EM菌對(duì)中華絨鰲蟹抗氧化性能及非特異性免疫的影響

儲(chǔ)蘭璐，高建操，宋黎黎，孫 毅，邵乃麟，李全杰，聶志娟，徐鋼春,，徐 跑,

(1.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心，江蘇無錫 214081)

中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)俗稱河蟹、大閘蟹，是我國最重要的淡水甲殼類養(yǎng)殖品種之一。然而，在集約化人工養(yǎng)殖模式發(fā)展的過程中，多次爆發(fā)由細(xì)菌、病毒、立克次體等引起的多種疾病，導(dǎo)致慘重的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重威脅河蟹養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。河蟹完全依靠先天免疫防御病原體[1]，其先天免疫系統(tǒng)由細(xì)胞免疫和體液免疫組成[2]，其中細(xì)胞免疫包括包囊、吞噬作用和結(jié)節(jié)形成，而體液免疫包括蛋白水解級(jí)聯(lián)反應(yīng)、抗菌肽(AMPs)合成和酚氧化酶激活系統(tǒng)(proPO系統(tǒng))；在河蟹抗感染免疫中細(xì)胞免疫與體液免疫相輔相成，共同發(fā)揮免疫作用[3]。河蟹的免疫系統(tǒng)在抵抗外源性病原體或污染物時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧(ROS)，過量的ROS會(huì)導(dǎo)致機(jī)體的氧化損傷。抗氧化酶系統(tǒng)能夠消除機(jī)體內(nèi)過量的ROS，防止或減輕機(jī)體的氧化損傷。同先天免疫一樣，抗氧化酶系統(tǒng)在維持河蟹的機(jī)體健康中也發(fā)揮著重要作用[4]。

河蟹肝胰腺是先天免疫反應(yīng)的重要器官，可以合成和分解許多參與免疫防御的蛋白質(zhì)[5]，如NF-κB通路成分、抗菌肽和抗氧化酶等。Toll樣受體作為一種模式識(shí)別受體，能直接識(shí)別病原相關(guān)分子模式。當(dāng)Toll信號(hào)通路被革蘭氏陽性細(xì)菌或真菌激活時(shí)，Toll受體蛋白活化，通過Tube蛋白，使MyD88和Pelle結(jié)合成異源三聚體復(fù)合物，然后將信號(hào)傳遞給Dorsal/Cactus復(fù)合物，Dorsal(NF-κB轉(zhuǎn)錄因子)通過磷酸化轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，調(diào)控某些抗菌肽基因的表達(dá)[6]。作為細(xì)胞內(nèi)蛋白成熟過程中的分子伴侶，Hsp90通過調(diào)節(jié)其受體蛋白的活性與維持受體蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定間接參與細(xì)胞內(nèi)多條信號(hào)通路的調(diào)控[7]。

近年來微生態(tài)制劑類因其安全、高效、無污染的特點(diǎn)成為水產(chǎn)健康養(yǎng)殖研究的熱點(diǎn)。其中， EM菌作為一種益生菌制劑最初被廣泛應(yīng)用于農(nóng)作物、蔬菜的種植和畜牧的養(yǎng)殖中，是一種以乳酸菌、酵母菌、光合細(xì)菌、放線菌和發(fā)酵真菌通過發(fā)酵工藝培養(yǎng)的復(fù)合菌劑,其主要利用有益微生物之間的協(xié)同作用，通過競爭排斥抑制病原菌和有害細(xì)菌的生長，從而使得有益菌占優(yōu)勢[8]。據(jù)報(bào)道，日糧添加EM菌不僅可以優(yōu)化哺乳動(dòng)物消化道中細(xì)菌菌群的組成，通過調(diào)控宿主基因表達(dá)提高飼料利用率，促進(jìn)宿主生長發(fā)育，還能夠激活細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫反應(yīng)[9]，提高其免疫力。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，EM菌能夠改良養(yǎng)殖水質(zhì)，顯著提高水體中藻類和輪蟲密度，促進(jìn)皺紋盤鮑(Haliotisdiscushannai)、刺參(Apostichopusjaponicusare)、尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)和淇河鯽(Carassiusauratus)等生長及增強(qiáng)抗病能力[10]。

目前，EM菌對(duì)河蟹養(yǎng)殖影響的研究主要集中在養(yǎng)殖水質(zhì)的改良和河蟹的營養(yǎng)風(fēng)味上[11]，在對(duì)河蟹免疫力影響方面仍是空白。本研究以河蟹為試驗(yàn)對(duì)象，在養(yǎng)殖過程中定期使用EM菌，從血液細(xì)胞學(xué)、基因表達(dá)和酶活等多層面評(píng)估EM菌對(duì)河蟹抗氧化能力和非特異性免疫力的影響，以期為EM菌的科學(xué)使用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用河蟹苗種購自江蘇諾亞方舟農(nóng)業(yè)科技有限公司。養(yǎng)殖池塘位于中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心揚(yáng)中基地，長×寬=75 m×23 m，水深0.5～1.0 m。實(shí)驗(yàn)用蟹初始體重為(27.78±1.44) g。飼養(yǎng)期間水溫14.0～32.8 ℃，溶解氧>2 mg/L，氨氮<0.025 mg/L，亞硝酸鹽<0.004 mg/L，pH7.8～9.0。

EM菌購自江蘇恒泰環(huán)?？萍及l(fā)展有限公司，pH3.0～4.0，乳酸菌數(shù)1.0×107～1.0×108CFU/mL，酵母菌數(shù)1.0×104～1.0×105CFU/mL，光合菌數(shù)1.0×103～2.0×103CFU/mL，放線菌數(shù)1.0×103～3.0×103CFU/mL，菌種數(shù)>80種，代謝產(chǎn)物>10%。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組

挑選個(gè)體大小均勻、附肢完整的健康扣蟹隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組(EM菌組)和對(duì)照組，每組3個(gè)池塘重復(fù)，每個(gè)池塘放養(yǎng)1 100只扣蟹；EM菌組池塘在常規(guī)管理的基礎(chǔ)上每7 d使用一次EM菌，每666.67 m2水體使用7 500 g EM菌；對(duì)照組按常規(guī)管理。

1.3 樣品采集

采樣時(shí)間點(diǎn)處于河蟹蛻殼間期，共進(jìn)行5次采樣，依次為4月15日(1殼)、6月3日(2殼)、7月19日(3殼)、8月27日(4殼)、10月21日(5殼)。每個(gè)采樣時(shí)間點(diǎn)從每個(gè)池塘中用地籠捕撈6只雄蟹，于冰上麻醉后采樣。取河蟹第3步足基關(guān)節(jié)膜處血淋巴，4 ℃靜置過夜，4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，收集上清液(血清)用于血清抗氧化和免疫酶活的測定；取5殼蟹肝素抗凝血，用于各類血細(xì)胞數(shù)量的測定；采集肝胰腺，液氮凍存運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后，于-80 ℃冰箱保存。

1.4 抗氧化酶系統(tǒng)指標(biāo)檢測

血清的超氧化物歧化酶(SOD)活力、過氧化氫酶(CAT)活力、丙二醛(MDA)含量、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)活力均采用南京建成生物工程研究所的試劑盒進(jìn)行測定，貨號(hào)依次為：A001-3-2、A007-1-1、A003-1-2和A005-1-2。

1.5 非特異性免疫力檢測

1.5.1 血細(xì)胞組成

取5殼河蟹的抗凝血，用瑞氏-姬姆薩染色法制作血涂片，油鏡下隨機(jī)選取視野共計(jì)200個(gè)細(xì)胞進(jìn)行觀察，進(jìn)行透明細(xì)胞(HC)、半顆粒細(xì)胞(SGC)和顆粒細(xì)胞(GC)的分類鑒定和計(jì)數(shù)[12]。

1.5.2 相關(guān)基因的表達(dá)量分析

肝胰腺RNA使用離心柱法(TaKaRa)提取，cDNA合成使用PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa)試劑盒進(jìn)行。河蟹內(nèi)參基因β-actin、Gapdh和免疫相關(guān)基因引物序列見表1。qRT-PCR分析使用TB GreenTM Fast qPCR Mix(TaKaRa)在CFX96(Bio-rad)上進(jìn)行。qRT-PCR程序?yàn)椋?5 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，循環(huán)數(shù)為40。用2-ΔΔCT方法計(jì)算各基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 中華絨螯蟹免疫相關(guān)基因熒光定量引物

1.5.3 免疫相關(guān)酶活的測定

血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)含量采用全自動(dòng)血清生化分析儀(Mindray BS-400)測定，所用試劑盒購自深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司。溶菌酶(LZM)活力采用南京建成生物工程研究所的試劑盒(貨號(hào)A050-1-1)進(jìn)行測定。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用SPSS 26.0(IBM Inc.,Chicago,IL,USA)軟件進(jìn)行。數(shù)據(jù)的正態(tài)性和方差齊性分別采用Shapiro-Wilk和Levene(α=0.05)方法進(jìn)行，對(duì)不符合上述要求的數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換；隨后基于全因子模型進(jìn)行雙因素方差分析，主效應(yīng)之間的差異分析選用LSD方法；P<0.05表示差異顯著，統(tǒng)計(jì)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(means±SD)表示。

2 結(jié)果

2.1 EM菌對(duì)中華絨螯蟹血清抗氧化酶系統(tǒng)的影響

不同處理組河蟹血清抗氧化指標(biāo)見表2。分析發(fā)現(xiàn)EM菌對(duì)不同發(fā)育階段河蟹的MDA和CAT有不同的影響。與對(duì)照組相比，EM菌在河蟹生長過程中能夠降低MDA含量，尤其在1殼和3殼時(shí)期，EM菌組的MDA含量顯著低于對(duì)照組；對(duì)照組MDA含量表現(xiàn)為先降低后升高的變化趨勢，3殼時(shí)對(duì)照組血清中MDA含量顯著低于1殼、4殼和5殼；EM菌組血清中MDA含量的變化與對(duì)照組相似，3殼時(shí)血清中MDA含量顯著低于其他各生長階段。5殼時(shí)，EM菌能顯著提高河蟹血清中CAT活力；在河蟹的生長過程中對(duì)照組血清中CAT活力保持相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)，但EM菌組血清中CAT呈現(xiàn)先降低后升高的變化趨勢，4殼時(shí)達(dá)到最低值。

表2 EM菌對(duì)中華絨螯蟹血清抗氧化指標(biāo)的影響

對(duì)照組SOD活力呈現(xiàn)逐步降低的變化趨勢，5殼時(shí)SOD活力顯著低于生長初期(1～3殼)；EM菌組變化趨勢與對(duì)照組一致，且在生長的各個(gè)時(shí)期均能提高SOD活力但與對(duì)照組之間無顯著差異。EM菌對(duì)中華絨螯蟹血清中GPX活力無明顯作用，在各生長時(shí)期，EM菌組與對(duì)照組之間無顯著差異。

2.2 EM菌對(duì)河蟹非特異性免疫的影響

2.2.1 EM菌對(duì)中華絨螯蟹血細(xì)胞組成的影響

圖1可知透明細(xì)胞(HC)為圓形，經(jīng)瑞氏-姬姆薩染色后，細(xì)胞質(zhì)呈淡紫色，細(xì)胞核呈紫色；半顆粒細(xì)胞(SGC)為卵圓形，經(jīng)染色后，細(xì)胞質(zhì)中的小顆粒呈現(xiàn)紫色或藍(lán)色，細(xì)胞核呈深紫色。顆粒細(xì)胞(GC)多呈橢圓形或圓形，細(xì)胞質(zhì)中含有大量具有折光性的顆粒，被染為紫色或藍(lán)色。由圖2可以看出HC在三種細(xì)胞類型中占比較低，對(duì)照組HC占20.96%±1.35%，EM菌組占19.40%±0.21%；對(duì)照組SGC占54.96%±3.00%，且EM菌組SGC含量比對(duì)照組高2.97個(gè)百分點(diǎn)；對(duì)照組GC占24.08%±1.69%，EM菌組占22.67%±0.10%。

圖1 中華絨螯蟹不同血細(xì)胞類型

圖2 EM菌對(duì)中華絨螯蟹血細(xì)胞組成的影響

2.2.2 EM菌對(duì)河蟹肝胰腺免疫相關(guān)基因表達(dá)的影響

不同處理河蟹肝胰腺免疫相關(guān)基因表達(dá)情況見表3。分析發(fā)現(xiàn)交互作用“處理×發(fā)育階段”顯著影響河蟹免疫相關(guān)基因Tube、Hsp90、Dorsal相對(duì)表達(dá)量，即不同發(fā)育階段河蟹免疫相關(guān)基因Tube、Hsp90、Dorsal相對(duì)表達(dá)量對(duì)EM菌的響應(yīng)程度不同。在河蟹生長的各個(gè)階段，EM菌組Toll2和Tube的表達(dá)量均高于對(duì)照組，2殼時(shí)EM菌組Tube的表達(dá)量顯著上調(diào)；在河蟹的生長發(fā)育過程中，Tube、Toll2表達(dá)量呈現(xiàn)逐步上升的趨勢，5殼時(shí)表達(dá)量最高，顯著高于1～3殼生長階段。

表3 EM菌對(duì)中華絨螯蟹肝胰腺免疫相關(guān)基因表達(dá)的影響

在河蟹生長的過程中，EM菌能上調(diào)Dorsal的表達(dá)，且在4殼時(shí)與對(duì)照組之間差異顯著；與對(duì)照組相比，EM菌組Dorsal的表達(dá)量相對(duì)穩(wěn)定，各生長階段差異不顯著。EM菌同樣能夠上調(diào)河蟹生長過程中Hsp90的表達(dá)，2殼和3殼時(shí)EM菌組Hsp90的表達(dá)量顯著高于對(duì)照組。

2.2.3 EM菌對(duì)中華絨螯蟹血清免疫指標(biāo)的影響

不同處理組河蟹血清免疫指標(biāo)見表4。分析發(fā)現(xiàn)交互作用“處理×發(fā)育階段”顯著影響河蟹免疫酶ALT、AST、ALP、LZM活性，即不同發(fā)育階段河蟹血清的ALT、AST、ALP、LZM活性對(duì)EM菌的響應(yīng)程度不同。5殼時(shí)EM菌組血清ALT活力顯著低于對(duì)照組；對(duì)照組ALT呈現(xiàn)逐步升高的變化趨勢，5殼時(shí)血清中ALT含量顯著高于其他生長時(shí)期；EM菌組變化趨勢與對(duì)照組一致，但在河蟹生長的各個(gè)時(shí)期，EM菌組血清中ALT含量均低于對(duì)照組，且在5殼時(shí)差異顯著。對(duì)照組AST活力呈現(xiàn)出逐步上升的趨勢，5殼時(shí)AST活力高于其他生長時(shí)期；EM菌組變化趨勢與其一致，且在1殼時(shí)河蟹血清中AST活力顯著低于對(duì)照組。EM菌組血清中ALP活力呈現(xiàn)出先降低后升高的變化趨勢，3殼時(shí)ALP活力達(dá)到最低值，顯著低于其他生長時(shí)期；除2殼外，其他生長階段，河蟹血清中ALP活力均高于對(duì)照組，且在1殼時(shí)兩組之間差異顯著。2殼時(shí)，與對(duì)照組相比，EM菌顯著提高血清中溶菌酶含量；河蟹對(duì)照組和EM菌組血清中溶菌酶含量波動(dòng)較大，1殼和3殼時(shí)溶菌酶含量高于其他生長時(shí)期。

表4 EM菌對(duì)中華絨螯蟹血清免疫指標(biāo)的影響

3 討論

3.1 EM菌對(duì)中華絨螯蟹血清抗氧化酶系統(tǒng)的影響

SOD和CAT是兩種重要的抗氧化酶，酶活力與機(jī)體清除自由基的能力正相關(guān)[19]。GPX有助于將過氧化物轉(zhuǎn)化為毒性較低的羥基化合物，可有效防止活性氧的積累，維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原的穩(wěn)態(tài)[20]。MDA是脂質(zhì)過氧化的毒性產(chǎn)物，它的含量間接反映了機(jī)體細(xì)胞的氧化損傷程度[21]。徐貴珠[22]發(fā)現(xiàn)飼料中添加殼寡糖和茶多糖能提高河蟹血清中CAT和SOD活性，同時(shí)降低MDA的含量。與之類似，本研究發(fā)現(xiàn)EM菌組MDA含量低于對(duì)照組，其中3殼時(shí)差異達(dá)到顯著水平，分析原因是河蟹于7月進(jìn)行3殼采樣，此時(shí)氣溫較高，在高溫下養(yǎng)殖水體穩(wěn)定性下降，殘餌、糞便、腐敗的水草等容易誘導(dǎo)河蟹產(chǎn)生氧化應(yīng)激。熱應(yīng)激下河蟹MDA含量隨應(yīng)激時(shí)間而逐步增加，進(jìn)而導(dǎo)致自由基代謝紊亂，病害發(fā)生[23]，而本實(shí)驗(yàn)中EM菌的添加能顯著降低MDA含量，表明EM菌對(duì)緩解或者抑制河蟹夏季高溫天氣時(shí)應(yīng)激損傷有一定效果。5殼時(shí)河蟹有上岸的習(xí)性，該階段河蟹常處于空氣暴露等缺氧環(huán)境下。而在缺氧條件下，蝦蟹類能夠調(diào)整體內(nèi)抗氧化酶活性以適應(yīng)不利的環(huán)境，降低氧化應(yīng)激的發(fā)生[24-27]。因此，本研究中EM菌組5殼河蟹血清中CAT活性顯著升高，再次印證了EM菌有助于河蟹緩解或者抑制不利條件下的應(yīng)激損傷。

3.2 EM菌對(duì)中華絨螯蟹血細(xì)胞組成的影響

血細(xì)胞在河蟹的非特異性防御中主要具有吞噬、包囊的作用，能有效殺死細(xì)菌，在河蟹血細(xì)胞類群中，半顆粒細(xì)胞能伸出偽足，具有較強(qiáng)的吞噬活動(dòng)能力，是防御反應(yīng)的關(guān)鍵細(xì)胞[28]。本研究結(jié)果表明，半顆粒細(xì)胞是河蟹血細(xì)胞的主要類群，占總血細(xì)胞數(shù)的50%以上，且EM菌組SGC含量比對(duì)照組高2.97個(gè)百分點(diǎn)，這一結(jié)果與洪宇航等[29]的結(jié)果一致。已有研究結(jié)果表明EM菌能夠降低水體中亞硝酸鹽和氨氮含量[11]，維持良好的水體環(huán)境，水體中病原微生物變少，河蟹血細(xì)胞吞噬活動(dòng)頻率較低，半顆粒細(xì)胞數(shù)量略高于對(duì)照組。

3.3 EM菌對(duì)河蟹肝胰腺免疫相關(guān)基因表達(dá)的影響

河蟹主要通過模式識(shí)別蛋白識(shí)別病原體，引起胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，通過下游的信號(hào)通路激活NF-κB,進(jìn)入細(xì)胞核調(diào)節(jié)抗菌肽等免疫因子基因的表達(dá),從而啟動(dòng)先天免疫[30,31]。Toll信號(hào)通路是河蟹主要的先天免疫信號(hào)通路之一，Toll2、Tube和Dorsal均為該通路中的重要組件[16,32]。研究表明，Toll通路相關(guān)基因表達(dá)的上調(diào)與機(jī)體非特異性免疫能力提高有關(guān)。張盛靜等[33]發(fā)現(xiàn)在飼料中添加地衣芽孢桿菌可一定程度上提高Toll受體的相對(duì)表達(dá)量，有效提高凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)抗哈維氏弧菌(Vibrioharveyi)感染的能力。本研究中，EM菌組雄蟹的Toll2、Tube、Dorsal相對(duì)表達(dá)量均顯著高于對(duì)照組，表明EM菌在一定程度上能提高機(jī)體對(duì)異物的識(shí)別能力，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)免疫機(jī)能的提高。Toll2和Tube表達(dá)量在5殼時(shí)最高，表明5殼時(shí)河蟹上岸后，識(shí)別外源病原體的能力最強(qiáng)。3殼時(shí)，河蟹Dorsal的表達(dá)量則低于其他各生長時(shí)期，表明高溫季節(jié)下，Toll信號(hào)通路受到一定的抑制，但EM菌能在一定程度上緩解高溫對(duì)河蟹免疫力的影響。本實(shí)驗(yàn)中添加EM菌能提高河蟹2殼LZM活性和5殼CAT活力，降低3殼MDA含量和5殼ALT活性，綜合以上結(jié)果說明LZM、CAT、MDA、ALT、TubemRNA、DorsalmRNA有一定的相關(guān)性，這與文英等[34]認(rèn)為Toll通路能提高抗氧化酶類及免疫酶類的活性，清除過多的氧自由基 的結(jié)果一致。HSP90是一種熱休克蛋白，機(jī)體在應(yīng)激原的誘導(dǎo)下，激活熱休克蛋白基因，合成HSPs，HSPs能使動(dòng)物迅速適應(yīng)環(huán)境的變化，保護(hù)細(xì)胞免受損傷，其可誘導(dǎo)激活多種免疫因子，參與免疫反應(yīng)[35]。研究表明高溫應(yīng)激下蝦蟹類HSP90 mRNA的相對(duì)表達(dá)量顯著提升，提升甲殼動(dòng)物的耐受性，抵抗高溫帶來的應(yīng)激損害，對(duì)機(jī)體起保護(hù)作用[36]。此外，研究表明HSP90除了與機(jī)體免疫相關(guān)，在應(yīng)激原的誘導(dǎo)下，參與機(jī)體的炎癥反應(yīng)過程，使動(dòng)物迅速適應(yīng)環(huán)境的變化，緩解氧化應(yīng)激帶來的組織損傷，保護(hù)細(xì)胞免受損傷[36,37]。本研究中，EM菌的添加顯著提高了2殼時(shí)血清中溶菌酶活性，降低了3殼時(shí)MDA含量，同時(shí)2殼時(shí)EM菌組雄蟹HSP90的表達(dá)量顯著上升，推測HSP90與河蟹的細(xì)胞免疫和抗氧化酶系統(tǒng)有關(guān)聯(lián)。本研究發(fā)現(xiàn)2殼、3殼階段河蟹肝胰腺HSP90的表達(dá)量顯著高于其他發(fā)育階段，同時(shí)EM菌組3殼雄蟹HSP90基因的相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組，提示EM菌可能通過誘導(dǎo)HSP90表達(dá)的上調(diào)，對(duì)機(jī)體在高溫條件下的應(yīng)激損傷有一定的防御作用。

3.4 EM菌對(duì)中華絨螯蟹血清免疫指標(biāo)的影響

由于河蟹體內(nèi)缺乏免疫球蛋白，因此其體液免疫主要依靠血淋巴中一些非特異性的酶或因子來進(jìn)行免疫反應(yīng)。AST和ALT是重要的氨基轉(zhuǎn)移酶，在機(jī)體蛋白質(zhì)代謝過程中發(fā)揮重要作用，其血清中含量與機(jī)體肝臟等器官損傷負(fù)相關(guān)[38]。LZM是一種堿性蛋白，能水解革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞壁，破壞和消除侵入體內(nèi)的異物，血清中較高的LZM活性表明機(jī)體的免疫能力較強(qiáng)。ALP是溶酶體的組成成分之一，直接參與磷酸基團(tuán)的轉(zhuǎn)移與磷酸酯的代謝，促進(jìn)體內(nèi)異物的清除，是動(dòng)物體內(nèi)重要的解毒酶。Mohammadian等[39]發(fā)現(xiàn)益生菌的添加能提高鯉血清溶菌酶、堿性磷酸酶活性。本研究也發(fā)現(xiàn)水體添加EM菌后2殼時(shí)雄蟹ALP活性和LZM活性顯著高于對(duì)照組；EM菌組5殼雄蟹血清ALT和1殼雄蟹AST含量顯著低于對(duì)照組；以上結(jié)果表明EM菌組河蟹具有較強(qiáng)的免疫解毒能力和較低的器官損傷水平。

4 結(jié)論

總體來說，在水體中添加EM菌有助于提高中華絨螯蟹抵抗氧化應(yīng)激的能力，也可通過調(diào)控河蟹免疫基因的表達(dá)和相關(guān)酶活性，增強(qiáng)其非特異性免疫力。然而，成蟹養(yǎng)殖周期較長，不同發(fā)育階段處于不同的季節(jié)，外界環(huán)境條件(如溫度、光照等)對(duì)養(yǎng)蟹池塘生態(tài)系統(tǒng)的影響較大，相比之下EM菌的調(diào)控作用微弱，所以不同發(fā)育階段河蟹的抗氧化和先天免疫對(duì)EM菌的響應(yīng)存在差異。因此，如何科學(xué)合理地使用EM菌，最大程度發(fā)揮EM菌的作用，還需要進(jìn)一步的研究。