中藥發(fā)酵制劑對家禽痛風(fēng)的防治研究

林雪玉，林松泉

（1．上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，上海200025；2．廈門惠盈動(dòng)物科技有限公司，福建廈門361023）

痛風(fēng)是由尿酸鹽沉積直接導(dǎo)致的疾病。當(dāng)家禽過多的飼喂動(dòng)物內(nèi)臟、魚粉、豆粕等高蛋白飼料，家禽會(huì)出現(xiàn)蛋白質(zhì)代謝功能障礙。養(yǎng)殖密度大、環(huán)境潮濕陰冷、家禽缺乏運(yùn)動(dòng)等原因均會(huì)導(dǎo)致家禽痛風(fēng)病的發(fā)生[1-2]。痛風(fēng)癥狀一般表現(xiàn)為精神萎靡、厭食、羽毛雜亂，頸椎、翅膀、腿等關(guān)節(jié)處腫脹，行動(dòng)遲緩或行走障礙[3]。家禽痛風(fēng)病的發(fā)病死亡率較高，尤其是群體發(fā)病，給養(yǎng)殖戶造成極大的經(jīng)濟(jì)損失。

研究表明，長期使用化學(xué)類藥物治療家禽痛風(fēng)，會(huì)降低家禽的免疫能力，對機(jī)體有較大程度的損壞，且多存在毒副作用、藥物殘留等問題[1-4]。中藥作為天然藥物，其成分多樣、藥性溫和、毒副作用少[5]，是綠色、安全養(yǎng)殖用藥的優(yōu)選之一。

中藥發(fā)酵是炮制中藥的一種重要方法[6]，是利用益生菌生長代謝過程中產(chǎn)生的酶類與有機(jī)酸等對中藥進(jìn)行炮制。利用益生菌發(fā)酵中藥能夠有效保護(hù)中藥活性成分免遭破壞，提高中藥有效成分的提取率及藥渣的利用率，降低中藥的毒副作用[7-9]。在傳統(tǒng)的中藥制劑中引入益生菌發(fā)酵，益生菌進(jìn)入機(jī)體可參與機(jī)體功能代謝，起到益生的作用。研究表明，乳酸菌可以有效分解食物中的嘌呤，減少尿素形成。所以，益生菌在輔助治療或預(yù)防痛風(fēng)上能夠起到一定的作用[10-11]。研究表明，車前草具有抑制嘌呤轉(zhuǎn)化為尿酸的功能，從根本上降低尿酸含量[12]。本研究在前人針對中藥治療痛風(fēng)的研究基礎(chǔ)上[13-16]，利用赤蒼藤、甘草、姜黃、薏仁4味中藥，采用益生菌發(fā)酵再經(jīng)過噴霧干燥，從而制備可以用于防治家禽痛風(fēng)的中藥發(fā)酵制劑，為治療家禽的痛風(fēng)提供參考。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基

中藥發(fā)酵（篩選）培養(yǎng)基：赤蒼藤20 g/L、姜黃10 g/L、甘草10 g/L、薏仁10 g/L、葡萄糖30 g/L、牛肉膏8 g/L、瓊脂20 g/L，中藥經(jīng)過超微粉碎處理。

降解尿酸菌株篩選培養(yǎng)基[17]：硫酸鎂0.5 g/L、氯化鈉0.1 g/L、磷酸氫二鉀0.5 g/L、磷酸二氫鉀0.5 g/L、尿酸2 g/L、瓊脂20 g/L。

1.2 試驗(yàn)菌株

植物乳桿菌GDM1.191（Lactobacillus plantarum）、干酪乳桿菌GDM1.80（Lactobacillus casei）、嗜 桿 菌GDM1.208（Lactobacillus acidophilus）、嗜熱鏈球 菌GDM1.1808（Streptococcus thermophilus）、屎腸球 菌GDM1.388（Enterococcus faecium）、德氏乳桿 菌GDM1.1801（Lactobacillus delbrueckii）、產(chǎn)朊假絲酵 母GDM2.148（Candida utilis）、釀酒酵 母GDM2.90（Saccharomyces cerevisiae）、凝結(jié)芽孢桿菌GDM1.645（Bacillus coagulans），均購自廣東省微生物菌種保藏中心；鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）、納豆芽孢桿菌（Bacillus natto）為本實(shí)驗(yàn)室分離純化。

1.3 試驗(yàn)藥物

肌苷（生產(chǎn)批號：20210112）、鳥苷（生產(chǎn)批號：20210325）購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；尿酸（生產(chǎn)批號：20210120）購自上海沃凱化學(xué)試劑有限公司；高嘌呤鼠糧（100 g含嘌呤800 mg，生產(chǎn)批號：20210414）購自江蘇美迪森生物醫(yī)藥有限公司。

1.4 試驗(yàn)動(dòng)物

28日齡BALB/c小鼠購自武漢巴菲爾生物技術(shù)服務(wù)有限公司；30日齡雛鵝、45日齡肉雞由紅星養(yǎng)殖場提供。

1.5 試驗(yàn)方法

1.5.1 中藥發(fā)酵菌株篩選

1.5.1.1 中藥耐受性菌株篩選

采用以中藥發(fā)酵（篩選）培養(yǎng)基為中藥耐受性篩選固體培養(yǎng)基，115℃滅菌30 min，倒平板，冷卻待用。分別接入供試驗(yàn)用菌株，36℃厭氧培養(yǎng)48 h，觀察有無菌落長出。

1.5.1.2 降解利用尿酸菌株篩選

以尿酸為唯一氮源、碳源，采用降解尿酸菌株篩選培養(yǎng)基為尿酸固體培養(yǎng)基，115℃滅菌30 min，倒平板，冷卻待用。分別接入供試驗(yàn)用菌株，36℃厭氧培養(yǎng)48 h，觀察有無菌落長出。

1.5.1.3 降解嘌呤菌株篩選[11]

嘌呤核苷以肌苷和鳥苷為試驗(yàn)檢測對象，配置0.1 mol/L中性磷酸緩沖液，分別各加入肌苷和鳥苷使最終濃度為15 mmol/L。將供試驗(yàn)用菌株液體培養(yǎng)活化，離心收集菌體，再將菌體用無菌生理鹽水稀釋至活菌數(shù)約108CFU/mL的菌懸液備用，取4 mL菌懸液與2 mL中性磷酸緩沖液36℃厭氧培養(yǎng)1 h，沸水浴保溫5 min，離心取上清；經(jīng)0.22μm的無菌過濾器過濾，用于HPLC分析計(jì)算接種試驗(yàn)菌株前后嘌呤核苷的變化量；采用4 mL生理鹽水與2 mL中性磷酸緩沖液36℃厭氧培養(yǎng)1 h作為空白對照組。以試驗(yàn)組數(shù)據(jù)扣除空白對照組的影響，從而確定試驗(yàn)菌株是否能降解嘌呤核苷。

1.5.2 中藥發(fā)酵制備

以中藥發(fā)酵（篩選）培養(yǎng)基所需原料按100 L量稱取，加入150 L發(fā)酵罐中，加水100 L，開啟電機(jī)，80 r/min攪拌，以115℃滅菌蒸煮30 min，冷卻，按5%接入篩選獲得的復(fù)合益生菌菌種，36℃厭氧培養(yǎng)48 h，獲得中藥發(fā)酵液。所獲得的中藥發(fā)酵液直接進(jìn)行噴霧干燥，設(shè)置進(jìn)風(fēng)溫度為100℃，出風(fēng)溫度65℃，收集獲得噴霧干燥粉末，即為中藥發(fā)酵粉末制劑，后續(xù)檢測活菌數(shù)及水分。其中，復(fù)合益生菌菌種比例為：鼠李糖乳桿菌2%、植物乳桿菌1%、嗜酸乳桿菌1%、釀酒酵母菌1%。

中藥對照組為中藥發(fā)酵（篩選）培養(yǎng)基以115℃滅菌蒸煮30 min，冷卻，直接進(jìn)行噴霧干燥，收集獲得噴霧干粉粉末，即為中藥粉末。益生菌對照組為不加中藥成分，以葡萄糖30 g/L、牛肉膏8 g/L發(fā)酵復(fù)合益生菌，36℃厭氧培養(yǎng)48 h，進(jìn)行噴霧干燥，收集獲得噴霧干粉粉末，即為益生菌粉末。

1.5.3 小鼠痛風(fēng)模擬試驗(yàn)

選取100只小鼠，先適應(yīng)喂養(yǎng)1 w，隨機(jī)分為5組，每組20只，雌、雄各半。飼養(yǎng)期間，各組小鼠飲水自由。試驗(yàn)前4 d，5組小鼠均飼喂正常鼠糧，空白組為不做任何處理（正常小鼠模型）；對照模型組為4 d后飼喂高嘌呤鼠糧（高尿酸血癥模型）；試驗(yàn)1組為試驗(yàn)前4 d給藥灌服中藥發(fā)酵粉末制劑，4 d后飼喂高嘌呤鼠糧3 d；試驗(yàn)2組為試驗(yàn)前4 d給藥灌服純中藥粉末制劑，4 d后飼喂高嘌呤鼠糧3 d；試驗(yàn)3組為試驗(yàn)前4 d給藥灌服純益生菌粉末制劑，4 d后飼喂高嘌呤鼠糧3 d。收集所有組小鼠的尾靜脈血液，3 000 r/min離心15 min分離血漿，取血漿測定血尿酸含量[18]。

1.5.4 雛鵝預(yù)防痛風(fēng)試驗(yàn)

在福建漳州詔安橋頭鵝養(yǎng)殖場，隨機(jī)選取30日齡健康的雛鵝，共計(jì)400只，隨機(jī)分為4組，每組100只。空白組不給藥灌服；試驗(yàn)1組給藥灌服中藥發(fā)酵粉末制劑；試驗(yàn)2組給藥灌服純中藥粉末制劑；試驗(yàn)3組給藥灌服純益生菌粉末制劑。試驗(yàn)組按雛鵝體重1 g/kg給藥灌服，每2 d供藥1次，試驗(yàn)期20 d。

試驗(yàn)期間，鵝自由飲水，所喂飼料及管理一致。試驗(yàn)20 d結(jié)束后統(tǒng)計(jì)雛鵝痛風(fēng)發(fā)病只數(shù)及發(fā)病只數(shù)中死亡的只數(shù)，計(jì)算發(fā)病率、死亡率。

雛鵝痛風(fēng)診斷標(biāo)準(zhǔn)[19]：行動(dòng)遲緩、有障礙，腿、翅腫脹，厭食、精神萎靡、腹瀉等。

1.5.5 肉雞痛風(fēng)治療試驗(yàn)

在福建漳州紅星肉雞養(yǎng)殖場，隨機(jī)挑選45日齡，患有痛風(fēng)病的肉雞共計(jì)200只，隨機(jī)分為4組，每組50只?？瞻捉M不給藥灌服；試驗(yàn)1組給藥灌服中藥發(fā)酵粉末制劑；試驗(yàn)2組給藥灌服純中藥粉末制劑；試驗(yàn)3組給藥灌服純益生菌粉末制劑。試驗(yàn)組按肉雞體重1 g/kg給藥灌服，每2 d供藥1次，試驗(yàn)期10 d。

試驗(yàn)期間，肉雞自由飲水，所喂飼料及管理一致。試驗(yàn)10 d結(jié)束后統(tǒng)計(jì)每組肉雞痛風(fēng)病治愈數(shù)量及死亡數(shù)量，計(jì)算治愈率、死亡率。

肉雞痛風(fēng)診斷標(biāo)準(zhǔn)[20]：食欲下降、雞冠泛白、糞便多為白色稀水狀態(tài)，腿、翅關(guān)節(jié)腫脹和疼痛，行動(dòng)遲緩、不愿站立或久站。

肉雞痛風(fēng)治愈標(biāo)準(zhǔn)：肉雞精神狀態(tài)恢復(fù)正常，行動(dòng)敏捷、步態(tài)有力，勤于覓食，腿、翅關(guān)節(jié)的腫脹消失。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2020進(jìn)行整理，采用SPSS 22.0軟件中Duncan's法對數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較分析，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 中藥發(fā)酵菌株篩選（見表1）

由表1可知，試驗(yàn)選用的12株益生菌中多數(shù)能夠降解嘌呤核苷，但同時(shí)具備在高濃度中藥成分中正常生長、降解尿酸與嘌呤核苷的菌株有植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、釀酒酵母，且以鼠李糖乳桿菌與植物乳桿菌的降解能力最佳。因此，選取這4株益生菌為中藥發(fā)酵試驗(yàn)菌種。

表1 中藥發(fā)酵菌株篩選結(jié)果Tab.1 Screening results of Chinese medicine fermentation strains

2.2 中藥發(fā)酵制備結(jié)果

試驗(yàn)組經(jīng)復(fù)合益生菌發(fā)酵，噴霧干燥設(shè)備進(jìn)風(fēng)溫度為100℃，出風(fēng)溫度65℃，收集的粉末水分為8.80%，乳酸菌總活菌數(shù)3.84×109CFU/g，釀酒酵母活菌數(shù)1.80×107CFU/g，粒度為90目通過率100%。中藥對照組所獲得的為純中藥制劑，無益生菌成分，粒度為90目通過率100%。益生菌對照組，無中藥成分，乳酸菌總活菌數(shù)為4.18×109CFU/g，釀酒酵母活菌數(shù)1.2×107CFU/g，粒度為90目通過率100%。

2.3 小鼠痛風(fēng)模擬試驗(yàn)結(jié)果（見表2）

由表2可知，經(jīng)過3 d飼喂高嘌呤鼠糧，血尿酸值上升至367.84μmol/L。與對照模型組相比，試驗(yàn)1組血尿酸降解74.07%，試驗(yàn)2組血尿酸降解61.56%，試驗(yàn)3組血尿酸降解50.34%，血尿酸含量顯著或極顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)果表明，本研究制備的藥物能有效降低小鼠血尿酸含量。試驗(yàn)1組與試驗(yàn)2組、試驗(yàn)3組的血尿酸值分別相差46.03、87.27μmol/L，說明單一的中藥或益生菌制劑降低血尿酸的效果較差于中藥與益生菌的復(fù)合制劑。

表2 小鼠血尿酸檢測結(jié)果Tab.2 Results of serum uric acid in mice 單位：μmol/L

2.4 雛鵝預(yù)防痛風(fēng)試驗(yàn)結(jié)果（見表3）

由表3可知，試驗(yàn)1組的鵝痛風(fēng)病的發(fā)病率和死亡率極顯著低于空白組（P＜0.01）；試驗(yàn)2組鵝痛風(fēng)病發(fā)病率顯著低于空白組（P＜0.05），死亡率極顯著低于空白組（P＜0.01）；試驗(yàn)3組鵝痛風(fēng)病死亡率顯著低于空白組（P＜0.05）。試驗(yàn)1組的發(fā)病率與死亡率皆低于試驗(yàn)2組、試驗(yàn)3組，說明單一的中藥或益生菌成分防治雛鵝痛風(fēng)的功效較中藥與益生菌復(fù)合制劑差。

表3 雛鵝預(yù)防痛風(fēng)試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Results of gosling gout prevention test

2.5 肉雞痛風(fēng)治療試驗(yàn)結(jié)果（見表4）

由表4可知，隨機(jī)挑選的痛風(fēng)病肉雞200只，不進(jìn)行藥物干預(yù)的空白組死亡率達(dá)42.00%，而進(jìn)行藥物干預(yù)的試驗(yàn)組死亡率分別為0、8.00%與16.00%，與對照組相比，達(dá)顯著或極顯著水平（P＜0.05，P＜0.01）。試驗(yàn)1組的治愈率高于試驗(yàn)2組和試驗(yàn)3組的治愈率，說明單一的中藥或益生菌成分治療肉雞痛風(fēng)的功效較中藥與益生菌復(fù)合的制劑差。

表4 肉雞痛風(fēng)治療試驗(yàn)結(jié)果Tab.4 Results of gout treatment in broilers

3 討論

3.1 中藥發(fā)酵菌株的篩選

目前，用于中藥發(fā)酵領(lǐng)域的菌株主要包括：乳酸桿菌、芽孢桿菌、酵母菌等[21]。研究表明，無論采用單一菌株或者復(fù)合菌株發(fā)酵中藥，效果皆明顯優(yōu)于未發(fā)酵[22-27]。本研究通過對實(shí)驗(yàn)室12株益生菌進(jìn)行相關(guān)試驗(yàn)測試，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，8株乳酸菌具有降低嘌呤核苷的能力，不同乳酸菌菌株，其降解能力不同，與麻菊美等[28]、Yamada等[10]、王垚[11]的研究結(jié)果一致。結(jié)合12株益生菌對配方中中藥濃度的耐受能力及降解尿酸能力，篩選出植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌與釀酒酵母為發(fā)酵菌株，進(jìn)行中藥發(fā)酵相關(guān)試驗(yàn)。

3.2 中藥發(fā)酵制劑對家禽痛風(fēng)的防治作用

家禽痛風(fēng)病多發(fā)于雞、鵝，其病程緩慢，但發(fā)病率高。目前，家禽痛風(fēng)病主要以苯基喹啉羥酸、嘌呤醇、秋水仙堿等化學(xué)類藥物治療為主[1-4]，但存在毒副作用、藥物殘留等問題。劉玉花[29]采用中藥煎煮或者拌料方式進(jìn)行防治，其缺點(diǎn)是中藥藥效釋放較慢。本研究采用中藥先經(jīng)超微粉碎后進(jìn)行微生物發(fā)酵，再經(jīng)噴霧干燥，中藥有效成分釋放快速，益生菌菌株發(fā)酵代謝產(chǎn)物及藥材成分皆保留在該中藥發(fā)酵粉末制劑中，避免造成浪費(fèi)。

在以小鼠做降解血尿酸的模擬試驗(yàn)中，小鼠血尿酸值經(jīng)過3 d飼喂高嘌呤鼠糧后，由78μmol/L上升至368μmol/L，血尿酸模型構(gòu)成。試驗(yàn)組在飼喂高嘌呤鼠糧的同時(shí)，連續(xù)灌服用藥，明顯血尿酸含量有所下降，分別為95.38、141.41、182.65μmol/L，與金方等[30]利用干酪乳桿菌ZM15、楊殿斌[31]利用植物乳桿菌對高尿酸血癥大鼠模型的研究一致。

雛鵝、肉雞發(fā)生痛風(fēng)，如果不進(jìn)行藥物干預(yù)，其死亡率較高。在雛鵝預(yù)防痛風(fēng)與肉雞治療痛風(fēng)試驗(yàn)中，結(jié)果表明，使用本研究的中藥發(fā)酵制劑能夠有效預(yù)防與治療痛風(fēng)病，且中藥發(fā)酵制劑的效果優(yōu)于單純的中藥或益生菌制劑，說明益生菌在輔助治療或預(yù)防家禽痛風(fēng)病的發(fā)生起到一定的作用。在后續(xù)的研究中，將根據(jù)中藥發(fā)酵制劑對家禽痛風(fēng)的防治效果尋找出最佳使用劑量及在其他家畜中的應(yīng)用。

4 結(jié)論

研究表明，該中藥發(fā)酵制劑能夠有效預(yù)防家禽的痛風(fēng)病。益生菌與中藥相結(jié)合治療家禽痛風(fēng)方式在預(yù)防或輔助治療家禽痛風(fēng)病具有良好的應(yīng)用前景，同時(shí)也為后續(xù)的相關(guān)產(chǎn)品研發(fā)奠定基礎(chǔ)。