羧甲基殼聚糖和納米銀對芍藥切花觀賞品質(zhì)及生理特性的影響

陳國偉，韓戴宇，杜 雪，鞠志新

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，吉林 長春130118；2.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院農(nóng)學(xué)院，吉林 吉林132101）

芍藥（Paeonia lactifloraPall.）是芍藥科芍藥屬的多年生草本植物，在我國栽培歷史悠久，是中國的傳統(tǒng)名花，其花型優(yōu)美、花色艷麗、香氣襲人，近年來已成為國內(nèi)外市場上的高檔切花，生產(chǎn)和銷售份額逐年增加[1]。芍藥花期短且集中在5—6月，自然瓶插壽命相對于百合、月季、康乃馨等切花來說也很短暫，通常只有7 d左右，這些因素都造成芍藥切花供應(yīng)的季節(jié)性，嚴(yán)重制約了芍藥切花產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[2-4]。

芍藥切花采切后莖端受損，木質(zhì)部導(dǎo)管堵塞影響水分循環(huán)，水分平衡被打破造成的水分脅迫加速切花的衰老[5]，同時，芍藥對乙烯等有害物質(zhì)較為敏感，切花脫離母體后產(chǎn)生的乙烯也會影響切花壽命[6]。研究表明，膜質(zhì)過氧化和內(nèi)源激素失衡是導(dǎo)致切花衰老的重要生理原因，切花瓶插期間膜脂過氧化增加，造成細(xì)胞膜損傷甚至死亡，影響細(xì)胞膜透性[7-8]，氧自由基代謝失調(diào)誘導(dǎo)內(nèi)源激素失衡，引起吲哚乙酸（IAA）、赤霉素（GA）、細(xì)胞分裂素（CTK）等含量下降和脫落酸（ABA）、乙烯（Eth）含量上升，加速切花衰老與萎蔫[9-10]。因此，保鮮劑中添加殺菌防腐劑、乙烯抑制劑和抗氧化劑等物質(zhì)，對于延長芍藥切花瓶插壽命，增加其觀賞價值尤為重要。

納米銀（Nano-silver，NS）是一種安全環(huán)保的廣譜型納米級無機(jī)抗菌材料，制備簡單，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)療、紡織、建材等領(lǐng)域[11-12]，近些年在果蔬、鮮花保鮮領(lǐng)域的研究與應(yīng)用也在逐漸增加。研究人員利用NS對麝香百合的基部進(jìn)行預(yù)處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NS顯著抑制了假單孢菌屬、腸桿菌屬等病原菌的生長[13]。程桂平等[14]以香石竹為試材，發(fā)現(xiàn)NS脈沖處理可以有效減緩花枝鮮重，提高超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）等保護(hù)酶活性，延長瓶插壽命。與NS類似，羧甲基殼聚糖（Carboxymethyl chitosan，CMCS）也具有良好的抗菌性、水溶性、抗氧化性和成膜性，其作為殼聚糖羧基化的產(chǎn)物，來源廣泛、價格低廉，也被廣泛應(yīng)用于醫(yī)療、食品、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域[15]。研究表明，利用CMCS對芒果、草莓等噴涂或浸漬保鮮時，可在果實表面形成大約4 μm的透明保護(hù)膜，該膜可以控制果實內(nèi)外二氧化碳、乙烯等氣體交換，調(diào)節(jié)采后生理代謝，控制呼吸強(qiáng)度和蒸騰作用，延長果實的保鮮期[16-17]。采用含CMCS和蔗糖的保鮮液對菊科切花進(jìn)行保鮮時，其瓶插壽命比對照有所延長[18-19]。不過，NS和CMCS作為兩種新型抗菌材料，在芍藥切花保鮮方面研究較少。本試驗以芍藥切花為材料，通過在瓶插基本保鮮液中添加不同濃度的NS和CMCS，探討兩種抗菌劑的保鮮效果及生理特性，以期為芍藥切花高效環(huán)保型保鮮技術(shù)研發(fā)提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

芍藥切花品種“種生粉”采自吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院校內(nèi)牡丹苗圃，花材均長勢健壯，莖稈直立，提前一周去除側(cè)蕾。采收標(biāo)準(zhǔn)參照成仿云等[20]的方法，采切時間均為上午8點整，長度均為40～50 cm，保留上部1～2片復(fù)葉，采切后立即放入水中，洗去葉片及花瓣上的分泌物。試驗所有花材隨機(jī)進(jìn)行分組，瓶插前莖稈基部在水中再次切割，以清除莖端空氣堵塞，切口為45°。控制實驗室溫度（21±2）℃，相對濕度50%～70%，室內(nèi)自然散光。

羧甲基殼聚糖：購于上海源葉生物科技有限公司；納米銀：購于上海滬正納米科技有限公司；蔗糖、檸檬酸、95%乙醇、考馬斯亮藍(lán)G-250等均為國產(chǎn)分析純；所需試劑盒均購于南京建成生物工程研究所。

1.1.2 儀器與設(shè)備

723G型可見分光光度計，UV1000型紫外分光光度計，HH-2型數(shù)顯電子恒溫水浴鍋，SQP型電子天平，DDS-307A型電導(dǎo)儀，GL-20G型臺式高速冷凍離心機(jī)。

1.2 方法

1.2.1 材料處理

在預(yù)試驗中，確定CMCS的最佳濃度為200 mg/L，NS的最佳濃度為20 mg/L，同時確定基本瓶插液為3%蔗糖+200 mg/L檸檬酸+25 mg/L水楊酸。試驗設(shè)置對照組CK1、CK2分別為相同體積的蒸餾水和基本瓶插液，處理組S1、S2分別為基本瓶插液中添加最佳濃度的CMCS和NS。芍藥切花單枝瓶插，每個處理15枝，8枝在每天固定時間進(jìn)行形態(tài)觀察，測定花徑、水分平衡值以及瓶插壽命，其余則用于相對電導(dǎo)率、可溶性蛋白含量和保護(hù)酶活性等生理指標(biāo)測定，每個處理重復(fù)3次。

1.2.2 測定項目與方法

1.2.2.1 瓶插品質(zhì)

瓶插品質(zhì)有瓶插壽命、最佳觀賞期、花徑變化率3個指標(biāo)，自瓶插之日起，每天固定時間測定并拍照記錄。瓶插壽命為瓶插0 d至花朵最外圍50%以上開始出現(xiàn)萎蔫、掉落或褐變的天數(shù)；最佳觀賞期為切花半開期至始衰期的天數(shù)。

花徑變化率計算公式：花徑變化率（%）=（瓶插期測得花徑－瓶插初期測得花徑）/瓶插初期測得花徑×100

1.2.2.2 水分平衡值

水分平衡值采用稱重法[21]，其可反應(yīng)切花新鮮程度，計算公式為：

失水量=（Hn+1＋Pn+1）-（Hn-P n）

吸水量=Pn+1-Pn

水分平衡值=吸水量-失水量

式中：Hn為第n天花材質(zhì)量（g），Pn為第n天溶液和瓶的質(zhì)量之和（g）。

1.2.2.3 花瓣相對電導(dǎo)率、丙二醛（MDA）、游離脯氨酸（Pro）含量

相對電導(dǎo)率：采用電導(dǎo)率法測定；丙二醛含量：采用硫代巴比妥酸（TBA）法測定；游離脯氨酸含量：采用茚三酮顯色反應(yīng)測定。

1.2.2.4 花瓣可溶性蛋白質(zhì)含量

采用考馬斯亮藍(lán)G-250法測定。

1.2.2.5 保護(hù)酶活性

超氧化物歧化酶活性：采用氮藍(lán)四唑（NBT）光還原法測定；過氧化物酶（POD）活性：采用愈創(chuàng)木酚法測定；過氧化氫酶活性：采用紫外吸收法測定。以上指標(biāo)均參照李合生[22]的方法并加以改進(jìn)。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Microsoft Word 2013進(jìn)行統(tǒng)計處理，用SPSS 25.0進(jìn)行差異性顯著分析，顯著水平α＝0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 CMCS和NS處理對芍藥切花瓶插品質(zhì)的影響

從表1可以看出，S1和S2處理均延長了芍藥切花的瓶插壽命和最佳觀賞期，顯著提升觀賞品質(zhì)（P＜0.05）。其中S1處理較對照CK1相比，瓶插壽命和最佳觀賞期分別延長了3.01 d和1.87 d，最大花徑增大了2.17 cm；S2處理較CK1相比，瓶插壽命和最佳觀賞期分別延長4.26 d和2.75 d，最大花徑增大了3.19 cm，均達(dá)到顯著差異（P＜0.05）。如圖1所示，兩組對照處理芍藥切花在瓶插3 d后進(jìn)入盛花期，瓶插壽命為9 d，S1處理4 d進(jìn)入盛花期，9 d后花瓣開始卷曲萎蔫。S2處理與S1處理表現(xiàn)較為一致，4 d進(jìn)入盛花期，9 d后花瓣失水萎蔫，表明S1、S2處理均可有效延緩切花衰老。

表1 CMCS和NS處理對芍藥切花瓶插品質(zhì)的影響Table1 Effects of CMCS and NS treatments on ornamental qualities of P.lactiflora cut flowers

圖1 芍藥切花瓶插期形態(tài)變化Fig.1 The morphological changes of P.lactiflora cut flowers during vase phase

芍藥切花花莖變化率隨開放進(jìn)程而變化，瓶插前期花枝快速吸水，花蕾迅速膨大，花莖快速變大，花徑變化率快速上升，后期切花衰老，花瓣萎蔫，花莖變小，花莖變化率下降。圖2表明，盛花期前，各處理花徑變化基本一致，S1、S2處理均在5 d達(dá)到峰值，此時S2處理的花徑變化率顯著高于其他3組處理（P＜0.05），表明S2處理在促進(jìn)芍藥切花開放，延長壽命方面效果較好。

圖2 CMCS和NS處理對芍藥切花瓶插期間花徑變化率的影響Fig.2 Effects of CMCS and NS treatments on flower diameters change rates of P.lactiflora cut flowers during vase phase

2.2 CMCS和NS處理對芍藥切花水分平衡值的影響

如圖3所示，瓶插期間各處理的水分平衡值均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。瓶插前期，S1、S2處理水分平衡值均高于CK1，瓶插第3天，各處理組的水分平衡值均到達(dá)峰值。隨著切花進(jìn)入盛開期，機(jī)體代謝旺盛，水分平衡值逐漸到達(dá)0。各處理組到達(dá)0的時間有所不同，CK1、S1處理和S2處理的時間分別為3.3 d、3.4 d和3.8 d，S1處理和S2處理延緩了水分平衡值到達(dá)0的時間，且S2處理出現(xiàn)的時間最晚，證明S2處理的保水能力更好，可以更有效地調(diào)控芍藥切花體內(nèi)水分代謝，維持水分平衡，延緩切花衰老進(jìn)程。

圖3 CMCS和NS處理對芍藥切花瓶插期間水分平衡值的影響Fig.3 Effects of CMCS and NS treatments on moisture balance values of P.lactiflora cut flowers during vase phase

2.3 CMCS和NS處理對芍藥切花瓶插期間相對電導(dǎo)率、MDA和Pro含量的影響

如圖4所示，芍藥切花瓶插期間各項處理的相對電導(dǎo)率均呈現(xiàn)上升趨勢，兩組對照處理自瓶插3 d起相對電導(dǎo)率急速上升，而S1處理和S2處理均推遲了上升幅度，并且瓶插8～11 d時，S2處理的相對電導(dǎo)率變化幅度較小，表明該處理可以改變細(xì)胞膜透性，有效防止細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)外滲，減緩細(xì)胞膜脂過氧化程度，保持細(xì)胞膜完整性，延長切花的瓶插壽命。

圖4 CMCS和NS處理對芍藥切花瓶插期間相對電導(dǎo)率的影響Fig.4 Effects of CMCS and NS treatments on relative conductivities of P.lactiflora cut flowers during vase phase

MDA是膜脂過氧化的最終產(chǎn)物，是衡量細(xì)胞膜損傷程度的重要指標(biāo)。本試驗結(jié)果表明（圖5），MDA含量在整個切花保鮮階段總體呈逐漸上升趨勢，瓶插4 d進(jìn)入盛花期后MDA含量迅速上升，其中CK1和CK2的MDA含量最高，S2處理的MDA含量顯著低于S1處理（P＜0.05），S1處理的MDA含量與CK1相比有所降低但無顯著差異，說明S2處理可以減輕膜脂過氧化水平，保護(hù)細(xì)胞膜的完整性。

圖5 CMCS和NS處理對芍藥切花瓶插期間MDA含量的影響Fig.5 Effects of CMCS and NS treatments on MDA contents of P.lactiflora cut flowers during vase phase

從圖6可以看出，在芍藥切花瓶插期間，不同處理的Pro含量均呈上升趨勢，且在瓶插壽命內(nèi)，S1處理和S2處理的Pro含量顯著低于對照CK1和CK2處理（P＜0.05）。S1處理在瓶插8 d后Pro含量快速升高，S2處理在瓶插9 d時快速上升，總體來說，S1和S2均可以減少芍藥切花瓶插期間Pro積累，維持細(xì)胞膜代謝，減緩水分虧缺。

圖6 CMCS和NS處理對芍藥切花瓶插期間Pro含量的影響Fig.6 Effects of CMCS and NS treatments on Pro contents of P.lactiflora cut flowers during vase phase

2.4 CMCS和NS處理對芍藥切花可溶性蛋白質(zhì)含量的影響

可溶性蛋白質(zhì)含量與切花衰老密切相關(guān)，其含量的高低直接影響切花的瓶插品質(zhì)和壽命。由圖7可以看出，各處理的可溶性蛋白質(zhì)含量均呈現(xiàn)前期緩慢上升后期下降的趨勢，兩對照組的可溶性蛋白質(zhì)含量峰值分別出現(xiàn)在瓶插3 d和5 d，S1處理和S2處理均在瓶插7 d達(dá)到峰值，此時，S1處理的可溶性蛋白質(zhì)含量為8.45 μg/g，較對照組分別提高了37.2%和46.5%，S2處理的可溶性蛋白質(zhì)含量為8.89 μg/g，較對照組分別提高40.3%和49.2%，且S2處理的效果明顯優(yōu)于其他處理組，說明NS處理可以提高芍藥切花體內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)的含量并維持穩(wěn)定。

圖7 CMCS和NS處理對芍藥切花瓶插期間可溶性蛋白質(zhì)含量的影響Fig.7 Effects of CMCS and NS treatments on soluble protein contents of P.lactiflora cut flowers during vase phase

2.5 CMCS和NS處理對芍藥切花瓶插期間保護(hù)酶活性的影響

SOD是清除和抑制自由基的酶。由圖8所示，瓶插期間SOD活性呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。除S2處理外，其他3組處理的SOD活性均在瓶插4 d達(dá)到峰值，S2處理將峰值時間推遲到第5天，且S2處理的SOD活性顯著高于其他處理（P＜0.05）。并且在瓶插后期SOD活性也維持在很高的水平。S1處理的SOD活性雖有提高，但與對照組相比無顯著差異。說明NS有較強(qiáng)的抗氧化防衛(wèi)功能，有利于清除切花內(nèi)部的O2，保鮮效果最好。

圖8 CMCS和NS處理對芍藥切花瓶插期間SOD活性的影響Fig.8 Effects of CMCS and NS treatments on SOD activities of P.lactiflora cut flowers during vase phase

POD作為一種保護(hù)酶，既可以分解植物體內(nèi)的強(qiáng)氧化性物質(zhì)，減少氧化損害，也可以生成ROS，因此與植物體的代謝密切相關(guān)[23]。圖9顯示，瓶插期間各處理組的POD活性呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。除S1處理外，其他處理的POD含量均在第4天達(dá)到峰值，CK1和CK2處理的變化趨勢相似，其中S1處理的峰值為0.52 U·g-1FW·min-1，比CK1提高15.9%，S2處理的峰值為0.54 U·g-1FW·min-1，比CK1提高了22.7%。瓶插中后期，各處理組的POD活性開始下降，S2處理的POD活性下降緩慢且始終高于其他處理，可見，NS可有效保持切花POD活性。

圖9 CMCS和NS處理對芍藥切花瓶插期間POD活性的影響Fig.9 Effects of CMCS and NS treatments on POD activities of P.lactiflora cut flowers during vase phase

CAT可以分解切花體內(nèi)的過氧化氫。圖10表明，S1和S2處理均不同程度的提高了CAT活性，與兩組對照相比，S1和S2處理明顯推遲了峰值出現(xiàn)的時間，且在整個瓶插過程中，S2處理的CAT活性始終高于其他處理，表明S2處理的效果最佳。

圖10 CMCS和NS處理對芍藥切花瓶插期間CAT活性的影響Fig.10 Effects of CMCS and NS treatments on CAT activities of P.lactiflora cut flowers during vase phase

3 討論

（1）切花的瓶插壽命是影響其商品價值的重要因素，切花采收后脫離母體，水分、養(yǎng)分和能量供給不足，切花壽命大大縮短，加之瓶插期環(huán)境改變和莖端機(jī)械損傷等，使保鮮液中滋生大量以細(xì)菌為主的病原微生物，對莖稈造成堵塞，導(dǎo)致水分吸收受阻，進(jìn)而產(chǎn)生水分平衡失調(diào)的現(xiàn)象，嚴(yán)重影響切花的品質(zhì)和瓶插壽命[24-25]。本研究結(jié)果表明，瓶插液中加入NS和CMCS，對于芍藥切花的瓶插壽命、最大花徑有不同程度的改善，其中NS處理能顯著增大花徑，延長瓶插壽命，提升觀賞品質(zhì)，與前人在百合切花、牡丹切花的研究結(jié)果一致[13,26]。NS溶于水后，不僅可以殺死切花莖端細(xì)菌，而且會通過木質(zhì)部進(jìn)入花瓣，控制乙烯生物合成基因，減少乙烯合成量，進(jìn)而延緩切花衰老。李欣等[27]和王艷巧等[28]對牡丹切花進(jìn)行殼聚糖噴涂試驗，發(fā)現(xiàn)其可以誘導(dǎo)切花產(chǎn)生一系列防御反應(yīng)，抑制乙烯的合成，提高牡丹瓶插觀賞品質(zhì)，原因可能是噴涂處理在切花表面形成的高分子薄膜，具有更好的氣體選擇性，有利于調(diào)節(jié)切花的呼吸強(qiáng)度和蒸騰作用[16]，關(guān)于CMCS的切花保鮮應(yīng)用有待于進(jìn)一步研究。

（2）切花采后的水分狀況是影響切花壽命和觀賞品質(zhì)的重要指標(biāo)，水分平衡值決定其新鮮程度。切花離體后，受環(huán)境等因素的影響導(dǎo)致吸水量和失水量失調(diào)，進(jìn)而干擾植物的各項生理活動，加速衰老。本研究結(jié)果顯示，在保鮮液中加入NS和CMCS，均可改善水分關(guān)系。瓶插初期，NS處理水分平衡值快速上升，表明NS能促進(jìn)芍藥切花早期水分吸收；瓶插中后期，S1處理水分平衡值較高，表明CMCS可以提升花枝的保水能力，延長切花的瓶插壽命和最佳觀賞期，進(jìn)一步提高觀賞品質(zhì)（圖1）。

（3）植物受到脅迫后，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)受損，細(xì)胞膜透性變大，細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)外滲[29]，相對電導(dǎo)率變大。本研究結(jié)果顯示，S2處理的平均相對電導(dǎo)率最低，原因可能是瓶插液中的NS溶解后，活性極強(qiáng)的Ag+大量溶出，與帶有負(fù)電荷的病菌直接接觸，消除電性進(jìn)而殺菌抗菌[30]。MDA作為膜脂過氧化的最終產(chǎn)物，可直接反映植物受逆境迫害的程度[8-9]。已有研究表明[5]，適宜濃度的NS可以降低切花波斯菊的MDA含量。本研究發(fā)現(xiàn)，S2處理的芍藥切花花瓣中MDA含量顯著低于其他處理（P＜0.05），說明NS可以減少ROS及中間產(chǎn)物的積累，進(jìn)而減緩對酶和膜的損傷程度，延緩切花衰老。另外，Pro作為植物體內(nèi)一種重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，可維持膜、細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，緩解逆境對植物的傷害[31]。本試驗結(jié)果顯示，隨著瓶插期的延長，Pro呈現(xiàn)上升趨勢，但S2、S1處理Pro含量顯著低于對照處理（P＜0.05），說明兩種處理可有效維持體內(nèi)膜的通透性，延緩切花衰老，NS的效果最佳，這與Liu等[32]研究結(jié)論類似。

（4）切花離體之后，其體內(nèi)的淀粉、核酸等營養(yǎng)物質(zhì)和結(jié)構(gòu)物質(zhì)會發(fā)生降解，可溶性蛋白質(zhì)含量也會持續(xù)降低，因此其也是植物花朵衰敗的重要指標(biāo)之一[33]。本研究結(jié)果顯示，S1、S2處理花瓣內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)含量最高，表明兩組處理均可以提升芍藥切花花瓣內(nèi)細(xì)胞的保水能力，更好地維持生命活性。這與程桂平等[14]的研究結(jié)果一致。其中S2處理在瓶插后期可溶性蛋白質(zhì)含量均下降的情況下仍高于S1，表明NS處理保鮮效果較好。

（5）植物體內(nèi)普遍存在著酶促氧自由基防御體系，抗氧化防御體系可使細(xì)胞免受活性氧的侵害，作為內(nèi)源活性氧清除劑的關(guān)鍵酶SOD、POD和CAT可以在一定程度上清除植物體內(nèi)過剩的ROS，維持氧活性代謝平衡，保護(hù)膜結(jié)構(gòu)，延緩衰老[34]。本試驗結(jié)果表明，S1、S2兩組處理的芍藥切花花瓣中的SOD和CAT活性在整個瓶插期間均明顯高于CK，NS處理的SOD和CAT活性最高，并且推遲了CAT活性峰值出現(xiàn)的時間，說明NS有較強(qiáng)的清除自由基能力，提高了抗氧化防衛(wèi)能力，從而延緩切花衰老。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，NS處理可以顯著改善芍藥切花的水分平衡值，降低相對電導(dǎo)率，抑制MDA、Pro等物質(zhì)的積累，提高可溶性蛋白質(zhì)含量和SOD、POD、CAT等保護(hù)酶活性。在瓶插保鮮液中添加適宜濃度的CMCS和NS均可提高芍藥切花的保鮮效果，延長瓶插壽命，提升觀賞品質(zhì)，其中20 mg/L NS的保鮮效果最佳。