食管癌癌前病變的臨床分子檢測(cè)研究進(jìn)展

許鎰洧，林逸偉，彭裕輝，李榮耀，李恩民

2018年全球最新癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，在全球惡性腫瘤發(fā)病率和致死率中，食管癌(esophageal cancer,EC)分別位于第七位和第六位[1]。我國(guó)是食管癌高發(fā)區(qū)，發(fā)病率居全球前五[1]，且大部分食管癌患者入院檢查時(shí)已處于中晚期，5 a生存率僅30.3%[2]，死亡率居高不下[3]，防治形勢(shì)十分嚴(yán)峻。

食管癌癌前病變(precancerous lesions,PL)，是指已證實(shí)與食管癌發(fā)生密切相關(guān)的病理變化，食管鱗癌的癌前病變主要指食管鱗狀上皮異型增生，WHO現(xiàn)稱(chēng)為上皮內(nèi)瘤變(intraepithelial neoplasia,IN)，其可根據(jù)細(xì)胞異型增生的程度和上皮累及的深度分為低級(jí)別IN (low grade IN，LGIN)和高級(jí)別IN(high grade IN，HGIN)。LGIN相當(dāng)于輕、中度異型增生，異型細(xì)胞局限在上皮下1/2以?xún)?nèi)；HGIN相當(dāng)于重度異型增生及原位癌，異型細(xì)胞累及上皮下1/2及以上。 Barrett食管異型增生則是食管腺癌的癌前病變。Barrett食管(Barrett’s esophagus,BE)是指食管下段的復(fù)層鱗狀上皮被化生的單層柱狀上皮所替代的一種病理現(xiàn)象，可伴或不伴腸化生，其中伴有腸化生的屬于食管腺癌的癌前病變，不伴有腸化生的是否屬于癌前病變，目前仍有爭(zhēng)議[4-7]。異型增生與既往使用的術(shù)語(yǔ)IN為同義詞,處理原則相同[5]。

目前，臨床上對(duì)于食管癌癌前病變的檢測(cè)，主要是通過(guò)內(nèi)窺鏡染色技術(shù)，同時(shí)結(jié)合活檢組織病理學(xué)探查[8]。迄今，尚沒(méi)有特異分子標(biāo)志物在臨床上應(yīng)用。但近年來(lái)，關(guān)于食管癌癌前病變生物標(biāo)志物的研究日趨增多，主要包括外周血或組織中有關(guān)蛋白、自身抗體、基因(或甲基化)和microRNA等，其潛在的診斷意義也越來(lái)越受到重視。

1 組織分子標(biāo)志物

1.1 組織蛋白分子標(biāo)志物福爾馬林固定石蠟包埋(formalin fixed paraffin embedded，F(xiàn)FPE)是普遍采用的組織保存方法，可長(zhǎng)時(shí)間保存組織，反復(fù)利用。免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry，IHC)是目前廣泛應(yīng)用的一種組織蛋白分子檢測(cè)技術(shù)，可用于檢測(cè)腫瘤組織中某種蛋白的定位/半定量表達(dá)，對(duì)鑒別腫瘤分子標(biāo)志物有重要臨床意義。到目前為止，已有多項(xiàng)研究支持檢測(cè)組織蛋白表達(dá)對(duì)于鑒別食管癌癌前病變的臨床指導(dǎo)意義。人抑癌基因P53位于17號(hào)染色體短臂，該基因編碼的p53蛋白在細(xì)胞增殖的調(diào)控中發(fā)揮重要的作用。在許多惡性腫瘤中，存在著P53基因的突變和/或缺失，導(dǎo)致p53蛋白半衰期延長(zhǎng)并在細(xì)胞核中積累[9]。王立東等[10]用IHC檢測(cè)方法，在手術(shù)切除癌旁組織中的14例正常黏膜、18例基底細(xì)胞過(guò)度增生、12例IN以及10例原位癌組織標(biāo)本中，發(fā)現(xiàn)p53蛋白異常表達(dá)的陽(yáng)性率分別為0%、78%、92%和80%，而在6例正常黏膜、40例基底細(xì)胞過(guò)度增生、5例IN的活檢組織標(biāo)本中分別為50%、97%和100%。這些結(jié)果表明在食管癌的病變過(guò)程中，p53蛋白在細(xì)胞，尤其是細(xì)胞核中的積累較早發(fā)生，可能是一種識(shí)別食管癌高危人群的早期分子標(biāo)志物。另外，Kaye PV等[11]應(yīng)用IHC檢測(cè)p53蛋白，發(fā)現(xiàn)其在食管腺癌癌前病變，尤其是低級(jí)別異型增生的診斷中可發(fā)揮輔助作用。雖然p53蛋白尚未被批準(zhǔn)用于臨床檢測(cè)，但有成為診斷食管癌癌前病變分子標(biāo)志物的潛力。再者，微小染色體維持蛋白2(minichrosome maintenance protein 2，MCM2)屬于MCM蛋白家族，由CDC基因編碼，只存在于處于細(xì)胞周期的細(xì)胞核中，當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入G0期和分化衰老階段時(shí)，MCMs水平下降甚至不能被檢測(cè)出來(lái)。因此，在增殖發(fā)育異常的細(xì)胞中，MCM2可作為細(xì)胞增殖的分子標(biāo)記物，提示細(xì)胞所處的狀態(tài)，且與組織癌前病變程度相關(guān)[12]。Sirieix PS等[13]在BE與正常組織樣本的回顧性研究中確定，MCM2蛋白的靈敏度和特異性分別為62.9%和100%，表明MCM2蛋白是BE的潛在分子標(biāo)志物。還有，三葉因子3(trefoil factor 3，TFF3)為三葉因子多肽家族成員，是一種黏液相關(guān)肽，具有多種生物學(xué)功能，包括通過(guò)細(xì)胞遷移進(jìn)行黏膜修復(fù)、調(diào)控干細(xì)胞分化、與黏液的相互作用、調(diào)節(jié)黏膜免疫應(yīng)答等。TFF3與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，可促進(jìn)腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移與血管生成[14]。Lao SP等[14]利用46例BE組織和99例對(duì)照組織樣本檢測(cè)TFF3，其中36例BE和6例對(duì)照組織樣本顯示TFF3陽(yáng)性，其靈敏度和特異度分別為78%和94%，提示其可能作為檢測(cè)BE的分子標(biāo)志物。其他潛在的分子標(biāo)志物，如PFN2、IMP3和COX2等，對(duì)于食管癌癌前病變均有良好的診斷效能(表1)，表明檢測(cè)相關(guān)組織蛋白對(duì)于食管癌癌前病變的鑒別診斷有潛在的臨床意義。

表1 食管癌癌前病變相關(guān)組織分子標(biāo)志物[10,13-30]

1.2 組織MicroRNA標(biāo)志物MicroRNAs(miRNAs)是一類(lèi)在序列上高度保守的內(nèi)源性非編碼單鏈小RNA分子，長(zhǎng)約19～25個(gè)核苷酸，在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮調(diào)控作用，參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡等生理病理過(guò)程。研究表明，miRNAs是潛在的腫瘤診斷分子標(biāo)志物，可用于食管癌癌前病變的診斷[31-32]。在一項(xiàng)對(duì)BE的研究中，Li XD等不僅證實(shí)了檢測(cè)病變組織miR-192、miR-194、miR-196a、miR-215擁有潛在的診斷能力(AUC>0.80)，還發(fā)現(xiàn)將這些miRNA組合在一起能進(jìn)一步提高BE診斷的準(zhǔn)確性，其敏感性、特異性和AUC分別提高到83.9%～93.1%、90.5%～93.7%和0.87～0.93，顯著提高了診斷效能[25]。

1.3 基因異常甲基化標(biāo)志物基因甲基化通常發(fā)生在DNA分子CpG二核苷酸位點(diǎn)，是哺乳動(dòng)物基因組的一種表觀遺傳學(xué)修飾?；虍惓＜谆?，特別是抑癌基因的異常甲基化，常在食管癌癌前病變階段就已經(jīng)發(fā)生，具有診斷食管癌癌前病變的潛能[33]。在食管癌癌前病變中，HIN-1、P16/CDKN2A和RARβ2等基因的甲基化具有極高的特異性。在Schulmann K等[28]對(duì)BE的研究中，也表明了基因的甲基化對(duì)于BE檢測(cè)有良好的診斷效能，包括APC和3-OST-2等基因。

2 外周血分子標(biāo)志物

2.1 外周血蛋白分子標(biāo)志物外周血檢測(cè)是一種非侵入性的檢測(cè)手段，在癌癥診斷中具有廣泛的應(yīng)用前景。既往研究發(fā)現(xiàn)了多種與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)的外周血蛋白分子標(biāo)志物[34]。Zhou SL等[35]鑒定了一個(gè)自身抗體組合，對(duì)于檢測(cè)食管癌IN的敏感性為38%，特異性為94%。Zhai Xh等[36]利用185例ESCC和癌前病變組織樣本，通過(guò)SELDI-TOF-MS和SVM方法，篩選出了兩組標(biāo)志物，其中檢測(cè)DYS組的標(biāo)志物組合，包括2944、13768、13978和28061等質(zhì)譜峰，其敏感性和特異性分別為84.7%和90.6%，而另一組標(biāo)志物9304、7781和8159等質(zhì)譜峰，對(duì)于檢測(cè)食管基底細(xì)胞過(guò)度增生(basal cell hyperplasia，BCH)的敏感性和特異性分別為59.5%和96.3%。這些研究均顯示了外周血蛋白分子標(biāo)志物用于檢測(cè)食管癌癌前病變的潛力。見(jiàn)表2。

表2 食管癌癌前病變相關(guān)外周血分子標(biāo)志物[35-42]

2.2 外周血miRNA標(biāo)志物血清miRNA非常穩(wěn)定，重復(fù)性好，可以抵抗RNA酶的消化和苛刻的外部環(huán)境，如反復(fù)凍融、長(zhǎng)時(shí)間室溫放置、過(guò)酸過(guò)堿或極端pH等。外周血miRNA是潛在的非侵入性分子標(biāo)志物，可用于食管癌癌前病變的診斷[32,43]。Shen Y等通過(guò)全基因組miRNA表達(dá)譜篩選出7個(gè)候選miRNA，在96例ESCC、92例食管癌癌前病變和78例正常食管的組織樣本中進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)其中4個(gè)miRNA的聯(lián)合檢測(cè)有良好診斷效能，敏感性和特異性分別為82.6%和80.8%，AUC為0.842[37]。在BE檢測(cè)方面，Bus P等的研究也證實(shí)了外周血miRNA組合診斷的潛能，其敏感性和特異性分別為78.38%和85.71%，AUC=0.832(95%CI：0.698～0.967)[38]。

3 展望

早診早治既是防治食管癌的重中之重，也是提高患者生存率最為有效的措施。目前臨床上對(duì)于食管癌癌前病變的檢測(cè)，主要是通過(guò)內(nèi)窺鏡檢查結(jié)合染色指示劑活檢及病理學(xué)檢查[8]，尚沒(méi)有特異生物標(biāo)志物正式應(yīng)用到臨床檢測(cè)中來(lái)。作為理想的生物標(biāo)志物，不僅應(yīng)該具有高的敏感性和特異性，還應(yīng)具有高的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值，且能穩(wěn)定存在于血清或組織中。目前臨床上所用標(biāo)志物主要有鱗狀細(xì)胞癌抗原(squamous cell carcinoma antigen，SCC-Ag)、癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)、糖類(lèi)抗原19-9(carbohydrate antigen 19-9，CA19-9)等，但由于上述腫瘤標(biāo)志物大多敏感性或特異性不高，使其在臨床上的應(yīng)用受到極大的限制，并不能有效地指導(dǎo)食管癌癌前病變的臨床早期診治，因而急需對(duì)其他潛在生物標(biāo)志物進(jìn)行探索研究并進(jìn)行性能驗(yàn)證。近年來(lái)，已有許多研究表明，一些分子標(biāo)志物對(duì)于食管癌癌前病變表現(xiàn)出潛在的臨床診斷效能。但總的來(lái)說(shuō)，這些研究仍存在一些問(wèn)題，例如樣本量小、研究設(shè)計(jì)單一人群、缺乏獨(dú)立驗(yàn)證試驗(yàn)、缺乏臨床前數(shù)據(jù)等。因此，上述相關(guān)標(biāo)志物仍需多中心、大樣本的研究來(lái)驗(yàn)證其診斷效能。