針刺“百會”透“曲鬢”穴對急性腦出血大鼠血腫及CD36、HO-1表達的影響*

陳秋欣,孔 瑩,于婷婷,張 瑜,劉 鵬,張 鑫,朱路文△

1.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040；3.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001；4.深圳市寶安中醫(yī)院(集團)，廣東 深圳 518133

腦出血(Intracerebral hemorrhage,ICH)指非外傷性腦實質內出血，具有極高的致殘率、致死率[1]。據(jù)統(tǒng)計，腦出血早期病死率達到49.4%，僅半數(shù)患者預后良好[2]。腦出血后血紅蛋白破入腦內引起繼發(fā)性血腦屏障破壞、局灶性水腫、神經(jīng)元及神經(jīng)膠質細胞凋亡等是導致神經(jīng)功能損傷的重要原因[3-4]。血紅素氧化酶1(Heme oxygenase 1,HO-1)是人體內血紅蛋白分解產(chǎn)物-血紅素分解的限速酶，在腦出血后迅速被激活，減輕血腫周圍炎癥反應[5-6]。CD36為B類清道夫受體(Class B scavenger receptor，SR)家族的一員，介導包括紅細胞在內的凋亡及受損細胞的吞噬及清除，促進血腫吸收，成為腦出血治療最新靶點之一[7-8]。

課題組前期證實[9-11]，針刺改善急性腦出血大鼠的神經(jīng)功能缺損癥狀，減輕急性期腦組織病理損傷和超微結構損害，但未從促進血腫吸收角度探討其相關機制。本實驗采用自體血注入大鼠腦內，建立腦出血模型，針刺“百會”透“曲鬢”穴干預，觀察腦出血大鼠的血腫吸收情況及針刺對CD36、HO-1表達的影響，從血腫吸收角度探討針刺治療腦出血的相關機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康SPF級雄性Wistar大鼠，8周齡，體質量(300±20)g[吉林大學白求恩醫(yī)學院動物實驗中心提供 ，動物許可證號SCXK(吉)2013-0004]。動物飼養(yǎng)于人工控制條件下，大鼠同室、分籠飼養(yǎng)。在溫度(22±3)℃、相對濕度 (60±5)%和12/12明暗變化條件下飼養(yǎng)。實驗遵循科技部頒布的《關于善待實驗動物的指導性意見》相關規(guī)定。

1.2 主要試劑及儀器

CD36多克隆抗體(WL02390,萬類生物科技有限公司，中國)；HO-1多克隆抗體(WL02400,萬類生物科技有限公司，中國)；內參抗體 β-actin (WL01845,萬類生物科技有限公司，中國)；立體定位儀(ST-5ND-C，中國成都儀器廠)；電泳儀(DYY-7C，北京六一生物科技有限公司)；雙垂直蛋白電泳儀(DYCZ-24DN，北京六一生物科技有限公司)。

1.3 造模方法

參照相關文獻[12]制作實驗性腦出血大鼠模型。1%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔注射麻醉，俯臥位固定于立體定位儀上，備皮、消毒、切口，剝離骨膜，暴露前囟及冠狀縫，取前囟點(Bregma點)右旁開3.5 mm、后0.2 mm定點，用牙科鉆鉆直徑為1.0 mm的圓孔，深達硬腦膜表面。用微量注射器取尾靜脈血50 μL，固定于立體定位儀上，沿鉆孔進針約6 mm，以20 μL/min速度將未肝素化的血液50 μL推進尾殼核，留針約5 min，緩慢出針。假手術組接受類似模型組的各項手術操作，但不進行注血。術后采用Berderson評分法[13]評估清醒大鼠神經(jīng)功能缺損，1～3分的大鼠納入實驗。

1.4 分組及干預方法

采用隨機數(shù)字表法將108只大鼠分為假手術組、模型組和針刺組，每組36只。每組再按1、3、7 d時間點再分為3個亞組(n=12)。假手術組接受類似模型組的各項手術操作，但不進行注血制作。模型組僅接受腦出血模型制作，不進行任何干預。針刺組：制作腦出血模型,造模后12 h開始治療,參照《實驗針灸學》[14]選取大鼠“百會”穴、患側“曲鬢”穴，采取“百會”穴透刺“曲鬢”穴，0.30 mm×25 mm毫針針刺，進針20 mm，留針30 min，1次/d。

1.5 指標及檢測方法

1.5.1 神經(jīng)行為學評分 各組大鼠在相應時間點(術后1 d、3 d、7 d)采用改良的神經(jīng)功能缺損評分(modified Neurological Severity Scores,mNSS)對大鼠的運動、感覺及反射功能進行評估[15-16]。

1.5.2 腦血腫體積 各組大鼠在相應時間點(術后1 d、3 d、7 d)，麻醉后開顱取腦固定，測出血腫最大層面最長的互為垂直的橫徑與縱徑，HE 染色。根據(jù)多田公式算出相應的血腫體積，血腫體積=π/6×血腫最大層面最長橫徑(mm)×縱徑(mm)×血腫層數(shù)×層厚(mm)。

1.5.3 腦水腫含量 用吸水紙吸干腦組織表面水分，迅速放入事先稱重(A)的帶蓋的小玻璃瓶中，立即稱重(B)，B-A即得濕重；烘干24 h，取出待測腦組織恢復到室溫，再加蓋稱重(C)，C-A即得干重，反復稱量至恒重[17]。稱重用電子天平，精確度為0.1 mg。公式：(濕重-干重)/濕重×100%，即(B-C)/(B-A)×100%。

1.5.4 Western blot檢測血腫周圍腦組織HO-1、CD36表達 將腦組織勻漿離心后取上清液，采用BCA(Bicinchoninic acid)法測定蛋白量。取30 μL處理后的蛋白樣品，采用12%聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PACE)轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，以標準蛋白Maker為參照，5%脫脂奶粉封閉，相應條帶分別加入HO-1(1∶500)、CD36(1∶500)，4 ℃孵育過夜。顯色完成后，將硝酸纖維素膜移至蒸餾水中終止顯色。用濾紙將膜吸干，避光放置20 min后，將膜置于掃描儀中掃描，用凝膠圖象處理系統(tǒng)(Gel-Pro-Analyzer軟件)分析目標條帶的光密度值。

1.6 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 各組大鼠mNSS評分比較

假手術組術后無明顯神經(jīng)功能缺損表現(xiàn)。模型組大鼠術后1 d已表現(xiàn)出神經(jīng)功能缺損癥狀，3 d神經(jīng)缺損癥狀最重；與模型組比較，針刺組各時間大鼠神經(jīng)功能評分明顯降低(P<0.01)。見表1。

表1 各組大鼠mNSS評分比較

2.2 各組大鼠腦血腫體積比較

假手術組大鼠腦組織無血腫，模型組可見明顯血腫，術后3 d血腫體積最大。與模型組比較，針刺組術后3 d血腫體積明顯降低(P<0.01)；術后7 d大鼠血腫體積降低(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠腦血腫體積比較

2.3 各組大鼠腦水腫含量比較

假手術組各時間點腦水含量差異無統(tǒng)計學意義。模型組大鼠各時間點腦水腫含量較假手術組明顯增多(P<0.01)；針刺組大鼠各時間點腦水含量較模型組明顯降低(P<0.01)。見表3。

表3 各組大鼠腦水腫含量比較

2.4 各組大鼠血腫周圍腦組織HO-1、CD36蛋白表達

假手術組可見HO-1弱陽性表達。模型組HO-1蛋白表達增高，術后3 d相對表達最多。與模型組相比，各時間點(1 d、3 d和7 d)針刺組HO-1蛋白表達明顯升高(P<0.01)。見表4、圖1。

圖1 各組大鼠腦組織HO-1蛋白表達

表4 各組大鼠腦組織HO-1 Western blot結果

假手術組可見CD36弱陽性表達。模型組CD36蛋白表達增高，與假手術組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；針刺組大鼠各時間點CD36表達較模型組顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表5、圖2。

圖2 各組大鼠腦組織CD36蛋白表達

表5 各組大鼠腦組織CD36 Western blot結果

3 討論

腦出血是一種嚴重的卒中類型，占所有卒中的10%～15%[18]，死亡率可高達50%[19]。腦出血后在發(fā)病后幾個小時內即可出現(xiàn)由顱內腦實質血腫造成腦組織機械損傷，其損傷程度與出血量及血腫體積相關[20]。因此，如何有效地清除腦血腫，減輕血腫對腦組織的壓迫是腦出血研究的關鍵問題。腦出血后的腦損傷涉及的腦水腫、炎癥反應及血腫清除中均發(fā)現(xiàn)HO-1參與其中[21]。CD36作為清道夫受體的一員，已明確參與腦出血血腫清除過程[22-24]。因此本實驗采用頭針干預腦出血大鼠，研究其對腦出血大鼠HO-1及CD36的作用。

針灸治療腦出血在臨床中已應用幾十年，療效肯定，具有良好的安全性[25-27]。百會穴，位居巔頂，位屬于督脈，百會穴為各經(jīng)脈氣會集之處，通達陰陽脈絡，可升可降。曲鬢穴，歸足少陽膽經(jīng)，為足太陽、少陽之會，使氣血調和、經(jīng)絡暢通，從而起到療癱起廢的作用。督脈百會穴與顳部膽經(jīng)曲鬢穴之間的連線又稱為頂顳后斜線，一穴區(qū)橫跨頂、額、顳3區(qū)，此線斜穿3條經(jīng)脈：督脈、足太陽膀胱經(jīng)及足少陽膽經(jīng)，其經(jīng)絡調節(jié)可縱貫全身。

腦出血后腦組織發(fā)生繼發(fā)性損傷如血紅蛋白毒性作用、凝血酶釋放、局部腦組織血流量減少和炎性反應等可加重腦出血后神經(jīng)功能缺損[28-30]。HO-1見于神經(jīng)元細胞、神經(jīng)膠質細胞和小膠質細胞等，小膠質細胞HO-1對于減輕神經(jīng)元細胞死亡和認知功能障礙以及促進紅細胞吞噬起重要作用[31-32]。腦出血后HO-1大量表達，隨出血時間變化逐漸增高，通過代謝血紅蛋白而減輕氧化應激和炎癥反應，與炎癥反應呈負相關性[33-35]。Wang等[36]發(fā)現(xiàn)腦出血后早期(1～7 d)HO-1表達的增加起到了保護作用，而后期(7 d后)HO-1過度表達可加重神經(jīng)功能損傷。Fan等[37]發(fā)現(xiàn)HO-1抑制炎癥反應和神經(jīng)元細胞凋亡而發(fā)揮腦保護作用。

近年來，CD36在腦出血的病理過程中發(fā)揮的作用引起研究者們的關注[38]。敲除CD36的小鼠腦出血后血腫吸收速度明顯減慢，神經(jīng)功能缺損加重，腦含水量亦增多，多種炎癥因子分泌增多，強調CD36參與了血腫吸收，并與神經(jīng)功能的預后相關[39]。許多學者證實上調血腫周圍小膠質細胞 CD36的表達，促進M2表型極化，促進血腫吸收，發(fā)揮腦保護作用，成為腦出血治療的新靶點[22-24]。

本實驗選用mNSS評分法對腦出血后大鼠神經(jīng)功能進行評估，mNSS評分法從運動、感覺和反射等方面對大鼠的神經(jīng)功能全面評估，實驗中觀察到模型組大鼠出現(xiàn)不同程度神經(jīng)功能缺損癥狀，尤其在運動和感覺實驗中表現(xiàn)更為明顯，在術后第1天時模型組大鼠神經(jīng)評分最高，至術后7 d大鼠神經(jīng)功能缺損癥狀逐漸減輕。針刺組神經(jīng)功能評分與模型組相比明顯降低，說明針刺能夠有效降低腦出血大鼠神經(jīng)功能評分，改善神經(jīng)功能缺損癥狀。腦血腫體積及腦水含量結果顯示，相比模型組，針刺組血腫體體積明顯減小，腦水含量顯著降低，提示針刺能夠減小腦出血大鼠血腫體積，減輕局部水腫程度，減輕血腫對周圍組織的壓迫。Western-blot結果可見模型組HO-1、CD36蛋白表達增高，而針刺組HO-1、CD36蛋白表達較模型組升高，說明針刺可以促進血腫周圍腦組織HO-1、CD36蛋白表達，發(fā)揮神經(jīng)保護作用。

綜上，本研究結果表明針刺“百會”透“曲鬢”穴可能通過促進腦出血大鼠血腫周圍腦組織HO-1、CD36蛋白的表達，減小血腫體積，降低腦水含量，減輕血腫壓迫，降低神經(jīng)功能評分，進而改善神經(jīng)功能缺損表現(xiàn)。