種青養(yǎng)殖模式提升草魚肌肉中膠原蛋白的相關研究

張 曦，萬 瑩，席汝娟，沈志遠，何 亞，李 莉，湯 蓉，李大鵬

(華中農業(yè)大學水產學院，水產養(yǎng)殖國家級實驗教學示范中心，長江經濟帶大宗水生生物產業(yè)綠色發(fā)展教育部工程研究中心，池塘健康養(yǎng)殖湖北省工程實驗室，武漢 430070)

草魚(Ctenopharyngodonidellus)隸屬鯉形目鯉科草魚屬，是我國重要的淡水養(yǎng)殖經濟魚類，也是全球最大養(yǎng)殖產量的魚類品種。隨著社會文明的發(fā)展，人們對水產品質量安全和魚肉品質的關注度越來越高。我國草魚池塘養(yǎng)殖歷史悠久，養(yǎng)殖方式多樣，其中以投喂飼養(yǎng)方式為主，常見的草魚池塘養(yǎng)殖模式有以種青喂草為主的種青養(yǎng)殖模式和投喂人工配合飼料的單一飼料養(yǎng)殖模式，不同養(yǎng)殖模式下草魚肌肉品質的差異顯著[1]。

目前對草魚肌肉品質的研究多集中在營養(yǎng)成分、品質特性和肌纖維等方面[1-3]，但對于不同養(yǎng)殖模式下草魚肌肉中膠原蛋白的相關研究還十分欠缺。膠原蛋白的含量和存在形態(tài)在維持肌肉結構、柔韌性、硬度等肌肉質構特性方面同樣發(fā)揮著重要作用[4-6]。在草魚的相關研究中發(fā)現(xiàn)，脆肉鯇中肌肉質地發(fā)生脆化的主要原因是肌肉中肌膜組織的加厚，膠原蛋白含量增多，膠原纖維排列更加緊密有序[7]。因此，膠原蛋白在草魚肌肉品質的研究中具有重要意義，但目前相關研究較少。

目前已知的膠原蛋白類型共29種，在魚類肌肉中存在的主要為I型膠原蛋白[8-9]。在調控I型膠原蛋白的合成過程中，TGF-β/smads(transforming growth factor-β/drosophila mothers against decapentaplegic proteins)信號通路起到至關重要的作用。TGF-β/smads通路主要調控相關細胞外基質合成基因的轉錄，其中TGF-β1能通過激活其下游smad4基因，調控I型膠原合成基因col1α1和col1α2的轉錄[9-11]。因此，草魚膠原蛋白的形成可能受到以上多種相關基因的調控。

本實驗開展了種青養(yǎng)殖模式下草魚肌肉中膠原蛋白的相關研究，并與飼料養(yǎng)殖模式下草魚肌肉進行了對比分析，探討不同養(yǎng)殖模式下草魚肌肉中膠原蛋白的分布、含量和相關基因的表達分析，為提升草魚肌肉品質和健康養(yǎng)殖模式提供理論基礎和數據支持。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

種青養(yǎng)殖模式的草魚(青飼料為黑麥草、小米草和蘇丹草)和飼料養(yǎng)殖模式的草魚(飼料來源為通威飼料有限公司)來自于湖北洪湖大同池塘養(yǎng)殖區(qū)，魚體平均重量(820±50) g，平均體長(40±2) cm，均無顯著性差異，隨機挑選健康草魚5尾進行實驗。

1.2 實驗方法

1.2.1 組織學觀察實驗

草魚急殺后，將背部肌肉按照肌肉紋理各取約(1 cm×1 cm×1 cm)大小的肌肉，在磷酸鹽緩沖液中洗去血污，放入4%多聚甲醛固定液中進行固定；采用組織學石蠟切片技術進行組織塊橫切面連續(xù)切片；本實驗采用Masson染色方法染色切片；使用Nikon Eclipse 80i顯微鏡下對肌肉切片進行拍照觀察，觀察肌纖維及結締組織，并采用NIS-Elements軟件測量肌纖維面積和直徑。

1.2.2 透射電鏡肌膜膠原纖維觀察

取草魚背部肌肉按肌肉的紋理規(guī)格整齊、小于3 mm3的肌肉小塊，一分鐘之內迅速放入裝有1 mL 2.5%戊二醛的電鏡固定液的2 mL離心管中，置于4 ℃冰箱內保存。送樣于華中農業(yè)大學電鏡平臺，重新轉入新的裝有2.5%戊二醛的1.5 mL離心管中，標注好編號。生物樣品制片的前處理方法參照林如輝等[12]的方法，使用H-7650(日立)透射電鏡觀察。

1.2.3 膠原蛋白含量測定

采集草魚背肌樣品用保鮮膜封存于-20 ℃的冰箱內，稱重后置于冷凍干燥機中冷凍干燥，準確稱取于水解管內，加入6 mol/L HCl抽真空后充入高純氮氣，將水解管置于110 ℃干燥箱內水解22 h后，取出。真空干燥后蒸干，然后加入0.02 mol/L檸檬酸鈉緩沖液1 mL，高速離心過濾后上機。使用835-50型氨基酸自動分析儀(日立)測定羥脯氨酸含量，并計算膠原蛋白含量。

膠原蛋白含量=羥脯氨酸含量×100/11×100%[13]。

1.2.4 膠原蛋白相關基因表達

使用Trizol試劑法提取兩種養(yǎng)殖模式下草魚肌肉的總RNA，檢測質量并測定純度后，使用TaKaRa反轉錄試劑盒合成cDNA。合成cDNA時RNA模板的統(tǒng)一加入量為1 000 ng,采用Prime Script RTreagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa)反轉錄試劑盒，按照說明書方法進行cDNA合成。

根據GenBank中已有的col1α1、col1α2、TGF-β1和smad4序列，用Primer5.0軟件設計特異性引物。熒光定量PCR以β-actin為內參基因，引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，引物序列見表1。

表1 草魚基因定量的引物序列

以cDNA為模板，分別采用相應基因的引物進行實時熒光定量PCR。采用Hieff qPCR SYBR Green Master Mix(YEASEN,Shanghai,China)試劑盒， 按照說明書進行熒光定量實驗。PCR反應條件為：95 ℃預變性3 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。

1.2.5 數據統(tǒng)計及分析

所得數據以平均值±標準誤差表示，用Graphpad Prism 7.00作圖。草魚基因相對表達水平采用2-ΔΔCt法計算。采用SPSS 18.0統(tǒng)計分析軟件對數據進行單因素方差分析(One-way ANOVA)，Duncan's法多重比較分析。當P<0.05時，差異顯著；當P<0.01時，差異極顯著。

2 結果

2.1 肌肉的組織學觀察

由圖1中可以清楚地觀察到肌纖維和肌膜結締組織的分布，Masson染色后肌纖維呈紅色，膠原纖維呈藍色，膠原纖維是肌膜結締組織的最主要組成部分。種青養(yǎng)殖模式下草魚肌肉與飼料養(yǎng)殖模式下的草魚相比，肌膜結締組織更厚，其膠原纖維更多。在肌纖維的觀察中，由圖1和圖2可知，種青養(yǎng)殖模式下草魚肌肉的肌纖維直徑和面積均小于飼料養(yǎng)殖模式下的草魚肌肉，且存在極顯著差異。

圖1 草魚肌肉的組織學結構(橫切，×100)

圖2 草魚肌肉肌纖維直徑和面積

2.2 肌膜膠原纖維觀察

由圖3中可清晰地觀察肌膜中膠原纖維的分布。種青養(yǎng)殖模式下的草魚肌膜中的膠原纖維成密集的束狀，排列整齊緊密，無間隙且周圍組織緊密(圖A)；而飼料養(yǎng)殖模式下的肌膜中的膠原蛋白纖維成疏松的束狀，排列不緊密，有明顯間隙，周圍組織分散(圖B)。

圖3 草魚肌肉肌膜上的膠原蛋白纖維結構(縱切，×20000)

2.3 肌肉中的膠原蛋白含量

表2所示為兩種養(yǎng)殖模式下草魚肌肉中羥脯氨酸含量及膠原蛋白含量。種青養(yǎng)殖模式下草魚肌肉中膠原蛋白含量高于飼料養(yǎng)殖下的草魚肌肉，并且經過統(tǒng)計學分析其含量有極顯著差異。

表2 草魚肌肉中羥脯氨酸及膠原蛋白的含量

2.4 草魚肌肉中膠原蛋白相關基因的表達

兩種養(yǎng)殖模式下草魚肌肉中均檢測到col1α1、col1α2、TGF-β1和smad4的mRNA表達，種青養(yǎng)殖模式下草魚肌肉中I型膠原蛋白相關基因的mRNA相對表達量均高于飼料養(yǎng)殖模式下的草魚肌肉(圖4)。其中，col1α1、col1α2和smad4的mRNA表達有極顯著差異。

圖4 草魚肌肉中col1α1、col1α2、TGF-β1和smad4基因的mRNA相對表達量

3 討論

肌肉中膠原蛋白的含量和存在形態(tài)會對肌膜結締組織的密度和硬度造成直接影響，從而改變肌肉的相關特性，其含量和性質在很大程度上影響肉品的感官及加工品質[6,7,14]。本實驗研究結果表明，種青養(yǎng)殖模式下草魚肌肉中膠原纖維分布、膠原蛋白含量及相關基因表達量均高于飼料養(yǎng)殖模式下的草魚肌肉。在肌肉組織切片觀察中發(fā)現(xiàn)，種青養(yǎng)魚模式下草魚肌肉的肌纖維直徑和面積小于飼料養(yǎng)殖模式下的草魚肌肉。在鱸魚(DicentrarchuslabraxL.)的研究中發(fā)現(xiàn)，野生鱸魚的肌纖維直徑比養(yǎng)殖鱸魚的肌纖維直徑更小，并且這可能與野生鱸魚更強的肌肉質構性能如肌肉硬度等直接相關[15]。同時，肌纖維直徑與肌肉膠原蛋白含量密切相關，直徑較小的肌纖維通常具有較高的膠原蛋白含量[2,6]。本研究中也獲得類似結果，種青養(yǎng)殖草魚的肌纖維直徑更小，其膠原蛋白含量更高。另一方面，本研究中發(fā)現(xiàn)種青養(yǎng)殖模式下的草魚肌膜結締組織較粗。肌膜結締組織的主要組成成分為膠原蛋白，肌肉中結締組織與肌肉的質構性能密切相關[16-17]。在脆肉鯇的研究中發(fā)現(xiàn)，肌肉中結締組織的增厚和膠原蛋白含量的增多是其質構性能增強的重要原因[7,18]。在鯉魚(Cyprinuscarpio)、角鯊(Squaluscubensis)的研究中發(fā)現(xiàn)，隨著膠原蛋白含量的增加，肌肉質地硬度增強[8]。同時，本研究對草魚肌肉肌膜中的膠原蛋白纖維進行了電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)種青養(yǎng)殖模式下的草魚比飼料養(yǎng)殖模式下的草魚肌膜中的膠原蛋白纖維更多、排列更緊密有序。這也為種青養(yǎng)殖模式下草魚肌肉質構性能的提升提供了一定的理論依據[2]。

膠原蛋白的合成受到相關基因的調控，本研究中發(fā)現(xiàn)種青養(yǎng)殖模式下草魚肌肉中I型膠原蛋白相關基因col1α1、col1α2和smad4的mRNA表達均顯著高于飼料養(yǎng)殖模式下草魚。在TGF-β/smads通路中TGF-β1能通過激活其下游smad4，調控I型膠原合成基因col1α1、col1α2的轉錄[10-11]。在col1α1和col1α2表達后會形成相應的多肽鏈α1鏈和α2鏈，兩條α1鏈和一條α2鏈共同形成具有三股螺旋立體構造的I型膠原蛋白。因此，種青養(yǎng)殖模式提升膠原蛋白含量的作用機制可能通過TGF-β1/smad4通路誘導col1α1和col1α2的表達上調從而增加肽鏈α1鏈和α2鏈的生成。因此，種青養(yǎng)殖模式可提升草魚肌肉中I型膠原蛋白相關基因的表達，從而提升膠原蛋白的含量，這也與本實驗中種青養(yǎng)殖模式下草魚膠原蛋白含量更高的結果一致。I型膠原蛋白具有獨特的三重螺旋構造，并在適宜的條件下有序排列形成膠原纖維，在前期研究中發(fā)現(xiàn)在鱘魚I型膠原蛋白的體外培養(yǎng)過程中，外界鹽度的變化對于鱘魚I型膠原蛋白性狀會造成顯著影響，主要表現(xiàn)為膠原纖維形成速度加快、膠原纖維形態(tài)加粗，可對組織硬度造成影響[19,20]。膠原蛋白纖維形成能力是膠原蛋白重要的生物學特性，膠原纖維的形成速度及纖維形態(tài)會對肌膜產生直接影響，進一步影響肌肉的質構特性。在本實驗中，在肌膜中膠原纖維的觀察中發(fā)現(xiàn)，種青養(yǎng)殖模式下的草魚肌膜中的膠原纖維成密集的束狀，排列整齊緊密，而飼料養(yǎng)殖模式下的肌膜中的膠原蛋白纖維較疏松，這也與種青養(yǎng)殖模式下草魚肌肉中I型膠原蛋白相關基因的表達與含量的提升趨勢一致。

膠原蛋白富含多種人體需要的氨基酸，同時還含有在一般蛋白中少見的羥脯氨酸，營養(yǎng)價值豐富[19]。膠原蛋白具有較高的生物相容性和生物降解性，同時其生物抗原性較低，被廣泛應用于食品、化妝品和醫(yī)藥用品等行業(yè)[19-21]。近年來，魚類膠原蛋白作為一種膠原蛋白資源來源，與陸生動物膠原蛋白相比，具有避免瘋牛病等人獸共患癥和宗教信仰的優(yōu)勢，應用前景更加廣泛[20-23]。因此，種青養(yǎng)殖草魚膠原蛋白含量的提升，也進一步提升了草魚的營養(yǎng)價值和產業(yè)應用價值。

本研究從肌肉組織學、膠原蛋白含量及膠原蛋白相關基因表達方面解析了種青養(yǎng)殖模式對草魚肌肉膠原蛋白的相關影響。研究表明種青養(yǎng)魚模式可提升草魚肌肉中膠原蛋白的含量，并從分子生物學角度初步解析了其作用機制，為提升草魚肌肉品質和健康養(yǎng)殖模式提供了理論基礎和數據支持。