miR-133b靶向調(diào)控FOXL2對COV434細胞遷移增殖的影響

孫樹棟 劉俊 蘇薇潔

人類FOXL2是一個單外顯子基因，長度約為2 700 bp，定位于3q23區(qū)域，其編碼的蛋白包含1個forkhaed DNA結(jié)合區(qū)，此結(jié)合區(qū)含有101個氨基酸，主要表達于發(fā)育的眼瞼、胎兒的卵巢顆粒細胞及成人的卵巢[1-2]。小瞼裂綜合征(Blepharophimosis Syndrome，BPES)是一種以眼瞼異常為主要表現(xiàn)的先天性疾病，主要表現(xiàn)為上瞼下垂、瞼裂狹小、反向型內(nèi)眥贅皮、內(nèi)眥間距增寬，是一種常見的常染色體顯性遺傳病。FOXL2最早作為BPES的致病基因被克隆定位，同時也是部分卵巢早衰(Premature ovarian failure，POF)患者的致病基因。大量研究表明，部分BPES患者中存在FOXL2的基因突變；進一步研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXL2基因作為人類常染色體基因，不僅僅參與了BPES的發(fā)生發(fā)展，還在類固醇代謝、子宮內(nèi)膜的發(fā)育、抑制卵巢顆粒細胞分化過程中發(fā)揮作用[3-4]，其生物學效應亦表現(xiàn)在卵巢周期性發(fā)育及其功能維持上[5]。FOXL2是首次被發(fā)現(xiàn)的脊椎動物中標記卵巢分化的性別雙態(tài)性指示物，也是最早被發(fā)現(xiàn)的在影響卵巢發(fā)育及保持卵巢功能穩(wěn)定方面發(fā)揮重要作用的基因。

miRNA是生物體高度保守的非編碼小分子RNA，長度約為17～26 bp，其作用靶點為目的基因3′UTR區(qū)域，與此區(qū)域結(jié)合后通過發(fā)揮生物學效應(即基因沉默[6])在基因轉(zhuǎn)錄水平上負向調(diào)控其表達[7]。主要作用方式為降解目的基因的miRNA或抑制目的基因翻譯。生物信息學研究表明，人類可能有超過90%的基因受到miRNA的調(diào)控，幾乎參與了調(diào)控人類生長發(fā)育的各個階段。目前，miRNA對基因的調(diào)控功能以及FOXL2在卵巢顆粒細胞分化和卵巢發(fā)育中的作用已基本明確；同時，miR-133b能對FOXL2產(chǎn)生靶向調(diào)控作用。但是，關(guān)于miR-133b通過調(diào)控FOXL2基因的表達，繼而影響卵巢顆粒細胞腫瘤(Granulosacell tumor，GCT)的發(fā)生發(fā)展的研究較少。因此，本試驗通過建立用Lipofectamine 3000分別瞬時轉(zhuǎn)染miR-133bmimics及NC mimics的高轉(zhuǎn)染效率模型，探索miR-133b對人卵巢顆粒腫瘤細胞(COV434)中的FOXL2 基因進行靶向調(diào)控的作用，及其對COV434細胞遷移增殖的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

COV434細胞株(武漢普諾賽生命科技有限公司)；Lipofectamine 3000 Reagent、DMEM培養(yǎng)液、MTT細胞增殖檢測試劑、Opti-MEM ReducedSerum Medium、牛血清(GIBCO公司，美國)；MiR-133bmimics(英濰捷基貿(mào)易有限公司)；RIPA裂解液(北京索萊寶科技有限公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和RT-PCR試劑(TaKaRa公司，日本)；BCA 蛋白定量試劑盒(博士德生物有限公司)；0.05% Trypsin-EDTA (華美生物工程公司)；Western blot試驗所用抗體、內(nèi)參(英格恩生物技術(shù)公司)；本試驗相關(guān)引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 COV434細胞培養(yǎng)

將人COV434細胞株接種于含10%胎牛血清的L-DMEM 培養(yǎng)基中，置于5%CO2、37 ℃、飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每48 h應用0.05% Trypsin-EDTA消化傳代1次。本試驗選用的COV434細胞均處于指數(shù)生長期。

1.2.2 細胞轉(zhuǎn)染

試驗分為miR-133b轉(zhuǎn)染組(COV434細胞轉(zhuǎn)染miR-133bmimics)、空白對照組(COV434細胞無任何轉(zhuǎn)染)、陰性對照組(COV434細胞轉(zhuǎn)染NC mimics)。轉(zhuǎn)染前24 h將COV434細胞接種于6孔板中，接種濃度為3×105/mL，然后根據(jù)Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染說明書，配制轉(zhuǎn)染液，將轉(zhuǎn)染液對應加入到miR-133b轉(zhuǎn)染組及陰性對照組，加液同時晃動培養(yǎng)板，充分混勻后，置于5%CO2、37 ℃、飽和濕度的培養(yǎng)箱中孵育培養(yǎng)12 h，熒光倒置顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率。

1.2.3 生物信息學預測

通過miRNA 靶基因預測網(wǎng)站(http://www.targetscan.org/vert_72/)預測miR-133b是否作用于靶基因FOXL2。

1.2.4 實時熒光定量PCR檢測

根據(jù)FOXL2生物信息設計引物，具體引物序列見表1。轉(zhuǎn)染48 h后收集每孔中的COV434細胞，抽提細胞總RNA，抽提方式為Trizol法，抽提產(chǎn)物檢測后，進行逆轉(zhuǎn)錄反應，cDNA模板為逆轉(zhuǎn)錄反應所得產(chǎn)物，內(nèi)參對照為GAPDH，PCR擴增體系為25 μl。按98 ℃ 5 min，98 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，68 ℃ 30 s，設置40個循環(huán)，在熒光定量PCR儀中進行擴增。PCR擴增結(jié)束后，測算不同組的FOXL2mRNA相對表達量，計算方法為2-ΔΔCt。

表1 實時熒光定量PCR所用引物序列Table 1 Primer sequences of real-time PCR

1.2.5 Western blot檢測目的蛋白

轉(zhuǎn)染成功48 h后，用RIPA裂解液裂解COV434細胞，抽提細胞總蛋白，測定各孔細胞的蛋白濃度，一抗孵育(FOXL2和GAPDH)，加入封閉液后搖床過夜；洗膜，加入二抗，搖床中孵育1 h。使用Image J軟件對條帶的灰度值進行計算并統(tǒng)計分析，使用目的蛋白FOXL2的灰度值除以內(nèi)參GAPDH的灰度值，以校正誤差，所得結(jié)果為目的蛋白FOXL2的相對表達水平。

1.2.6 細胞遷移能力檢測

接種轉(zhuǎn)染COV434細胞24 h后，利用200 μL無菌槍頭垂直于孔板設計劃痕，PBS漂洗細胞3次，放入37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，依次觀察0 h、24 h的細胞遷移情況，使用Image J軟件隨機劃取6～8條水平線測定細胞平均遷移距離。

1.2.7 MTT法檢測細胞增殖情況

將COV434細胞接種于96孔板，每組4～5個復孔，按轉(zhuǎn)染說明分別對miR-133b轉(zhuǎn)染組及陰性對照組轉(zhuǎn)染miR-133bmimics、NC mimics，轉(zhuǎn)染成功后，每孔內(nèi)加入20 μL MTT(5 mol/L)，培育4 h，移除孔內(nèi)培養(yǎng)液，加入150 μL二甲基亞砜，繼續(xù)培育4 h，使結(jié)晶物充分溶解。取出96孔板，將其置于酶聯(lián)免疫檢測儀上，震蕩15 s，然后在490 nm下測量光密度值(OD)，繪制增殖曲線并計算細胞增殖率。細胞增殖率=miR-133b轉(zhuǎn)染組OD值/陰性對照組OD值×100%。

1.2.8 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 COV434細胞轉(zhuǎn)染結(jié)果

熒光顯微鏡下，轉(zhuǎn)染12 h后2種質(zhì)粒逐漸出現(xiàn)比較清晰的紅色熒光，其數(shù)量隨時間而增長，48 h后達到峰值(圖1)。

圖1 miR-133b轉(zhuǎn)染COV434細胞后12 h、48 h的熒光表達情況Fig.1 Fluorescence expression of miR-133b after transfection of COV434 cells at 12 h and 48 h

2.2 預測miR-133b作用于靶基因FOXL2的結(jié)果

預測分析結(jié)果顯示，miR-133b在FOXL2 的3′UTR 區(qū)域存在2個結(jié)合位點，miR-133b與FOXL2的互補序列如圖2所示。

圖2 miR-133b作用于FOXL2的預測結(jié)果Fig.2 Bioinformatics predicted whether miR-133b acted on the FOXL2 gene

2.3 熒光定量PCR檢測結(jié)果

如圖3所示，陰性對照組與空白對照組比較，F(xiàn)OXL2mRNA的表達無統(tǒng)計學差異(P>0.05)；miR-133b轉(zhuǎn)染組與空白對照組、陰性對照組比較，F(xiàn)OXL2mRNA的表達均有顯著差異(P<0.05)。

2.4 Western Blot 檢測結(jié)果

圖4顯示，陰性對照組與空白對照組相比，F(xiàn)OXL2蛋白的表達量無明顯下降，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。miR-133b轉(zhuǎn)染組與空白對照組相比，F(xiàn)OXL2 蛋白的表達量下降40.3%；miR-133b轉(zhuǎn)染組與陰性對照組相比，F(xiàn)OXL2 蛋白的表達量下降36.8%，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

*：與miR-133b轉(zhuǎn)染組相比，P<0.05。*: Compared with miR-133b transfection group, P<0.05.圖3 RT-PCR檢測miR-133b轉(zhuǎn)染COV434后FOXL2 mRNA的表達Fig.3 RT-PCR detection of FOXL2 mRNA expression after miR-133b transfected to COV434

A：Western blot結(jié)果；B：半定量分析；*：與miR-133b轉(zhuǎn)染組相比，P<0.05。A: Results of Western blot; B: Semi-quantitative analysis; *: Compared with miR-133b transfection group, P<0.05.圖4 Western blot法檢測miR-133b轉(zhuǎn)染COV434后FOXL2的蛋白水平Fig.4 Western blot detection of the FOXL2 expression after miR-133b transfected to COV434

2.5 細胞遷移能力比較

圖5表明，空白對照組24 h細胞遷移距離為(16.482 4±1.485 2)dmm，陰性對照組為(17.251 9±1.234 6)dmm、miR-133b組為(11.601 8±1.115 9)dmm。miR-133b轉(zhuǎn)染組24 h的COV434細胞遷移距離均短于空白對照組及陰性對照組(P<0.05)，陰性對照組與空白對照組比較，則無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。

2.6 MTT法檢測細胞增殖

MTT法檢測結(jié)果(圖6)顯示，陰性對照組與空白對照組相比，COV434細胞增殖能力無顯著變化，兩組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；miR-133b轉(zhuǎn)染組COV434細胞的增殖明顯受到抑制，48 h后增殖能力下降明顯，與空白對照組及陰性對照組相比差異顯著(P<0.05)。

A：劃痕試驗結(jié)果(10×)；B：細胞遷移距離分析；*：與miR-133b轉(zhuǎn)染組相比，P<0.05。A: Results of scratch test (×10); B: Cell migration distance analysis; *: Compared with miR-133b transfection group, P<0.05.圖5 miR-133b轉(zhuǎn)染COV434后的細胞遷移情況Fig.5 Cell migration after miR-133b transfected to COV434

*：與miR-133b轉(zhuǎn)染組相比，P<0.05。*: Compared with miR-133b transfection group, P<0.05.圖6 MTT法檢測miR-133b轉(zhuǎn)染COV434細胞的增殖情況Fig.6 MTT detection of the cell proliferation after miR-133b transfected to COV434

3 討論

miRNA是一類由內(nèi)源基因編碼的小分子RNA，在多種先天性及后天性疾病中均可發(fā)揮生物學效應，主要作用方式為調(diào)控基因表達，但目前尚未發(fā)現(xiàn)其調(diào)控基因表達的能力與其來源之間的明確的相關(guān)性[8]。miRNA調(diào)控機制復雜，且調(diào)控范圍較廣，與細胞增殖分化、細胞凋亡、脂肪代謝等各種生物學進程相關(guān)，可以調(diào)控體內(nèi)大部分編碼基因。研究顯示，miRNA參與了多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展，其中有多種miRNA參與了生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)育調(diào)控[9-11]。研究表明，miR-133b在部分胃癌、肺癌組織中的表達下調(diào)，過表達的miR-133b能夠顯著抑制這些腫瘤細胞的增殖、轉(zhuǎn)移及侵襲[12-13]。然而，Qin等[14]發(fā)現(xiàn)，miR-133b在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中起到促進作用，可通過調(diào)控宮頸癌細胞的增殖引起宮頸癌的浸潤轉(zhuǎn)移。與之相反的是，Liu等[15]的研究顯示，過表達的FOXL2基因可能表現(xiàn)為一種抑癌基因，通過靶向調(diào)控來抑制宮頸癌的增殖、轉(zhuǎn)移及侵襲。Wang等[16]研究顯示，在miR-30家族中，絕大部分成員均能發(fā)揮對FOXL2的調(diào)控作用，其中miR-30a對FOXL2表達的調(diào)控主要起抑制作用。在卵巢顆粒腫瘤細胞系中，與對照組相比，同樣在miR-30a的干預下，Ago2基因敲除組卻能使目的基因FOXL2的表達顯著上調(diào)，可以推測Ago2基因可能是miR-30a的作用靶點。由此可見，miRNA作為FOXL2 的重要調(diào)控因子，其調(diào)控方式及對象均呈現(xiàn)多樣性。

卵巢性索-間質(zhì)腫瘤又稱性腺間質(zhì)腫瘤，在育齡期以及絕經(jīng)后女性中多發(fā)，具有惡性程度低、晚期易復發(fā)等特點，以卵巢顆粒細胞腫瘤(Granulosa cell tumor，GCT)最為常見。2014年，世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)將卵巢GCT分為成年型和幼年型。成年型表現(xiàn)為因子宮內(nèi)膜的病理性變化而導致的月經(jīng)紊亂，幼年型主要表現(xiàn)為雌激素水平失衡引起的性早熟。研究表明，在成年型卵巢GCT的諸多致病機制中，F(xiàn)OXL2基因的部分堿基突變是重要的非獨立致病因素[17-19]。FOXL2基因突變引發(fā)一系列的轉(zhuǎn)錄、編碼、翻譯的改變，使得重要的細胞通路TNF-β通路表達下調(diào)，繼而誘導卵巢GCT的發(fā)生并促進其發(fā)展[20]。Kim等[21]研究發(fā)現(xiàn)，在卵巢GCT中，突變型FOXL2基因在腫瘤細胞調(diào)亡的進程中不能發(fā)揮調(diào)控誘導作用，因此推測FOXL2基因突變作為重要致病機制，在卵巢GCT的發(fā)病進程中發(fā)揮重要作用。Pierini等[22]以FOXL2作為卵巢GCT免疫治療的靶向標志物，將FOXL2cDNA與破傷風毒素的免疫增強域融合來開發(fā)質(zhì)粒DNA疫苗，延緩了小鼠腫瘤的進展，且不影響小鼠的生殖功能。對FOXL2基因測序結(jié)果進行分析發(fā)現(xiàn)，在成年型卵巢GCT患者中，不但存在諸如C.402C→G突變等個別的堿基突變，還出現(xiàn)了FOXL2 DNA錯配修復等一系列DNA編輯缺陷[23]，由此可見，在卵巢GCT發(fā)生發(fā)展的進程中，F(xiàn)OXL2基因突變不是獨立因素。Dai等[24]的研究表明，miR-133b與卵巢顆粒細胞中FOXL2介導的雌二醇釋放之間存在直接聯(lián)系，miR-133b參與了促卵泡激素誘導的雌激素產(chǎn)生，miR-133b通過直接靶向3'UTR來下調(diào)顆粒細胞中FOXL2的表達，從而抑制FOXL2介導的StAR和CYP19A1的轉(zhuǎn)錄抑制，進而促進雌二醇的產(chǎn)生。動物試驗證實，miR-383可通過抑制細胞周期蛋白cyclin D1、cyclin B、CDK1、CDK2、CDK4的表達，使得卵泡顆粒細胞在G0/G1期便出現(xiàn)細胞發(fā)育變慢甚至停滯，從而對卵泡顆粒細胞的發(fā)育增殖產(chǎn)生明顯的抑制作用[25]。FOXL2是卵巢顆粒細胞中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，ChIP-seq分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXL2的結(jié)合位點位于與其靶基因距離較遠的非編碼區(qū)，而這些被調(diào)控的靶基因大部分參與了細胞的遷移與增殖，同時發(fā)現(xiàn)其靶基因Phactr1的表達下降，而Phactr1與肌動蛋白的細胞骨架動力學直接相關(guān)[26]。研究顯示，miR-133b在hela細胞中也存在明顯的生物學效應，可通過靶向調(diào)控FOXL2降低其mRNA表達，從而促進宮頸癌細胞的增殖[27]。但目前尚未有miR-133b在COV434細胞系中的研究報道。因此，本研究設計合成miRNA-133bmimics，瞬時轉(zhuǎn)染入COV434細胞中，研究miR-133b對FOXL2基因的表達調(diào)控。結(jié)果顯示，通過在COV434細胞系中過表達miR-133b，能夠靶向抑制人卵巢顆粒腫瘤細胞中FOXL2的表達，F(xiàn)OXL2mRNA和蛋白的表達量顯著下降，充分佐證了miR-133b在FOXL2基因調(diào)控中發(fā)揮的重要作用。

BPES主要表現(xiàn)為先天性眼瞼發(fā)育異常，可分為兩型：Ⅰ型患者同時伴有卵巢功能早衰，Ⅱ型患者僅有眼瞼畸形。隨著對BPES基因?qū)W研究的不斷深入，F(xiàn)OXL2基因已經(jīng)被確定為BPES的致病基因。BPES患者的FOXL2基因出現(xiàn)了大量的移碼突變、錯意突變等基因突變[28]，但仍有部分伴有卵巢功能早衰的Ⅰ型患者未發(fā)現(xiàn)FOXL2的突變，所以相關(guān)研究延伸到了FOXL2的功能及其調(diào)控機制方面。作為轉(zhuǎn)錄因子，F(xiàn)OXL2不僅對下游靶基因進行調(diào)控，同時其表達又受到上游STAT3的調(diào)控[29]。本實驗結(jié)果表明，在COV434中過表達的miR-133b通過高選擇性靶向調(diào)控，能夠顯著抑制FOXL2基因的表達，進而在抑制COV434細胞的增殖與遷移過程中發(fā)揮重要作用，揭示了miR-133b、FOXL2以及COV434細胞增殖遷移之間的關(guān)系，對明確BPES的發(fā)病機制以及卵巢GCT的發(fā)生發(fā)展具有重要的基礎研究價值。

miRNA無論在腫瘤的發(fā)生還是浸潤轉(zhuǎn)移過程中均扮演重要角色，其中一部分miRNA分子發(fā)揮促癌基因的作用，在促進腫瘤細胞增殖的同時加速腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移，而另一部分miRNA分子的作用恰恰相反，發(fā)揮著抑癌基因的作用[30-32]，對腫瘤細胞增殖和浸潤轉(zhuǎn)移起到抑制作用，并能誘導腫瘤細胞凋亡，加速腫瘤的消失。FOXL2基因不僅參與了人類顱面部和卵巢的發(fā)育，在BPES及卵巢早衰的發(fā)生發(fā)展中也具有重要作用。本研究驗證了miR-133b作為調(diào)控因子能抑制FOXL2的表達，通過抑制其表達來抑制COV434細胞的遷移增殖。需要說明的是，miR-133b靶向調(diào)控FOXL2抑制COV434細胞增殖與遷移的具體作用機制，以及miR-133b在GCT和其他類型惡性腫瘤中的功能，仍需進一步探索。