急性髓系白血病微小殘留病灶檢測(cè)方法的建立及其應(yīng)用

趙佳琪，李偉靜，王 旭，鄭亮亮，宋玉國(guó)，

(1.北華大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 吉林 132013；2.北華大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林 吉林 132011)

急性白血病(acute leukemia，AL)是造血干細(xì)胞的惡性克隆性疾病，骨髓中異常的原始細(xì)胞和幼稚細(xì)胞(即白血病細(xì)胞)大量增殖，同時(shí)抑制正常造血，其中，急性髓系白血病(acute myelogenous leuk- emia，AML)是成人多見(jiàn)的一類(lèi)白血病.AML不是單一性疾病，包括AML伴有或不伴有重現(xiàn)性遺傳學(xué)異常等多種類(lèi)型，各型AML之間有不同的形態(tài)、免疫表型、遺傳學(xué)和分子生物學(xué)特征.雖然應(yīng)用規(guī)范、成熟的化療方法能使大部分AML患者病情得到緩解，但是完全緩解(CR)率只能達(dá)到50%～80%[1]，其他患者在3～5 a內(nèi)復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)的原因是患者體內(nèi)殘留一定數(shù)量的白血病細(xì)胞，這部分細(xì)胞稱為微小殘留病灶(minimal residual disease，MRD)[2-3].MRD常用的檢測(cè)方法主要有分子生物學(xué)和流式細(xì)胞術(shù)等方法，常用的分子生物學(xué)方法有PCR技術(shù)和新一代測(cè)序技術(shù)[4-6].許多文獻(xiàn)[7-11]報(bào)道，基于多激光多通道流式細(xì)胞儀而建立起來(lái)的多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)(multiparameter flow cytometry，MP-FCM)檢測(cè)MRD對(duì)于疾病的鞏固治療和預(yù)后判斷具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值.本研究應(yīng)用FCM對(duì)初診患者進(jìn)行白血病細(xì)胞免疫分型，以此確定白血病相關(guān)免疫表型(LAIPs)，患者治療后或復(fù)診時(shí)，依據(jù)LAIPs建立個(gè)體化MRD檢測(cè)方法，給臨床治療提供實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)指標(biāo).

1 資料和方法

1.1 基本資料

23例AML患者均來(lái)源于北華大學(xué)附屬醫(yī)院血液科2019年1月—2020年12月的住院患者，其中，男11例，女12例，年齡26～71歲，平均(46.78±13.55)歲.按白血病診斷標(biāo)準(zhǔn)全部為AML病例，其中，M2患者13例，M3患者3例，M4患者7例.入組患者均簽署知情同意書(shū)，本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn).

1.2 主要儀器與試劑

NAVIOS流式細(xì)胞儀(Beckman公司，美國(guó)，三激光10色)，可以識(shí)別10種熒光素；熒光標(biāo)記單克隆抗體(Beckman公司，美國(guó))

1.3 檢測(cè)方法

標(biāo)本采集：由臨床醫(yī)生采集骨髓穿刺液2 mL，收集在含EDTA-K2的真空采血管中，送流式細(xì)胞室檢測(cè).

熒光抗體標(biāo)記：在流式細(xì)胞儀專(zhuān)用試管內(nèi)加入所需的熒光抗體各10 μL，加入骨髓穿刺液100 μL，室溫避光標(biāo)記15 min；溶血及洗滌處理：溶解紅細(xì)胞后，加入3 mL PBS混勻，1 100 r/min離心5 min，同樣再洗滌1次，加入500 μL PBS，用300目尼龍網(wǎng)過(guò)濾處理，上機(jī)檢測(cè).本研究選擇的23例白血病患者初診時(shí)均行白血病免疫分型并確定LAIPs，做MRD檢測(cè)所用熒光抗體要涵蓋抗原跨系表達(dá)、抗原跨階段表達(dá)，在讀取數(shù)據(jù)時(shí)注意抗原過(guò)度、過(guò)低或缺失表達(dá)以及光散射異常等[12].

流式細(xì)胞儀檢測(cè)MRD方案設(shè)定：依據(jù)白血病免疫分型時(shí)所確定的LAIPs，對(duì)每一位患者制定個(gè)體化的MRD檢測(cè)方案，但所有患者檢測(cè)方案中有一定數(shù)量的相同坐標(biāo)圖，包括以FS INT/FS PEAK為坐標(biāo)設(shè)去粘連門(mén)、FS INT線性坐標(biāo)/SS INT對(duì)數(shù)坐標(biāo)設(shè)活細(xì)胞門(mén)、CD117/SS INT和CD34/SS INT圈原始細(xì)胞門(mén).在每一個(gè)檢測(cè)方案中，依據(jù)白血病細(xì)胞確定原則，計(jì)數(shù)白血病細(xì)胞數(shù)量，用該細(xì)胞數(shù)除以所檢測(cè)的所有細(xì)胞數(shù)，即可計(jì)算出MRD的數(shù)量.

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MRD結(jié)果

應(yīng)用多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MRD，即在同一個(gè)測(cè)定管內(nèi)加入多種所需抗體，同步檢測(cè)多種抗原，便于分析細(xì)胞性質(zhì).本研究依據(jù)LAIPs的確定原則設(shè)計(jì)多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MRD的具體方案.圖1和圖2是多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MRD的典型方案.圖1中圖a是去粘連圖，圖b是選擇活細(xì)胞圖，圖c是選擇CD117+的幼稚細(xì)胞(G門(mén))，圖d是G門(mén)內(nèi)的細(xì)胞表達(dá)CD13和CD33的情況.

圖2是多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MRD抗原表達(dá)分析的典型圖例.從圖2 e可見(jiàn)，紅色細(xì)胞高表達(dá)CD117、中度表達(dá)CD13，可能為異常的白血病細(xì)胞；藍(lán)色細(xì)胞不表達(dá)CD117，強(qiáng)表達(dá)CD13，是正常粒細(xì)胞.從圖2 f可見(jiàn)，紅色細(xì)胞高表達(dá)CD117，強(qiáng)表達(dá)CD33.從圖2 g可見(jiàn)，紅色細(xì)胞表達(dá)CD117，而不表達(dá)CD15，證明是髓系早期細(xì)胞；從圖2 h可見(jiàn)，紅色細(xì)胞高表達(dá)CD33、中度表達(dá)CD13，符合髓系細(xì)胞特點(diǎn)；從圖2 i可見(jiàn)，紅色細(xì)胞中度表達(dá)CD13，不表達(dá)CD15；從圖2 j可見(jiàn)，紅色細(xì)胞高表達(dá)CD33，不表達(dá)CD11b，以上均證明該群細(xì)胞是髓系早期細(xì)胞，如果符合LAIPs的條件即可進(jìn)行計(jì)數(shù)，并確定MRD數(shù)值.

a.去粘連門(mén)；b.對(duì)A門(mén)內(nèi)細(xì)胞進(jìn)行分析；c.對(duì)B門(mén)內(nèi)細(xì)胞進(jìn)行分析；d.對(duì)G門(mén)內(nèi)細(xì)胞進(jìn)行分析.圖1 多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MRD設(shè)門(mén)方法Fig.1 Gating method for detection of MRD by multi parameter flow cytometry

圖2 多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MRD抗原表達(dá)分析Fig.2 Analysis of MRD antigen expression detected by multi parameter flow cytometry

2.2 抗體組合結(jié)果

本研究通過(guò)檢測(cè)MRD確定了抗體組合，發(fā)現(xiàn)白血病細(xì)胞跨階段異常表達(dá)抗原的病例數(shù)較多，為18例；跨系異常表達(dá)抗原的病例數(shù)相對(duì)較少.見(jiàn)表1.

表1 有效抗體組合使用頻率Tab.1 Frequency of effective antibody combination

2.3 患者不同生存期MRD檢測(cè)結(jié)果

本研究的患者生存期以2 a為界限，將23例患者分為生存期大于2 a組和小于2 a組，將此兩組的MRD平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析.見(jiàn)表2.

表2 患者不同生存期MRD檢測(cè)結(jié)果Tab.2 MRD test results of patients in different survival periods

3 討 論

MRD指標(biāo)高是急性白血病治療后復(fù)發(fā)的原因之一，MP-FCM為準(zhǔn)確檢測(cè)MRD提供了新的技術(shù)手段，MP-FCM就是應(yīng)用不同熒光素標(biāo)記的多種不同單克隆抗體對(duì)被檢測(cè)的細(xì)胞表面抗原和/或細(xì)胞內(nèi)抗原的表達(dá)情況同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)分析.由于在同一個(gè)檢測(cè)試管內(nèi)，同時(shí)加入多種熒光抗體，很容易對(duì)細(xì)胞的來(lái)源、分化程度、抗原表達(dá)是否異常做出正確判斷，在初篩白血病免疫分型時(shí)既可以做出型別診斷又可以個(gè)體化確定LAIPs.目前常用的流式細(xì)胞儀均采用多激光識(shí)別多種熒光素的技術(shù)手段，完全可以滿足MP-FCM的技術(shù)要求.在現(xiàn)有流式細(xì)胞技術(shù)的基礎(chǔ)上，應(yīng)用MP-FCM技術(shù)建立急性髓系白血病MRD檢測(cè)方法具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值.

MRD是指白血病患者經(jīng)過(guò)治療達(dá)到血液學(xué)完全緩解后體內(nèi)殘存的通過(guò)形態(tài)學(xué)等傳統(tǒng)檢測(cè)方法無(wú)法檢測(cè)到的微量腫瘤細(xì)胞.檢測(cè)MRD主要依據(jù)LAIPs，對(duì)初診急性白血病患者進(jìn)行白血病免疫分型是確定LAIPs檢測(cè)MRD的關(guān)鍵.KERN W等[13]對(duì)誘導(dǎo)治療和鞏固治療的AML進(jìn)行了研究，確定LAIPs的方法對(duì)建立MRD具有重要的指導(dǎo)意義.本研究依據(jù)抗原不同步表達(dá)、跨系表達(dá)等特點(diǎn)基本建立了多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)AML MRD的方法，為指導(dǎo)臨床治療、判斷預(yù)后在一定程度上提供了實(shí)驗(yàn)診斷依據(jù).在方法學(xué)研究中，對(duì)抗體組合進(jìn)行了優(yōu)化確定.23例患者抗原不同步表達(dá)CD33CD13CD15CD34CD45的抗體組合應(yīng)用最多，占56.52%(13/23)；CD33CD13CD15CD117CD45的抗體組合占21.74%(5/23).抗原跨系表達(dá)的抗體中CD33CD13CD19CD34CD45和CD33CD13CD7CD34CD45比例相對(duì)較少，分別為17.39%(4/23)和4.35%(1/23).本研究發(fā)現(xiàn)，依據(jù)抗原跨系表達(dá)確定LAIPs比較容易，因此，隨著研究深入，病例數(shù)量的積累，會(huì)獲得更多這類(lèi)患者的臨床數(shù)據(jù)，研究將更具有臨床指導(dǎo)意義.本研究對(duì)23例AML患者有效隨訪2 a，將全部病例分為生存期大于2 a組和生存期小于2 a組，分別統(tǒng)計(jì)分析MRD檢測(cè)數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)生存期大于2 a的患者M(jìn)RD數(shù)值明顯低于生存期小于2 a的患者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01).

由于白血病細(xì)胞存在高度的克隆異質(zhì)性，不同治療方案對(duì)白血病細(xì)胞免疫表型存在一定程度的影響，治療后不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)采集的標(biāo)本存在一定差異，以及不同的抗體組合、熒光素搭配、圈門(mén)策略等多種因素均對(duì)MRD檢測(cè)結(jié)果存在影響，因此，MRD檢測(cè)是一項(xiàng)復(fù)雜的技術(shù)，需在今后的研究中不斷完善，獲取更具有臨床指導(dǎo)意義的數(shù)據(jù)，為臨床治療和判斷預(yù)后提供更有價(jià)值的參考.