螺旋藻多糖提取物對南美白對蝦血淋巴細(xì)胞免疫功能的影響

季 露，朱 萌，張 文，于美玲，韋英益，覃志彪，胡庭俊

（廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧530005）

在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，為保證養(yǎng)殖動(dòng)物的存活率、實(shí)現(xiàn)更高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，養(yǎng)殖戶普遍采用增強(qiáng)養(yǎng)殖動(dòng)物免疫力的手段。免疫增強(qiáng)劑能夠有效提高養(yǎng)殖動(dòng)物的免疫力，增強(qiáng)養(yǎng)殖動(dòng)物的淋巴細(xì)胞活性，強(qiáng)化其殺菌能力。一般免疫增強(qiáng)劑的藥劑包括多糖類、維生素類、益生菌等[1]。據(jù)報(bào)道，使用含有褐藻多糖的飼料飼喂斑節(jié)對蝦，蝦的生長性能提高，血細(xì)胞總數(shù)、酚氧化酶活性、呼吸爆發(fā)、SOD活性、吞噬活性、細(xì)菌清除和殺菌活性增強(qiáng)，表明飼喂添加褐藻多糖的日糧能夠增強(qiáng)蝦免疫系統(tǒng)抵抗副溶血性弧菌感染的能力[2]。在克氏原螯蝦的飼料中添加黃芪多糖能夠不同程度地提高克氏原螯蝦肝胰腺和肌肉中的超氧化物歧化酶、堿性磷酸酶、酸性磷酸酶、過氧化氫酶和溶菌酶活性，表明黃芪多糖能夠提高克氏原螯蝦的免疫功能[3]。螺旋藻多糖是從螺旋藻（Spirulina）中分離提取出來的水溶性天然產(chǎn)物，是螺旋藻的主要生物活性成分之一。螺旋藻多糖可以參與調(diào)節(jié)細(xì)胞活性，具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抗腫瘤、抗病毒、抗輻射和降血糖等作用[4]。本試驗(yàn)通過CCK8法檢測，篩選獲得螺旋藻多糖提取物對南美白對蝦血淋巴細(xì)胞安全濃度，選擇適宜濃度處理對蝦血淋巴細(xì)胞12 h，觀察螺旋藻多糖提取物對血淋巴細(xì)胞中ACP、AKP和POD活性的影響，以評估螺旋藻多糖提取物對南美白對蝦血淋巴細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)藥物

螺旋藻多糖提取物，由廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院藥理實(shí)驗(yàn)室提取。黃芪多糖，淡黃色粉末，購自北京生泰爾生物科技集團(tuán)，總糖含量為70%。

1.1.2 試驗(yàn)細(xì)胞

南美白對蝦血淋巴細(xì)胞采自廣西水產(chǎn)科學(xué)研究院南美白對蝦良種基地提供的SPF級南美白對蝦。

1.1.3 試驗(yàn)試劑

Leibovitz's L-15培養(yǎng)基（美國，HyClone）；胎牛血清（美國，Gibco）；L-谷氨酰胺、青-鏈霉素、PBS（北京索萊寶科技有限公司）；CCK8（南京諾唯贊生物科技有限公司）；POD（南京建成生物工程研究所，批號：20200102）；ACP（南京建成生物工程研究所，批號：20200103）；AKP（南京建成生物工程研究所，批號：20191226）；BCA（南京建成生物工程研究所，批號：20200102）；檸檬酸三鈉（北京索萊寶科技有限公司）。

1.1.4 試劑的配制

0.01 mol/L PBS溶液：22.40 g的PBS磷酸鹽干粉溶于雙蒸水，定容至2 L，調(diào)節(jié)pH值7.0～7.2。高壓滅菌（121℃、15 min），封口，保存，備用。

L-15完全培養(yǎng)基（100 mL）：L-15培養(yǎng)液88 mL、胎牛血清10 mL、10×青鏈霉素混合液1 mL、谷氨酰胺1 mL，無菌混合，備用。

5%檸檬酸三鈉抗凝劑：5.00 g檸檬酸三鈉溶于100 mL雙蒸水中，高溫、高壓滅菌，備用。

1.1.5 試驗(yàn)儀器

C150二氧化碳培養(yǎng)箱（德國，BINDER）、Cellometer Auto 2000細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（美國，Nexcelom）、TS100倒置顯微鏡（日本，Nikon）、Tecan Infinite 200 Pro多功能酶標(biāo)儀（瑞士，TECAN）、Direct-Q 5UV純水系統(tǒng)（德國，Merck Millipore）、JY92-ⅡD細(xì)胞超聲破碎儀（寧波新芝生物科技有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞收集

在超凈工作臺(tái)中先使用75%酒精噴灑南美白對蝦體表，使用酒精棉球擦拭以除菌。采用加入抗凝劑的2 mL注射器從南美白對蝦頭胸甲后緣與第一腹節(jié)的連接處取血淋巴液，在4℃、1 000 g離心10 min，棄去上清，收集細(xì)胞，加入L-15完全培養(yǎng)液，使用培養(yǎng)液將血淋巴細(xì)胞懸浮起來，保證細(xì)胞全部散開。取20μL細(xì)胞懸液用于細(xì)胞計(jì)數(shù)，以確定需要加入培養(yǎng)液的量使細(xì)胞培養(yǎng)板每個(gè)孔中的細(xì)胞密度分布均勻。將細(xì)胞懸液加入細(xì)胞培養(yǎng)板上，培養(yǎng)板置于28℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 CCK8法測定細(xì)胞存活率

將上述原代細(xì)胞配制成2×106個(gè)細(xì)胞/mL的細(xì)胞懸液。取0.2 mL分別接種到96孔板中，放置于28℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中孵育過夜。將細(xì)胞分為細(xì)胞對照組（不含藥物的血淋巴細(xì)胞）、試驗(yàn)組（含藥物的血淋巴細(xì)胞）、空白組（不含細(xì)胞及藥物），每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞貼壁后，棄去上清。在空白組和對照組的孔里各加入0.2 mL培養(yǎng)液，在試驗(yàn)組孔中分別加入含不同濃度螺旋藻多糖提取物（50、100、200、400、800、1 600 mg/L）培養(yǎng)液0.2 mL/孔。在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每孔加入CCK8液20μL，培養(yǎng)箱中孵育4 h，在酶標(biāo)儀上測定各孔的吸光度（OD）值，波長450 nm，每組取6個(gè)復(fù)孔平均值。用以下公式計(jì)算細(xì)胞活力。

1.2.3 免疫相關(guān)酶活性的測定

設(shè)置對照組（不含藥物的血淋巴細(xì)胞）、試驗(yàn)組（含螺旋藻多糖提取物的血淋巴細(xì)胞）、陽性藥物對照組（含黃芪多糖的血淋巴細(xì)胞），每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。將原代細(xì)胞配制成3×107個(gè)細(xì)胞/mL的細(xì)胞懸液，取2 mL分別接種到24孔板中，放置在28℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)孵育過夜。細(xì)胞貼壁后，棄去上清。在對照組各孔中加入2 mL完全培養(yǎng)基，在陽性對照組孔中各加入含200 mg/L黃芪多糖的完全培養(yǎng)基，在試驗(yàn)組孔中分別加入含不同濃度（50、100、200、400 mg/L）螺旋藻多糖提取物的完全培養(yǎng)基，2 mL/孔。在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)12 h，棄去上清，PBS洗細(xì)胞2次，每孔再加入1 mL PBS，使用刮刀將細(xì)胞刮下來，收集細(xì)胞，超聲破碎，測定酸性磷酸酶（ACP）、堿性磷酸酶（AKP）和過氧化物酶（POD）等的活性，嚴(yán)格按照試劑盒（南京建成生物工程研究所）操作。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)利用SPSS 21.0進(jìn)行單因素方差分析（One-Way ANOVA）分析，使用LSD法進(jìn)行多重比較，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 螺旋藻多糖提取物對南美白對蝦血淋巴細(xì)胞存活率的影響（見表1）

由表1可知，與細(xì)胞對照組相比，當(dāng)螺旋藻多糖提取物濃度范圍在50～400 mg/L時(shí)，對南美白對蝦血淋巴細(xì)胞的存活率無顯著影響（P＞0.05）；當(dāng)藥物濃度為800～1 600 mg/L時(shí)，細(xì)胞存活率極顯著降低（P＜0.01）。因此，選用螺旋藻多糖提取物50、100、200、400 mg/L作為下一步試驗(yàn)的濃度。

表1 不同濃度的螺旋藻多糖提取物對南美白對蝦血淋巴細(xì)胞存活率的影響Tab.1 Effect of different concentrations of Spirulina polysaccharide extract on activity of blood lymphocytes of Penaeusvannamei

2.2 螺旋藻多糖提取物對南美白對蝦血淋巴細(xì)胞中免疫相關(guān)酶活性的影響（見表2）

由表2可知，與對照組相比，黃芪多糖組和50、100、200 mg/L試驗(yàn)組的ACP活性均極顯著升高（P＜0.01）；50 mg/L試驗(yàn)組的AKP、POD活性均極顯著升高（P＜0.01）；100 mg/L試驗(yàn)組的AKP、POD活性顯著升高（P＜0.05）；200 mg/L試驗(yàn)組的POD活性極顯著升高（P＜0.01）；400 mg/L試驗(yàn)組的AKP、POD活性分別顯著（P＜0.05）、極顯著（P＜0.01）升高。

表2 螺旋藻多糖提取物對南美白對蝦血淋巴細(xì)胞中免疫相關(guān)酶活性的影響Tab.2 Effect of Spirulina polysaccharide extract on the activity of immune-related enzymes in blood lymphocytes of Penaeusvannamei

3 討論

甲殼類動(dòng)物由于缺乏脊椎動(dòng)物的適應(yīng)性免疫，因此主要依靠先天免疫系統(tǒng)，免疫系統(tǒng)主要由三部分組成：物理防御、細(xì)胞免疫和體液免疫[5-6]。甲殼類動(dòng)物體液免疫主要依靠血淋巴中的酶、免疫因子以及調(diào)節(jié)因子等[7]。在細(xì)胞免疫中，血細(xì)胞發(fā)揮著巨大作用。血細(xì)胞受到損傷時(shí)，甲殼類動(dòng)物的免疫功能將會(huì)下降[8-9]。AKP和ACP是反映蝦非特異性免疫功能的重要指標(biāo)[10]，是甲殼動(dòng)物溶酶體的重要組成成分，與血細(xì)胞的吞噬作用和包囊作用相聯(lián)系[11]，可以直接參與磷酸基團(tuán)的轉(zhuǎn)移和代謝反應(yīng)，在甲殼類動(dòng)物血液和血細(xì)胞中起著重要的機(jī)體防御作用。劉曉云等[12]研究發(fā)現(xiàn)，ACP和AKP以酶原形式存在于小顆粒細(xì)胞的顆粒中，過氧化物酶原被合成并儲(chǔ)存在顆粒細(xì)胞和小顆粒細(xì)胞的顆粒中。在正常健康的蝦機(jī)體中，這些顆粒不會(huì)在細(xì)胞中表現(xiàn)出酶活性。但是，當(dāng)蝦患病時(shí)，顆粒細(xì)胞能以細(xì)胞解體的方式排出細(xì)胞內(nèi)的顆粒，轉(zhuǎn)化成有活性的酶，所以導(dǎo)致血清中ACP和AKP活性升高。POD是機(jī)體內(nèi)重要的酶類之一，參與多種生理代謝反應(yīng)，能夠減少自由基對正常細(xì)胞的損傷，清除細(xì)胞生理代謝過程中的活性氧，從而提高機(jī)體的解毒免疫功能和抗病能力[13]。

多糖能夠提高體外細(xì)胞的免疫活性。Li等[14]研究發(fā)現(xiàn)，從辣木葉中提取的1種新型多糖（MOP-3），能夠增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的能力、促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌活性氧（ROS）、一氧化氮（NO）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α），表明該多糖能夠激活巨噬細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子，從而達(dá)到對抗病原體的目的。魏文青等[15]在探究海藻硫酸多糖對正常小鼠和免疫低下小鼠免疫功能的研究中發(fā)現(xiàn)，海藻硫酸多糖體外對T、B淋巴細(xì)胞有促增殖作用；對環(huán)磷酰胺所導(dǎo)致的免疫功能低下小鼠，海藻硫酸多糖可以通過調(diào)節(jié)血象，增加胸腺指數(shù)，提高T淋巴細(xì)胞數(shù)量，促進(jìn)T、B淋巴細(xì)胞增殖來提高小鼠免疫功能。謝鵬[16]研究發(fā)現(xiàn)，脂多糖可直接作用于對蝦血細(xì)胞，引起總血細(xì)胞數(shù)量和三類血細(xì)胞數(shù)量的變化；脂多糖可以增強(qiáng)血細(xì)胞的吞噬能力，引起血細(xì)胞的胞吐，釋放酚氧化酶原系統(tǒng)。

在本試驗(yàn)中，與對照組相比，50、100、200 mg/L螺旋藻多糖提取物組的ACP活性均極顯著升高；50、100、400 mg/L螺旋藻多糖提取物組的AKP活性分別極顯著或顯著升高；所有螺旋藻多糖提取物組的POD活性均極顯著或顯著升高，表明螺旋藻多糖提取物可以促進(jìn)血細(xì)胞中酶原顆粒的排出和激活。本試驗(yàn)結(jié)果表明，螺旋藻多糖提取物在一定的濃度范圍內(nèi)，可以通過促進(jìn)血細(xì)胞中免疫相關(guān)酶的釋放和活化來增強(qiáng)機(jī)體的非特異性免疫。本研究結(jié)果為開發(fā)螺旋藻多糖提取物作為南美白對蝦生態(tài)健康養(yǎng)殖的免疫增強(qiáng)劑提供參考。

4 結(jié)論

螺旋藻多糖提取物濃度范圍在50～400 mg/L時(shí)，對南美白對蝦血淋巴細(xì)胞的存活率無顯著影響，能夠提高南美白對蝦血淋巴細(xì)胞的免疫功能。