紫歸長(zhǎng)皮軟膏促進(jìn)大鼠難愈性創(chuàng)面修復(fù)及NGF分泌的研究

王永靈 蕢綱 廖明娟 李琰

難愈性創(chuàng)面是指各種原因?qū)е碌臋C(jī)體正常皮膚及組織損傷后，經(jīng)正規(guī)治療無(wú)法愈合的創(chuàng)面[1]。難愈性創(chuàng)面具有病因復(fù)雜、病程長(zhǎng)、難于愈合等特點(diǎn)，給臨床治療帶來(lái)極大的困難，且近年來(lái)發(fā)病率呈上升趨勢(shì)[2]。中醫(yī)中藥治療難愈性創(chuàng)面有悠久的歷史，具有明顯的療效及特色。我院自制的紫歸長(zhǎng)皮軟膏具有祛腐生肌、促進(jìn)創(chuàng)面愈合的作用。本研究旨在觀察紫歸長(zhǎng)皮軟膏治療大鼠難愈性創(chuàng)面的組織形態(tài)學(xué)變化，及組織內(nèi)神經(jīng)生長(zhǎng)因子(Nerve growth factor，NGF)的分泌情況，為臨床采用該藥治療難愈性創(chuàng)面提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

32只雄性清潔級(jí)SD大鼠，體質(zhì)量160～205 g，平均(183.06±7.23) g，由上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，許可證號(hào)為SCXK(滬)2008-0016。隨機(jī)分為4組：正?？瞻捉M、模型空白組、紫歸長(zhǎng)皮軟膏組和貝復(fù)濟(jì)組，每組8只。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

貝復(fù)濟(jì)(63 000 IU/瓶)，為珠海億勝生物制藥有限公司生產(chǎn)(批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字S10980077)；紫歸長(zhǎng)皮軟膏(滬藥制字Z05060611)，我院制劑室提供。0.9%生理鹽水，上海長(zhǎng)征富民金山制藥有限公司生產(chǎn)(批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H31021918)；氫化可的松琥珀酸鈉(50 mg/支)，天津生物化學(xué)制藥有限公司生產(chǎn)(批號(hào)：20101010)。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

免疫組織化學(xué)-鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶連接法試劑盒(Zymed公司，美國(guó))、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠抗體(北京中山生物技術(shù)有限公司)、EnVision試劑(HRP/Rabbit)抗兔即用型(Dako公司，丹麥)、NGF一抗(兔抗鼠，分別為1∶100、1∶50稀釋， Santa Cruz 公司，美國(guó))、生物素標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白G(Vector公司，德國(guó))。

IMS細(xì)胞圖像分析儀系統(tǒng)和醫(yī)學(xué)圖像分析軟件(上海申藤信息技術(shù)有限公司)、攝像機(jī)(MV-CP410， Panasonic公司，日本)、光學(xué)顯微鏡(Olympus公司，日本)、切片機(jī)(RM2145， Leica公司，德國(guó))、電熱恒溫水浴鍋(DK-S22，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

1.4 造模方法

參考文獻(xiàn)[3]的方法制備SD大鼠難愈性創(chuàng)面模型。除正?？瞻捉M常規(guī)飼養(yǎng)外，其余3組大鼠均連續(xù)3 d肌肉注射氫化可的松琥珀酸鈉(80 mg/Kg)，經(jīng)血糖檢測(cè)符合糖尿病大鼠模型標(biāo)準(zhǔn)，于第4 d進(jìn)行創(chuàng)面造模。4組大鼠腹腔麻醉后，于腰椎正中偏上處備皮，剪去皮下組織至肌筋膜，制成大鼠全層皮膚缺損開(kāi)放性創(chuàng)面(直徑15 mm)模型。模型空白組、貝復(fù)濟(jì)組和紫歸長(zhǎng)皮軟膏組3組于創(chuàng)面造模當(dāng)天、次日繼續(xù)肌注氫化可的松琥珀酸鈉。大鼠4只一籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)水飲食。

1.5 創(chuàng)面處理

正?？瞻捉M、模型空白組采用生理鹽水紗布覆蓋傷口，外用滅菌級(jí)干紗布包扎。紫歸長(zhǎng)皮軟膏組采用紫歸長(zhǎng)皮軟膏外敷。貝復(fù)濟(jì)組采用貝復(fù)濟(jì)噴傷口，滅菌級(jí)干紗布覆蓋創(chuàng)面。4組創(chuàng)面均每天換藥1次，分別于第7、10 d取創(chuàng)面組織標(biāo)本。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 HE染色

取長(zhǎng)約5 mm的創(chuàng)面肉芽組織，4%多聚甲醛固定，OTC包埋、切片(厚度12 μm)，HE染色，100倍光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.6.2 免疫組化

石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，PBS洗3×3 min；用pH 6.0的0.01 mol/L檸檬酸緩沖液熱誘導(dǎo)修復(fù)，室溫自然冷卻，PBS洗3×3 min；0.3%的H2O2抑制內(nèi)源性過(guò)氧化物酶20 min；PBS洗3×3 min；20%羊血清室溫孵育30 min后滴加一抗，37 ℃孵育2 h；PBS洗3×3 min；EnVision試劑37 ℃孵育30 min；PBS洗3×3 min；DAB顯色8～12 min；蘇木素襯染，熱水藍(lán)化；吹干后，樹(shù)脂封片；鏡下觀察，背景呈紫藍(lán)色，陽(yáng)性產(chǎn)物呈棕黃色或黃色。測(cè)定圖像中陽(yáng)性區(qū)域面積和吸光度值，每張切片至少分析3個(gè)視野，計(jì)算出陽(yáng)性區(qū)域面積百分比和吸光度值的乘積，計(jì)算3個(gè)視野的平均值為NGF表達(dá)水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 HE染色(圖1)

正?？瞻捉M：第7 d創(chuàng)面有少量的單核細(xì)胞滲出，伴有成纖維細(xì)胞和毛細(xì)血管增生；第10 d皮下成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)較活躍，數(shù)量增多，毛細(xì)血管胚芽形成數(shù)量較少。

模型空白組：創(chuàng)傷后第7 d，有較多的單核細(xì)胞滲出，伴有成纖維細(xì)胞和極少毛細(xì)血管的增生；第10 d皮下成纖維細(xì)胞數(shù)量增多，毛細(xì)血管胚芽形成數(shù)量很少。

紫歸長(zhǎng)皮軟膏組：創(chuàng)傷后第7 d，基本無(wú)單核細(xì)胞滲出，伴有大量成纖維細(xì)胞和毛細(xì)血管增生；第10 d皮下成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)活躍，數(shù)量多，毛細(xì)血管胚芽數(shù)量顯著增多。

貝復(fù)濟(jì)組：創(chuàng)傷后第7 d，基本無(wú)單核細(xì)胞滲出，伴有大量成纖維細(xì)胞和毛細(xì)血管增生；第10 d皮下成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)較活躍，數(shù)量多，毛細(xì)血管胚芽數(shù)量顯著增多。

2.2 NGF免疫組化染色(圖2、表1)

A：正?？瞻捉M造模第7天；B：正?？瞻捉M造模第10天；C：模型空白組造模第7天；D：模型空白組造模第10天；E：紫歸長(zhǎng)皮軟膏組造模第7天；F：紫歸長(zhǎng)皮軟膏組造模第10天；G：貝復(fù)濟(jì)組造模第7天；H：貝復(fù)濟(jì)組造模第10天A: At modeling day 7 of normal blank group; B: At modeling day 10 of normal blank group; C: At modeling day 7 of model blank group; D: At modeling day 10 of model blank group; E: At modeling day 7 of Zigui Changpi Paste group; F: At modeling day 10 of Zigui Changpi Paste group; G: At modeling day 7 of bFGF-torita group; H: At modeling day 10 of bFGF-torita group圖2 各組大鼠創(chuàng)面肉芽組織NGF表達(dá)(×100)Fig.2 NGF expression of granulation tissue of rat wound in each group (×100)

表1 各組大鼠創(chuàng)面肉芽組織NGF表達(dá)

各組均有NGF表達(dá)，散見(jiàn)于整個(gè)切面，陽(yáng)性染色多分布于纖維上，可見(jiàn)成纖維細(xì)胞染色及血管內(nèi)皮細(xì)胞染色。

在創(chuàng)傷第7 d，正?？瞻捉M、紫歸長(zhǎng)皮軟膏組及貝復(fù)濟(jì)組的NGF表達(dá)明顯優(yōu)于模型空白組(P<0.05)；紫歸長(zhǎng)皮軟膏組明顯優(yōu)于正常空白組和貝復(fù)濟(jì)組(P<0.05)；貝復(fù)濟(jì)組則優(yōu)于正常空白組(P<0.05)。

在創(chuàng)傷第10 d，正?？瞻捉M與模型空白組NGF表達(dá)比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，紫歸長(zhǎng)皮軟膏組及貝復(fù)濟(jì)組明顯優(yōu)于模型空白組和正常空白組(P<0.05)；紫歸長(zhǎng)皮軟膏組明顯優(yōu)于貝復(fù)濟(jì)組(P<0.05)。另外，創(chuàng)傷后第10 d時(shí)各組NGF表達(dá)較第7 d均有顯著下降(P<0.05)。

3 討論

難愈性創(chuàng)面可由多種原因引起[4]。目前，臨床上各種抗感染的藥物和敷料、凝膠[5-6]，以及促進(jìn)愈合的生長(zhǎng)因子制劑等，均使用非常廣泛；此外，清創(chuàng)、VSD技術(shù)等也是臨床較為有效的治療手段[7-8]。中醫(yī)中藥治療難愈性創(chuàng)面，遵循局部辯證，將難愈性創(chuàng)面分為膿腐期、生肌期、斂皮期，進(jìn)行對(duì)癥治療。治療藥物多種多樣，包括粉劑、丹劑、膏劑、中藥溶液等，治療手段包括蠶食清創(chuàng)、灌注沖洗、中藥熏洗、艾灸熏治等[9]。我院的院內(nèi)制劑紫歸長(zhǎng)皮膏以經(jīng)臨床研究證實(shí)，具有祛腐托腐、補(bǔ)血活血、生肌長(zhǎng)肉的作用[10-13]，尤其適用于難愈性創(chuàng)面的治療。本研究進(jìn)一步針對(duì)組織形態(tài)學(xué)改變及NGF分泌情況，對(duì)紫歸長(zhǎng)皮軟膏治療難愈性創(chuàng)面進(jìn)行觀察，為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

創(chuàng)面組織中的神經(jīng)生長(zhǎng)因子不僅可以直接作用于創(chuàng)面組織，而且可以間接調(diào)控創(chuàng)面組織內(nèi)源性釋放各類生長(zhǎng)因子及生長(zhǎng)因子受體，起到正性調(diào)節(jié)作用，加速創(chuàng)面愈合，使創(chuàng)面愈合由以往的被動(dòng)等待自愈發(fā)展為主動(dòng)調(diào)控愈合[14-17]。

本研究結(jié)果顯示，正常空白組及模型空白組于創(chuàng)傷后第7 d，均有單核細(xì)胞滲出，伴有成纖維細(xì)胞和毛細(xì)血管的增生，第10 d皮下成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)較活躍，數(shù)量多，其毛細(xì)血管胚芽形成數(shù)量仍較少；中藥紫歸長(zhǎng)皮軟膏組及貝復(fù)濟(jì)組于創(chuàng)傷后第7 d，基本無(wú)單核細(xì)胞滲出，伴有大量成纖維細(xì)胞和毛細(xì)血管增生，第10 d皮下成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)活躍，數(shù)量多，毛細(xì)血管胚芽數(shù)量顯著增多；紫歸長(zhǎng)皮軟膏組優(yōu)于貝復(fù)濟(jì)組。通過(guò)免疫組織化學(xué)檢測(cè)，進(jìn)一步證實(shí)了NGF在各組、各時(shí)間點(diǎn)均有表達(dá)，表明其在創(chuàng)面愈合過(guò)程中均發(fā)揮作用。紫歸長(zhǎng)皮軟膏在創(chuàng)傷后7 d及創(chuàng)傷后10 d均能明顯促進(jìn)NGF的表達(dá)，并優(yōu)于貝復(fù)濟(jì)及空白對(duì)照組。另外，各組NGF表達(dá)在創(chuàng)傷后10 d較創(chuàng)傷后7 d均有不同程度下降，這可能是因?yàn)閯?chuàng)傷后10 d左右創(chuàng)面已接近愈合，傷口表面需要的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子逐漸減少。

綜上所述，紫歸長(zhǎng)皮軟膏能夠促進(jìn)大鼠難愈性創(chuàng)面組織內(nèi)成纖維細(xì)胞和毛細(xì)血管增生，能夠促進(jìn)創(chuàng)面組織內(nèi)NGF分泌，進(jìn)而促進(jìn)創(chuàng)面愈合。