乳源金黃色葡萄球菌生物被膜形成能力及多位點(diǎn)序列分型分析

王晗晟，阮紅日，付琳清，劉 夢，靳育琦，葛延松，宋 軍

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，黑龍江大慶163316）

奶牛乳房炎（bovine mastitis）是奶牛最常見的疾病之一，會引起棄奶、奶制品質(zhì)量下降及患病牛淘汰等[1-2]。引起奶牛乳房炎的病因復(fù)雜，其中金黃色葡萄球菌是引起接觸傳染型奶牛乳房炎的主要病因之一。金黃色葡萄球菌引起的奶牛乳房炎具有傳染性強(qiáng)、治愈率低、復(fù)發(fā)率高的特點(diǎn)。同時，抗生素的濫用導(dǎo)致金黃色葡萄球菌的耐藥性愈來愈強(qiáng)，嚴(yán)重阻礙我國奶牛養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展[3]。

細(xì)菌生物被膜是細(xì)菌及其自生分泌的胞外聚合物組成的細(xì)菌聚集膜樣物。形成生物被膜的細(xì)菌具有較高的代謝能力，隱蔽在生物被膜的細(xì)菌難以被抗生素清除，生物被膜對抗生素的抗性問題日趨嚴(yán)重[4-6]。生物被膜的形成受多種因子的調(diào)控。Ica操作子（icaADBC）編碼的細(xì)胞間多糖黏附素在生物被膜的形成過程中起決定性的作用[7]。Ica操作子主要由IcaA、IcaB、IcaC和IcaD組成，能夠誘導(dǎo)葡糖胺轉(zhuǎn)移酶的合成，從而促進(jìn)生物被膜的黏附過程。Ica的表達(dá)又受到IcaR、σ因子sigB的調(diào)控。此外，Eno、Atl、aap、Bap等基因?qū)τ谏锉荒ば纬蛇^程中的初始黏附有著重要的影響[8-9]。近年來，金黃色葡萄球菌的耐藥菌株不斷出現(xiàn)，尤其是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistantStaphylococcus aureus,MRSA）[10]。MRSA是一種具有多重耐藥性、流行性強(qiáng)、病死率高的病原菌。目前，分子分型已被證明是研究MRSA流行病學(xué)的重要工具?，F(xiàn)已開發(fā)出多種技術(shù)來分型MRSA分離株，包括脈沖場凝膠電泳（PFGE）、金黃色葡萄球菌染色體mec盒（SCCmec）、A蛋白（spa）分型和多位點(diǎn)序列分型（MLST），均具有較高的鑒別能力[11]。本試驗通過分析乳源金黃色葡萄球菌的生物被膜形成能力、被膜相關(guān)基因和MLST，為控制乳源金黃色葡萄球菌感染提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗菌株

55株臨床分離的金黃色葡萄球菌由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)牛病防制重點(diǎn)實驗室提供。菌株經(jīng)鑒定后，由本實驗室保存。S.aureusATCC 43300購自美國典型微生物菌種保藏中心（ATCC），實驗室保存。

1.1.2 試劑及材料

試劑：蛋白胨、酵母提取物、氯化鈉、胰蛋白胨大豆培養(yǎng)基、瓊脂粉、結(jié)晶紫、PBS緩沖液、2×Taq DNA聚合酶、DNA Marker DL-2000、瓊脂糖、50×TAE緩沖液。

儀器：超凈工作臺（北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司）、電熱恒溫振蕩器（上海森信實驗儀器有限公司）、臺式室溫離心機(jī)（德國Eppendorf公司）、分光光度計（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）、高壓蒸汽滅菌鍋（松下健康醫(yī)療器械（上海）有限公司）、PCR擴(kuò)增儀（美國BIO-RAD）、電泳儀（美國BIO-RAD）、凝膠成像系統(tǒng)（美國BIO-RAD）、電子天平（上海菁海儀器有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株復(fù)蘇

將-80℃冰箱中保存的金黃色葡萄球菌接種至LB固體培養(yǎng)基，于37℃過夜培養(yǎng)。次日，挑取LB固體培養(yǎng)基上一個形態(tài)較好的菌落，接種于1 mL液體LB培養(yǎng)基中，37℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)8～10 h，4℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 結(jié)晶紫半定量法測定乳源金黃色葡萄球菌生物被膜形成能力

將1.2.1中復(fù)蘇的55個臨床分離株再次轉(zhuǎn)接到2 mL TSB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)6～8 h至對數(shù)生長期，并調(diào)整菌液濃度至OD600nm為0.5（細(xì)菌濃度約為109CFU/mL）。取96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入180μL液體TSB培養(yǎng)基和20μL對數(shù)生長期的菌液，每個菌株重復(fù)3孔。每一培養(yǎng)板中同時設(shè)標(biāo)準(zhǔn)菌株組和空白對照組（只含培養(yǎng)液）各3孔。將加過樣品的96孔板于37℃靜置培養(yǎng)48 h。棄去培養(yǎng)基，每孔用200μL無菌PBS洗3次。每孔加入95%的甲醇溶液200μL，固定30 min。棄去固定液，每孔用PBS沖洗3次，自然風(fēng)干。每孔加入250μL 1%的結(jié)晶紫染色液，室溫靜置30 min。棄去染色液，用流水沖洗每孔3～5次，徹底洗去未結(jié)合的染色液，放入烘箱烘干。每孔加入33%的乙酸溶液250μL，搖床上振蕩15 min，充分釋放生物被膜中結(jié)合的染色液，最后用酶標(biāo)儀測定600 nm波長的OD值。

判斷方法：以空白對照孔所測得OD600nm的兩倍作為臨界點(diǎn)ODc。當(dāng)ODc＞OD時，判斷細(xì)菌無生物被膜形成能力（-）；當(dāng)ODc≤OD≤2×ODc時，判定細(xì)菌生物被膜形成能力較弱（+）；當(dāng)OD＞2×ODc時，判定細(xì)菌形成生物被膜的能力較強(qiáng)（++）。

1.2.3 乳源金黃色葡萄球菌生物被膜形成相關(guān)基因的分布情況

將1.2.1中復(fù)蘇的55株金黃色葡萄球菌和標(biāo)準(zhǔn)菌株轉(zhuǎn)接到2 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩8～10 h。按照細(xì)菌DNA提取試劑盒說明書步驟提取細(xì)菌DNA。以ATCC 43300作為標(biāo)準(zhǔn)菌株，根據(jù)GenBank上的DNA序列設(shè)計IcaA、IcaD、IcaR、Eno和Bap等生物被膜形成相關(guān)基因，由北京擎科生物科技有限公司合成，引物信息見表1。使用提取好的細(xì)菌DNA作為模板，根據(jù)近岸蛋白質(zhì)科技有限公司2×Taq DNA聚合酶說明書設(shè)計PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序，反應(yīng)體系（總體積20μL）：2×Taq DNA聚合酶10μL，正向引物1μL，反向引物1μL，DNA模板1μL，ddH2O 7μL。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性90 s，94℃變性30 s，退火（溫度根據(jù)引物設(shè)定）30 s，72℃延伸30～60 s，以上3個步驟循環(huán)30次，最后72℃延伸5 min，4℃保存，以ATCC 43300作為陽性對照。取PCR產(chǎn)物5μL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，之后放于凝膠成像系統(tǒng)成像。

表1 生物被膜形成相關(guān)基因引物Tab.1 Biofilm formation-related gene primer

1.2.4 乳源耐甲氧西林金黃色葡萄球菌多位點(diǎn)序列（MLST）分型

將耐甲氧西林金黃色葡萄球菌耐藥基因（mecA）引物mecA F：5'GTGAAGATATACCAAGTGATT3'和mecA R：5'ATGCGCTATAGATTGAAAGGAT3'送至北京擎科生物科技有限公司合成，利用PCR擴(kuò)增mecA基因，PCR體系同1.2.3所用反應(yīng)體系。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性90 s，94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min，以上3個步驟循環(huán)30次，最后72℃延伸5 min，4℃保存，以ATCC 43300作為陽性對照。

取PCR產(chǎn)物5μL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，之后放于凝膠成像系統(tǒng)成像，如果為陽性則表示該細(xì)菌屬于耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）。

根據(jù)MLST數(shù)據(jù)庫中金黃色葡萄球菌數(shù)據(jù)庫（https://pubmlst.org/saureus/）提及的管家基因（arcC、aroE、glpF、gmk、pta、tpi和yqiL）對本試驗分離的MRSA進(jìn)行檢測。相關(guān)引物均由北京擎科生物科技有限公司合成。金黃色葡萄球菌管家基因引物信息見表2。使用之前提取好的細(xì)菌DNA作為模板，使用近岸蛋白質(zhì)科技有限公司2×Taq DNA聚合酶，PCR體系同1.2.3所用反應(yīng)體系。反應(yīng)程序94℃預(yù)變性90 s，94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30～60 s，以上3個步驟循環(huán)35次，最后72℃延伸5 min，4℃保存。以ATCC 43300作為陽性對照。

表2 金黃色葡萄球菌管家基因引物Tab.2 Primer sequences of MLST PCR

取PCR產(chǎn)物3～5μL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，放于凝膠成像系統(tǒng)成像，觀察目的條帶。將PCR產(chǎn)物送至北京擎科生物科技有限公司測序。將測序后的結(jié)果使用DNASTAR進(jìn)行拼接，上傳至金黃色葡萄球菌多位點(diǎn)分型數(shù)據(jù)庫中比對，即得到相應(yīng)的基因型和序列型（STs）。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳源金黃色葡萄球菌生物被膜形成能力（見表3）

由表3可知，55株金黃色葡萄球菌中34株生物被膜形成能力較強(qiáng)，17株生物被膜形成能力較弱，4株無生物被膜形成能力。

表3 乳源金黃色葡萄球菌生物被膜形成能力Tab.3 Formation ability of milk-derived Staphylococcus aureus biofilm

2.2 乳源金黃色葡萄球菌生物被膜形成相關(guān)基因的分布情況（見表4）

由表4可知，Eno和Alt檢出率分別為89%和60%，表明乳源金黃色葡萄球菌具有較強(qiáng)的黏附能力。IcaA、IcaD和IcaR基因的檢出率分別為44%、36%和27%，表明大多數(shù)生物被膜的形成都由ica系統(tǒng)參與調(diào)節(jié)。sigB基因的檢出率為25%，Bap的檢出率為18%，aap檢出率為42%。統(tǒng)計結(jié)果發(fā)現(xiàn)，生物被膜形成能力強(qiáng)的菌株都攜帶多個生物被膜形成相關(guān)基因，說明生物被膜的形成過程可能是受多個基因共同調(diào)節(jié)。

表4 乳源金黃色葡萄球菌生物被膜形成相關(guān)基因分布情況Tab.4 Results of detection of genes related to the formation of milk-derived S.aureus biofilm

2.3 乳源耐甲氧西林金黃色葡萄球菌多位點(diǎn)序列（MLST）分型（見圖1、表5）

圖1 部分金黃色葡萄球菌MILS分型PCR結(jié)果Fig.1 Part of S.aureus MILS typing PCR results

由圖1可知，通過PCR擴(kuò)增mecA基因，發(fā)現(xiàn)55株臨床分離金黃色葡萄球菌中有17株為MRSA。

由表5可知，對這17株MRSA進(jìn)行MLST分型，結(jié)果顯示，17株金黃色葡萄球菌分為9個不同ST，但均屬于已發(fā)現(xiàn)的ST型，其中ST97型5株，ST398型4株，ST239型2株，ST1、ST5、ST9、ST2157、ST5796和ST5817型各1株。本試驗對這9個ST型進(jìn)行了聚類分析，發(fā)現(xiàn)9個ST共聚類為5種克隆復(fù)合群，包括CC1、CC5、CC8、CC97和CC398。

表5 金黃色葡萄球菌的MLST分型Tab.5 MLST typing of S.aureus

3 討論

結(jié)晶紫可對細(xì)菌細(xì)胞以及生物被膜基質(zhì)中的一些成分進(jìn)行染色，非常適合量化生物被膜，因此常被用于測定各種細(xì)菌生物被膜形成能力。本研究中，34株（62%）生物被膜能力較強(qiáng)，17株（31%）生物被膜形成能力較弱，4株（7%）無生物被膜形成能力，說明乳源金黃色葡萄球菌普遍具有較強(qiáng)的生物被膜形成能力。Ica操縱子主要包括IcaA、IcaD和IcaBC，可以調(diào)控胞間多糖黏附素（PIA）的表達(dá)，能夠促進(jìn)生物被膜的形成，而IcaR能夠抑制ica系統(tǒng)的表達(dá)，起到調(diào)控生物被膜生長的作用[12]。本試驗中，IcaA、IcaD和IcaR基因的檢出率分別為44%、36%和27%，表明大部分金黃色葡萄球菌都具有ica操縱子。本試驗中，Eno、Atl、aap和Bap的檢出率分別為89%、60%、42%和18%，表明乳源金黃色葡萄球菌具有較強(qiáng)的黏附能力。本研究中，生物被膜形成能力較強(qiáng)的菌株都攜帶多個生物被膜相關(guān)基因，但也有生物被膜形成能力較弱的菌株攜帶多個基因的現(xiàn)象，說明生物被膜的形成是個復(fù)雜生物過程。這些基因在形成過程中可能發(fā)揮一定的作用，但也會受其他因素的影響，如細(xì)菌密度、環(huán)境脅迫等[13]。

由于臨床乳房炎致病菌的耐藥性問題愈發(fā)嚴(yán)重，本研究檢測乳源金黃色葡萄球菌攜帶mecA基因的情況，發(fā)現(xiàn)55株細(xì)菌中有17株（31%）攜帶該耐藥基因，說明乳源致病菌的耐藥性已十分嚴(yán)重。對這部分MRSA進(jìn)行MLST分型，17株金黃色葡萄球菌分為9個ST型，但都屬于已發(fā)現(xiàn)的ST型，其中ST97和ST398為優(yōu)勢株，與王登峰[14]調(diào)查牛源金黃色葡萄球菌優(yōu)勢流行菌株結(jié)果相似，表明引起奶牛乳房炎的細(xì)菌型別相對較集中。但是，也有研究顯示，不同地區(qū)養(yǎng)殖場的金黃色葡萄球菌ST分型存在較大區(qū)別，可能是致病菌在某一區(qū)域擴(kuò)散，從而使其在這一區(qū)域流行[15-16]。已有文獻(xiàn)報道，ST398型金黃色葡萄球菌可以在人和動物之間傳播[17]。本研究中，ST398也為優(yōu)勢菌株，說明在本地區(qū)乳源金黃色葡萄球菌可能會引起人畜共同感染。

4 結(jié)論

本試驗通過對55株乳源金黃色葡萄球菌被膜形成能力及多位點(diǎn)序列分型分析，發(fā)現(xiàn)本地區(qū)的乳源金黃色葡萄球菌普遍具有較強(qiáng)的生物被膜形成能力，并且分型主要集中在ST97和ST398。