shí)間等?！吨袊幍洹?020 年版規(guī)定，白芍酒炒時(shí)每100 kg 飲片的黃酒用量為10～20 kg，但并未規(guī)定具體的工藝參數(shù)，如溫度、時(shí)間等。酒白芍炮制工藝的常用評(píng)價(jià)指標(biāo)為芍藥苷含量，但不同研究者篩選出的最佳炮制條件不完全相同[9-10]。酒炒會(huì)使芍藥苷含量降低，也會(huì)使其他成分如多糖、苯甲酸等的含量發(fā)生變化，從而影響白芍的藥效[11-12]。只以芍藥苷作為指標(biāo)性成分往往過于單一，難以反映中藥整體成分群的變化。因此，對(duì)酒白芍整體質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)，比較酒炒前后的變化，有利于酒白芍的質(zhì)量控制及炮制工藝的研究。

指紋圖譜具有整體性、模糊性的特點(diǎn)，中藥成分復(fù)雜，采用指紋圖譜技術(shù)可以充分反映中藥中化學(xué)成分的整體狀況，適合中藥整體質(zhì)量控制，同時(shí)結(jié)合指標(biāo)性成分含量測定和出膏率，有利于從多指標(biāo)角度比較生品與炮制品的區(qū)別[13-14]。白芍藥材主要為栽培品，主產(chǎn)于安徽亳州、四川中江、浙江磐安和山東菏澤[15-16]。為了比較白芍酒炒前后的變化，且考慮到白芍多以水煎液入藥，本實(shí)驗(yàn)選擇安徽亳州、四川中江、浙江磐安3 個(gè)主產(chǎn)地的白芍樣品，建立了白芍及炮制得到的酒白芍水煎液的指紋圖譜，對(duì)其進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)。芍藥苷是白芍中的主要活性成分，所以同時(shí)選擇芍藥苷含量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，結(jié)合炮制前后出膏率變化，對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)的質(zhì)量研究。

1 材料

1.1 儀器

U3000型高效液相色譜儀（DAD檢測器、CM 7.2色譜工作站，賽默飛世爾科技中國有限公司）；QE-200 型高速萬能粉碎機(jī)（浙江屹立工貿(mào)有限公司）；BSA 224S型電子分析天平、BT 125D型電子分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司）；JM-B10002型電子天平（余姚市及紀(jì)銘稱重校驗(yàn)設(shè)備有限公司）；HH-6型電熱恒溫水浴鍋（北京科偉永興儀器有限公司）；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；DZF-6051型真空干燥器（北京利康達(dá)圣科技有限公司）。

1.2 試藥

對(duì)照品芍藥苷（批號(hào)：110736-201842，純度：97.4%，中國食品藥品檢定研究院）；水為娃哈哈純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司）；甲醇、乙腈、磷酸為色譜純（美國Thermo Fisher Scientific公司）。

白芍及酒白芍均由億帆醫(yī)藥股份有限公司提供，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院劉春生教授鑒定為毛茛科植物芍藥Paeonia lactifloraPall.的干燥根及炮制品，詳細(xì)信息見表1。

表1 白芍及酒白芍來源

2 方法與結(jié)果

2.1 酒白芍的制備

依據(jù)《中國藥典》2020 年版標(biāo)準(zhǔn)，取白芍樣品，加黃酒拌勻，悶透，置炒制容器內(nèi)，用文火炒至規(guī)定的程度時(shí)，取出，放涼[1]。每100 kg白芍用黃酒15 kg，文火炒至微黃色。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取芍藥苷對(duì)照品11.14 mg，置于25 mL量瓶中，加甲醇制成質(zhì)量濃度為445.60 μg·mL-1的對(duì)照品母液。

2.3 供試品溶液的制備

精密稱取白芍（或酒白芍）3.0 g 于500 mL 的圓底燒瓶中，加水200 mL，100 ℃加熱回流65 min，用2 層300 目尼龍紗布濾過后放冷，滴加去離子水調(diào)整體積至200 mL，取濾液10 mL 離心10 min（10 000 r·min-1，離心半徑為5.79 cm），過0.45 μm濾膜，即得。

2.4 HPLC指紋圖譜的建立

2.4.1 色譜條件 色譜柱：InertSustainSwiftTMC18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～5 min，3%A；5～25 min，3%～9%A；25～40 min，9%～11%A；40～55 min，11%～12%A；55～70 min，12%～18%A；70～90 min，18%～34%A；90～100 min，34%～47%A；100～115 min，47%～95%A）；檢測波長：230 nm；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量：15 μL。

2.4.2 指紋圖譜處理方法 將數(shù)據(jù)以cdf.的格式導(dǎo)入國家藥典委員會(huì)“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”（2012 版）軟件，對(duì)前8 min 的色譜峰進(jìn)行剪切，采用中位數(shù)法，時(shí)間窗寬度為0.1 min，進(jìn)行全譜峰匹配，計(jì)算相似度。

2.4.3 精密度試驗(yàn) 按照2.3 項(xiàng)下方法制備供試品溶液1 份（B15），按照2.4.1 項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6 次進(jìn)行測定，圖譜按照2.4.2 項(xiàng)下方法處理。結(jié)果顯示，白芍與酒白芍的相似度均為1.000，剔除芍藥苷色譜峰的影響后，白芍與酒白芍的相似度均為1.000。以芍藥苷為參照，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD 均小于0.07%，相對(duì)峰面積RSD 均小于2.52%，說明儀器精密度良好。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 按照2.3 項(xiàng)下方法制備供試品溶液6 份（B15），分別測定，圖譜按照2.4.2 項(xiàng)下方法處理。結(jié)果顯示，白芍相似度均大于0.999，酒白芍相似度均大于0.995，剔除芍藥苷色譜峰的影響后，白芍相似度均大于0.995，酒白芍相似度均大于0.964。以芍藥苷為參照，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD 均小于0.06%，相對(duì)峰面積RSD 均小于3.78%，說明該方法重復(fù)性良好。

2.4.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按照2.3 項(xiàng)下方法制備供試品溶液1 份（B1），分別在0、2、4、8、12、24 h 測定，圖譜按照2.4.2 項(xiàng)下方法處理。結(jié)果顯示，白芍與酒白芍相似度均大于0.999，剔除芍藥苷色譜峰的影響后，白芍相似度均大于0.996，酒白芍相似度均大于0.999。以芍藥苷為參照，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD 均小于0.06%，相對(duì)峰面積RSD均小于2.81%，說明樣品在24 h內(nèi)保持穩(wěn)定。2

.5 指紋圖譜相似度分析

2.5.1 指紋圖譜的采集和共有模式的建立 將15批白芍藥材及酒白芍的數(shù)據(jù)按照2.4.2 項(xiàng)下方法進(jìn)行處理，系統(tǒng)根據(jù)多批次樣品色譜圖的共有模式生成對(duì)照?qǐng)D譜R，經(jīng)標(biāo)定有8 個(gè)共有峰，結(jié)果見圖1～2，其中8 號(hào)色譜峰為芍藥苷。由于芍藥苷色譜峰峰面積過大，而其他峰峰面積均較小，為了避免芍藥苷貢獻(xiàn)率太高，掩蓋峰面積較小的峰的差異而導(dǎo)致分析結(jié)果的誤差，因此相似度評(píng)價(jià)中剔除了芍藥苷色譜峰的影響。為方便下文數(shù)據(jù)分析及表達(dá)，將芍藥苷色譜峰編號(hào)為8，其余峰按照從左至右順序進(jìn)行編號(hào)。

圖1 白芍藥材HPLC指紋圖譜

圖2 酒白芍HPLC指紋圖譜

2.5.2 白芍和酒白芍相似度評(píng)價(jià) 利用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”（2012版）軟件分別生成白芍藥材和酒白芍對(duì)照?qǐng)D譜，比較各樣品與相應(yīng)對(duì)照?qǐng)D譜的相似度，結(jié)果見表2，各批次白芍藥材與其對(duì)照?qǐng)D譜之間相似度為0.988～0.999，各批次酒白芍與其對(duì)照?qǐng)D譜之間相似度為0.991～0.999。剔除芍藥苷色譜峰的影響后再次計(jì)算相似度，結(jié)果見表3。各批次白芍藥材與其對(duì)照?qǐng)D譜之間相似度為0.915～0.995，各批次酒白芍與其對(duì)照?qǐng)D譜之間相似度為0.951～0.998，相似度均大于0.9，說明整體上相似性良好。

表2 白芍及酒白芍指紋圖譜相似度

表3 白芍及酒白芍指紋圖譜相似度（剔除芍藥苷后）

2.5.3 白芍與酒白芍HPLC 指紋圖譜比較 通過指紋圖譜相似度軟件評(píng)價(jià)白芍和酒白芍，兩者之間色譜峰相似度較高，區(qū)別較小，對(duì)照?qǐng)D譜比較相似度達(dá)0.999，見圖3，表明酒炒對(duì)于整個(gè)峰群影響較小。因?yàn)樯炙庈盏某龇鍟r(shí)間適中，峰面積較大且穩(wěn)定，因此以芍藥苷為參照峰，計(jì)算相對(duì)峰面積，結(jié)果見表4。通過8個(gè)共有峰相對(duì)峰面積比較可知，炮制后6號(hào)峰較生品有所下降，7號(hào)峰基本不變，其余的峰相對(duì)峰面積均有不同程度的增加。

圖3 白芍及酒白芍HPLC對(duì)照?qǐng)D譜比較

表4 白芍和酒白芍共有峰峰面積分析（,n=15）

表4 白芍和酒白芍共有峰峰面積分析（,n=15）

注：以白芍中芍藥苷峰面積為1計(jì)算。

2.6 指標(biāo)性成分定量分析

取白芍和對(duì)應(yīng)的酒白芍，按照《中國藥典》2020 年版一部[1]中白芍項(xiàng)下芍藥苷的含量測定方法制樣，并進(jìn)行測定，計(jì)算炮制前后芍藥苷的含量變化，結(jié)果見表5。由表5可知，白芍中芍藥苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.20%～5.28%，平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.23%；酒白芍中芍藥苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.52%～3.21%，平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.94%。含量變化平均值為-0.29%，說明酒炒會(huì)影響芍藥苷的含量。

表5 白芍及酒白芍中芍藥苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)及變化 %

2.7 水提液出膏率分析

按照2.3 項(xiàng)下方法分別制備白芍炮制前后的供試品溶液，置于已恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，60 ℃真空干燥箱中干燥3 d，取出冷卻后準(zhǔn)確稱取質(zhì)量，按照公式（1）和（2）分別計(jì)算出膏率和出膏率變化幅度，結(jié)果見表6。

由表6 可見，不同批次樣品之間出膏率差別較大，15批白芍藥材的平均出膏率為19.73%，整體出膏率為13.53%～24.50%，其中B13 出膏率最高，B15 出膏率最低；炮制后15 批酒白芍的平均出膏率為20.98%，整體出膏率為15.89%～26.82%，其中J8出膏率最高，J3出膏率最低。

表6 白芍及酒白芍出膏率及變化幅度 %

比較白芍炮制前后出膏率的變化可知，第1、11、13、14 批樣品炮制后出膏率下降，且第11、13批下降較明顯；其余批次均有不同程度的升高，其中第8、15 批樣品出膏率升高幅度較大。出膏率變化幅度為-18.57%～36.38%，剔除第1、11、13、14批的異常值后平均變化幅度為2.45%。

3 討論

3.1 流動(dòng)相體系及檢測波長的選取

本實(shí)驗(yàn)分別考察了甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸的流動(dòng)相體系，由出峰數(shù)、柱壓及指紋圖譜整體的分離度，最終選擇乙腈-0.1%磷酸水作為流動(dòng)相；選擇210～300 nm 的波長對(duì)供試品溶液進(jìn)行掃描，發(fā)現(xiàn)在230 nm 條件下，基線相對(duì)平穩(wěn)，響應(yīng)值高，峰數(shù)量較多，分離度較好，因此選取230 nm作為檢測波長。

3.2 白芍及酒白芍質(zhì)量評(píng)價(jià)

本實(shí)驗(yàn)通過建立白芍酒炒前后的HPLC 指紋圖譜，進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)白芍與酒白芍之間相似度較高；含量測定結(jié)果表明，白芍酒炒前后指標(biāo)性成分芍藥苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化為-2.13%～0.49%，整體呈下降趨勢。白芍酒炒后出膏率整體呈上升趨勢，第1、11、13、14 批炮制后出膏率反而降低，原因可能為不同產(chǎn)地及批次白芍之間本身存在質(zhì)量差異，以及藥材凈制過程中去細(xì)根、去皮操作不完全一致等。這也提示在白芍的生產(chǎn)加工過程中應(yīng)注意規(guī)范化，以保證藥材質(zhì)量。

3.3 白芍炮制前后的成分變化

從整體上分析，白芍炮制前后對(duì)芍藥苷含量影響較大，由指紋圖譜相對(duì)峰面積結(jié)果可知，峰1 炮制后相對(duì)峰面積有不同程度的升高，可能原因?yàn)榫茲?、炒制過程中增加了該成分的溶出[17]；峰6炮制后相對(duì)峰面積有所下降，可能原因?yàn)槌粗萍凹逯筮^程中該成分受到破壞，及轉(zhuǎn)化為其他成分等[18]。白芍的主要成分為芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、苯甲酰芍藥苷等，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，白芍酒炒后芍藥苷的含量大部分降低，少數(shù)升高。芍藥苷的含量有很多影響因素，如炮制溫度、儲(chǔ)存方式等。劉亮鏡等[17]研究表明，白芍酒炒之后芍藥苷含量略有升高，原因可能為乙醇促進(jìn)了芍藥苷的溶出。但大部分研究者發(fā)現(xiàn)，白芍酒炒會(huì)降低芍藥苷、苯甲酸的含量，增加芍藥內(nèi)酯苷、苯甲酰芍藥苷的含量[19-20]。芍藥苷在炮制過程中可能會(huì)轉(zhuǎn)化為芍藥內(nèi)酯苷和苯甲酰芍藥苷，芍藥苷受熱不穩(wěn)定，炒制過程中易被破壞；而苯甲酸是白芍中的有害成分，炮制后含量減少，因此篩選最佳炮制工藝，有利于提高白芍質(zhì)量[21-22]。

本研究建立的方法穩(wěn)定可行，可以系統(tǒng)地對(duì)白芍酒炒前后整體成分群的相似性和差異性進(jìn)行比較，同時(shí)成分的變化也是炮制前后藥理作用研究的基礎(chǔ)，也可為其他藥材炮制的研究提供參考。