益胃湯治療慢性萎縮性胃炎作用機(jī)制的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

劉少玲 謝梅娟 譚雪群 嚴(yán)冰鳳 徐國良

廣東省佛山市高明區(qū)中醫(yī)院,廣東 佛山 528500

慢性萎縮性胃炎(Chronic atrophic gastritis，CAG)是以胃黏膜上皮和腺體萎縮，數(shù)目減少，胃黏膜變薄，黏膜基層增厚，或伴幽門腺化生和腸腺化生，或有不典型增生為特征的慢性消化系統(tǒng)疾病，是一種多致病因素性疾病及癌前病變。目前認(rèn)為該疾病的發(fā)生發(fā)展與幽門螺旋桿菌感染、胃腸動(dòng)力下降，膽汁返流等因素密切相關(guān)[1]。世界衛(wèi)生組織將CAG定義為胃癌前病變，其一般演變模式為“正常粘膜→慢性胃炎→CAG腸化生→不典型增生→胃癌”，因此及時(shí)地治療CAG是防止胃癌發(fā)生的重要策略[2]。CAG屬于中醫(yī)“胃痞”“痞滿”范疇，證候分型分別為胃陰不足、肝胃氣滯、脾胃虛弱等六種證型，其中胃陰不足證型代表方劑為益胃湯。益胃湯(YiWei Soup，YWS)出自清代吳鞠通《溫病條辨》，其方藥組成為沙參、麥冬、生地黃、玉竹，冰糖，具有養(yǎng)陰益胃功效。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，YWS治療CAG的臨床療效顯著[3-4]。目前YWS治療CAG作用機(jī)制尚未完全闡述清楚。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)“多成分-多靶點(diǎn)-多通路”的研究方法，與具有整體性、系統(tǒng)性特點(diǎn)的中醫(yī)藥理論不謀而合，因此適用于中醫(yī)藥療效作用機(jī)制研究[5]。本文采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法對(duì)YWS治療CAG進(jìn)行分析，預(yù)測其潛在作用機(jī)制，為其進(jìn)一步研究提高理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 YWS藥物活性成分篩選 將YWS中沙參、麥冬、生地黃、玉竹，冰糖5味藥物導(dǎo)入中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/)，取得YWS藥物成分信息?；诳诜锢枚?Oral bioavailability，OB)大于30%和藥物相似性(Drug-likeness，DL)大于 0.18的篩選條件，篩選出YWS藥物活性成分。

1.2 YWS藥物活性成分的靶點(diǎn)預(yù)測 通過PubChem 數(shù)據(jù)庫(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)，獲得YWS藥物活性成分的“Canonical SMILES”，接著將每個(gè)成分“Canonical SMILES”輸入到入Swiss Target Prediction平臺(tái)(http：//www.swisstarget prediction.ch/)，預(yù)測YWS藥物活性成分的作用靶點(diǎn)。

1.3 YWS治療CAG相關(guān)靶點(diǎn)收集 通過人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(OMIM，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim)和Gene Cards數(shù)據(jù)庫(http://www.genecards.org/)，以“chronic atrophic gastritis”為關(guān)鍵詞進(jìn)行搜索，收集與CAG相關(guān)的疾病靶點(diǎn)，去除重復(fù)靶點(diǎn)，然和與1.2項(xiàng)獲得的YWS藥物活性成分作用靶點(diǎn)進(jìn)行比對(duì)，取交集，最終獲得YWS治療CAG相關(guān)靶點(diǎn)。

1.4 YWS治療CAG相關(guān)靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)建立 將1.3項(xiàng)下獲得的YWS治療CAG相關(guān)靶點(diǎn)輸入到Sring數(shù)據(jù)庫(https：//string-db.org/)，設(shè)置參數(shù)如下：物種為“人類(Homo sapiens)”，最低相互作用閾值為中等置信度(medium confidence)，其余參數(shù)保持默認(rèn)，得到靶點(diǎn)間相互作用數(shù)據(jù)，利用Cytoscape 3.2.1軟件建立YWS治療CAG相關(guān)靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)(Protein Protein Interaction， PPI)

1.5 YWS治療CAG相關(guān)靶點(diǎn)的KEGG通路富集分析 通過Metascape平臺(tái)，導(dǎo)入YWS治療CAG相關(guān)靶點(diǎn)，參數(shù)“Input as species”和“Analysis as species” 均 選 擇 “人類(Homo sapiens) ”，P值設(shè)置為小于 0.01，對(duì)YWS治療CAG相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析，根據(jù)每條通路P值，從小到大進(jìn)行排序，篩選出前10條通路，并進(jìn)行可視化處理。

1.6 YWS治療CAG作用機(jī)制的“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 基于YWS藥物活性成分、YWS治療CAG相關(guān)靶點(diǎn)以及靶點(diǎn)參與的KEGG通路數(shù)據(jù)，使用Cytoscape 3.2.1軟件構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果

2.1 YWS藥物活性成分收集 按OB>30%，DL>0.18的篩選條件，總共收集13個(gè)藥物活性成分，其中沙參7個(gè)、麥冬5個(gè)、生地2個(gè)、玉竹3個(gè)、冰糖0個(gè)，成分詳細(xì)信息見于表1。

表1 YWS活性化合物基本信息

續(xù)表1

2.2 YWS治療CAG相關(guān)靶點(diǎn) 通過Swiss Target Prediction平臺(tái)，一共獲得327個(gè)基因靶點(diǎn)，刪除重復(fù)靶點(diǎn)后得到208個(gè)YWS藥物活性成分靶點(diǎn)，與OMIM、Gene Cards兩個(gè)數(shù)據(jù)庫收集到的CAG疾病相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行比對(duì)，取交集，最終得到62個(gè)YWS治療CAG相關(guān)靶點(diǎn)，見表2。

表2 YWS治CAG的62個(gè)相關(guān)靶點(diǎn)

2.3 62個(gè)YWS治療CAG相關(guān)靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)分析 通過Sring數(shù)據(jù)庫取得YWS治療CAG相關(guān)靶點(diǎn)相互作用數(shù)據(jù)，使用Cytoscape 3.2.1軟件PPI網(wǎng)絡(luò)，見圖1。該網(wǎng)絡(luò)一共包括62個(gè)節(jié)點(diǎn)，334條線(若兩個(gè)靶點(diǎn)之間存在相互作用關(guān)系，則用邊連接兩個(gè)靶點(diǎn))。靶點(diǎn)degree值越大則節(jié)點(diǎn)越大，使用軟件中的網(wǎng)絡(luò)分析工具，挑出網(wǎng)絡(luò)中degree值排名前10的靶點(diǎn)，分別為SRC、AKT1、EGFR、HSP90AA1、MAPK14、MTOR、MMP9、AR、PIK3CA、MMP2。

圖1 YWS治療CAG相關(guān)靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

2.4 KEGG通路富集分析 通過Metascape平臺(tái)對(duì)YWS治療CAG的62個(gè)相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析，根據(jù)P值大小，從小到大進(jìn)行排序，篩選出前10條通路，結(jié)果見圖2。主要通路有內(nèi)分泌耐藥、PI3K-Akt信號(hào)通路、ERBB信號(hào)通路、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥、雌激素信號(hào)通路、松弛素信號(hào)通路等。

圖2 YWS治療CAG相關(guān)靶點(diǎn)的KEGG通路富集分析

2.5 YWS治療CAG作用機(jī)制的“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 基于收集到的數(shù)據(jù)，繪制YWS治療CAG作用機(jī)制的“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果見圖3。圖3中圓圈節(jié)點(diǎn)代表YWS藥物活性成分(用表1中的編號(hào)代替成分名稱)，三角形節(jié)點(diǎn)代表YWS治療CAG相關(guān)靶點(diǎn)，四邊形節(jié)點(diǎn)代表相關(guān)靶點(diǎn)參與的KEGG通路。若某一藥物活性成分與某一作用靶點(diǎn)以邊相連，則說明該靶點(diǎn)為此成分的潛在作用靶點(diǎn)；若某一作用靶點(diǎn)與某條通路以邊相連，則說明該作用靶點(diǎn)能調(diào)節(jié)此通路。YWS不是以單個(gè)藥物成分、單個(gè)作用蛋白、單個(gè)信號(hào)通路來發(fā)揮治療CAG的，而是以多成分-多靶點(diǎn)-多途徑的形式來達(dá)到治療CAG作用，體現(xiàn)了YWS治療CAG作用機(jī)制的系統(tǒng)性與復(fù)雜性。

圖3 YWS治療CAG“成分靶點(diǎn)KEGG通路”網(wǎng)絡(luò)

3 討論

3.1 YWS治療CAG涉及的重要藥物成分 本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法探索益胃湯(YiWei Tang，YWS)治療慢性萎縮性胃炎(chronic atrophic gastritis，CAG)的作用機(jī)制。結(jié)果顯示歐前胡素(Ammidin)、β-谷甾醇(Beta-sitosterol)、槲皮素(Quercetin)、豆甾醇(Stigmasterol)等是YWS藥物活性成分。歐前胡素屬于呋喃香豆素，主要來源于蛇床子、白芷、沙參等傳統(tǒng)中藥植物，具有抗腫瘤、抗菌、消炎、鎮(zhèn)痛等功效[6]。β-谷甾醇可以上調(diào)超氧化物歧化酶(SOD)活性，增加血清中NO含量，降低血清中炎癥因子水平，通過增加胃腸道血流量和抗炎等途徑治療阿司匹林引起的小鼠胃黏膜損傷[7]。槲皮素具有良好的抗炎、抗菌的作用[8]，有學(xué)者通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)槲皮素能夠通過降低胃酸，發(fā)揮抗?jié)?、胃黏膜保護(hù)的作用，進(jìn)而抑制大鼠反流性食管炎和胃炎[9]。亦有研究[10]發(fā)現(xiàn)槲皮素可有效地抑制幽門螺旋桿菌，而幽門螺旋桿菌與CAG的發(fā)生發(fā)展有著密切聯(lián)系。

3.2 YWS治療CAG涉及的重要作用靶點(diǎn) YWS治療CAG作用靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)顯示，AKT1、EGFR、AR、MMP2、MMP9等10個(gè)靶點(diǎn)的Degree值排在62個(gè)YWS治療CAG作用靶點(diǎn)前10位。AKT是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，一共有3亞型：AKT1、AKT2，AKT3。AKT1和AKT2在炎癥過程中的作用已有研究，已知AKT信號(hào)通路在各種炎癥介導(dǎo)的疾病，如動(dòng)脈粥樣硬化、多發(fā)性硬化癥、哮喘，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中發(fā)揮重要作用[11-12]。國外有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)人參可通過降低AKT1與AKT2活性在胃炎、肝炎、結(jié)腸炎等多種炎性疾病中發(fā)揮抗炎作用[13]。表皮生長因子(EGF)高度參與胃腸上皮細(xì)胞的增生及分化成熟，受損的胃腸粘膜的修復(fù)、調(diào)節(jié)腸道的生長發(fā)育等重要生理過程，而EGFR廣泛分布于各種上皮細(xì)胞的細(xì)胞膜上。在胃潰瘍以及萎縮性胃炎受損粘膜愈合過程中，EGF和EGFR的正常表達(dá)對(duì)胃黏膜增殖有著重要意義，但其一旦過度表達(dá)則會(huì)引起細(xì)胞過度增生，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞變異甚至不典型增生。實(shí)驗(yàn)中慢性萎縮性胃炎大鼠體內(nèi)EGF、EGFR表達(dá)水平過高，這與慢性萎縮性胃炎患者體內(nèi)EGF、EGFR過度表達(dá)情況相吻，提示EGF、EGFR與慢性萎縮性胃炎的發(fā)生發(fā)展有著密切聯(lián)系[14-15]。MMPs是一組內(nèi)源性蛋白水解酶，其主要功能是降解細(xì)胞外基質(zhì)膜有效成分，作用于細(xì)胞外其他蛋白質(zhì)而發(fā)揮其潛在的生物學(xué)功能，參與組織模型再塑以及創(chuàng)傷修復(fù)等生理過程[16]。許升等[17-18]實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，黃芪建中湯通過下調(diào)MMP9、MMP2表達(dá)水平，修復(fù)胃黏膜損傷。

3.3 YWS治療CAG涉及的重要生物通路 KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，YWS治療CAG主要涉及內(nèi)分泌耐藥、PI3K-Akt信號(hào)通路、ERBB信號(hào)通路、雌激素信號(hào)通路、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥，松弛素信號(hào)通路等多條信號(hào)通路。PI3K-Akt信號(hào)通路是哺乳動(dòng)物中廣泛存在的經(jīng)典通路，在細(xì)胞分化、增殖、凋亡過程中有著重要作用[19]。研究表明，PI3K-Akt信號(hào)通路與慢性萎縮性胃炎的發(fā)生發(fā)展有著密切關(guān)系，PI3K-Akt信號(hào)通路過度激活會(huì)誘導(dǎo)慢性萎縮性胃炎癌變化，此外其還可以上調(diào)NF-κB、TNF-α等促炎因子表達(dá)水平，加重炎癥反應(yīng)，進(jìn)而使胃黏膜進(jìn)一步受損[20]。表皮生長因子受體(Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR)酪氨酸激酶活性，對(duì)表皮生長因子(Epidermal Growth Factor,EGF)具有高親和力和特異性，EGFR活性大小主要受到EGF濃度影響，胃黏膜受損后會(huì)分泌大量的EGF來修復(fù)胃黏膜，因此胃黏膜EGFR是評(píng)估粘膜愈合質(zhì)量的指標(biāo)，其表達(dá)水平上升能夠有效地促進(jìn)胃黏膜的修復(fù)與重建[21]。

4 結(jié)論與展望

本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法初步預(yù)測了YWS治療CAG的作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)YWS主要通過抗炎、抗幽門螺旋桿菌和促進(jìn)胃黏膜修復(fù)等方面發(fā)揮治療CAG作用，為其進(jìn)一步的研究初步奠定理論基礎(chǔ)。由于本研究僅是依靠數(shù)據(jù)庫信息在理論層面上對(duì)YWS治療CAG作用機(jī)制進(jìn)行探索，具有一定的局限性，預(yù)測結(jié)果雖與目前一些已報(bào)道的研究相吻合，但后期仍需要通過臨床實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證結(jié)果的可靠性。