miR156介導(dǎo)SPLs參與調(diào)控擬南芥種子成熟過程

張小乙，韓 雪，李紅雪，王晶瑩，王守文，翟璐璐

（吉林大學(xué)植物科學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130062）

【研究意義】種子不僅是植物生命的起始，也是人類賴以生存的最基本食物及禽畜飼料的來源。高等植物的種子發(fā)育過程可分為兩個主要階段：胚和胚乳的形態(tài)建成以及種子成熟［1］，其中種子成熟是一個特異、復(fù)雜的發(fā)育過程，起始于心型胚的形成，經(jīng)歷胚的生長與膨大填充、貯藏物質(zhì)（主要包括貯藏蛋白、脂類和碳水化合物等）及ABA的積累、種子脫水與休眠等過程，終止于種子干燥期結(jié)束。種子成熟是種子發(fā)育的重要階段，不僅是決定種子質(zhì)量和產(chǎn)量的重要時期，還是影響種子貯藏和質(zhì)量保存的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，因此，越來越多的科研人員將目光投向植物種子成熟的相關(guān)研究領(lǐng)域。盡管人們對種子成熟調(diào)控網(wǎng)絡(luò)有一定認(rèn)識，但全面揭示這種調(diào)控網(wǎng)絡(luò)還需挖掘更多的關(guān)鍵因子。

【前人研究進(jìn)展】miRNAs是一類廣泛存在于真核生物中的內(nèi)源性、非編碼、小分子RNA，其長度為19～24 nt。miRNA于1994年在秀麗隱桿線蟲中首次被發(fā)現(xiàn)［2］。此后，陸續(xù)有真核生物的miRNA被鑒定出。2002年，首個植物中的miRNA在擬南芥中得到鑒定［3-4］此后，關(guān)于植物miRNAs的研究開始得到廣泛關(guān)注。隨著近年來高通量測序技術(shù)的不斷發(fā)展與廣泛應(yīng)用，越來越多來自不同物種、組織的miRNA被陸續(xù)鑒定和分析，目前為止，已從80余種植物中鑒定出上萬個miRNA（miRBase數(shù)據(jù)庫，http://www.mirbase.org/）。相關(guān)研究已經(jīng)證實，miRNA能在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后及翻譯水平上負(fù)向調(diào)控其靶標(biāo)基因的表達(dá)，從而參與植物生長發(fā)育各方面，包括植物器官發(fā)育［5］、生理狀態(tài)轉(zhuǎn)化［6］、植物激素調(diào)控［7］、營養(yǎng)平衡［8］以及脅迫響應(yīng)［9］等，而靶標(biāo)基因中不乏大量轉(zhuǎn)錄因子，如SPL（SQUAMOSA Promoter-Binding Protein-Like）［10］、MYB［11］、NAC［12］、ARF［13］、HD-Zip［14］和AP2［15］等，這也揭示了miRNA在基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的核心地位。miR156是高度保守的家族之一［16］，最初發(fā)現(xiàn)于擬南芥［17］，通過調(diào)控SBP/SPL基因參與植物的生長發(fā)育過程［18-19］，如種子萌發(fā)［20］、葉片發(fā)育形態(tài)建成、花期調(diào)控［21］、生殖器官發(fā)育［22］以及次生代謝物花青苷合成等［23］。Nodine和Bartel在DCL1（DICER-LIKE1）突變體中，證實miR156可在早期胚的分化階段通過調(diào)控SPL10和SPL11的表達(dá)阻止分化、促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子的提前表達(dá)，從而實現(xiàn)胚的正常發(fā)育［24］。其中，早期研究更多關(guān)注種子發(fā)育過程中胚的形態(tài)建成部分，對于種子成熟方面的相關(guān)報道較為有限。Huang等［25］利用高通量測序技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，miR156家族在種子和成熟胚中的表達(dá)量最高，其中多數(shù)成員在胚發(fā)育過程中表達(dá)，且表達(dá)量隨種子成熟而呈穩(wěn)定上升趨勢，是控制油菜種子發(fā)育和成熟的主要因子。隨后，Chao等［26］分析了miR156在蝴蝶蘭葉、根、花、種子等不同組織部位中的表達(dá)情況，同樣發(fā)現(xiàn)miR156在種子中具有較高的表達(dá)量。另有研究發(fā)現(xiàn)，miR156a在胡麻種子發(fā)育后期表達(dá)量顯著升高，并影響種子含油率［27］。目前，多數(shù)相關(guān)研究集中在基因鑒定和表達(dá)模式層面，關(guān)于植物種子成熟過程中miR156的調(diào)控機(jī)制尚不完整，有待進(jìn)一步研究。

【本研究切入點】植物 種子成熟是一個復(fù)雜的發(fā)育過程，各環(huán)節(jié)伴隨大量基因選擇性的激活和抑制，目前該過程的調(diào)控機(jī)制著力于轉(zhuǎn)錄因子、功能蛋白、表觀遺傳等類別調(diào)控因子的研究，miRNA特別是miR156在這一生命過程中的作用及調(diào)控機(jī)制尚不清晰?！緮M解決的關(guān)鍵問題】為探究miR156及其靶標(biāo)基因在植物種子發(fā)育過程中尤其是成熟階段的調(diào)控功能，本研究選用miR156下調(diào)突變體MIM156及SPL過表達(dá)突變體材料，利用本實驗室建立的β-葡萄糖苷酸酶（GUS）蛋白構(gòu)建大豆種子貯藏蛋白基因（Conglycinin）的報告基因檢測體系，對miR156及其靶標(biāo)基因是否參與種子成熟調(diào)控進(jìn)行探究與分析，以期從種子貯藏蛋白積累層面為植物種子成熟調(diào)控機(jī)制提供理論依據(jù)與研究思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究使用的擬南芥突變體種子包括miR156基因家族的下調(diào)表達(dá) 突變體MIM156，SPL10過表達(dá)突變體CS66330、CS66332以及SPL11過表達(dá) 突變體CS66334、CS66335的種子均購買自ABRC種子庫。其中，下調(diào)突變體MIM156通過轉(zhuǎn)入人工合成的miR156相似序列片段獲得，該片段能與內(nèi)源miR156發(fā)生競爭性抑制反應(yīng)，進(jìn)而間接導(dǎo)致內(nèi)源miR156表達(dá)水平降低。SPL2ox-1和SPL2ox-2為本研究通過蘸花侵染法將SPL2基因成功轉(zhuǎn)入gus23擬南芥中純合的過表達(dá)株系。gus23由加拿大農(nóng)業(yè)部倫敦研究與開發(fā)中心崔玉海研究員實驗室惠贈。WT即擬南芥（Arɑbidopsis thɑliɑnɑ）Columbia型。

將野生型擬南芥WT及各種擬南芥突變體的種子在4 ℃黑暗環(huán)境下春化3 d，播于蛭石與草炭以1∶3比例混合的濕潤基質(zhì)中，隨后于22 ℃、16 h/8 h（光照/黑暗）條件下培養(yǎng)。

1.2 試驗方法

1.2.1 擬南芥不同組織部位RNA提取與cDNA獲得 采用OminiPlant RNA Kit（Dnase I）全能型植物RNA提取試劑盒對所采集擬南芥播種后生長14 d的幼苗、蓮座葉、花和果莢等組織進(jìn)行總RNA的提取，詳細(xì)步驟參考試劑盒說明書。反轉(zhuǎn)錄詳細(xì)步驟參照PrimeScript ? RT reagent Kitwith gDNA Eraser（Perfect Real Time）（TaKaRaBio.，Code No.RR047A）試劑盒說明書。

1.2.2 gus23背景下突變體材料獲取 分別將突變體（MIM156、CS66330、CS66332、CS66334和CS66335）與gus23的種子進(jìn)行春化、消毒并播種，待開花后選擇長勢好、花蕾茂盛的植株，除去早期幾個花蕾后，即可以擬南芥突變體為父本、gus23為母本進(jìn)行雜交。雜交時間選擇在7：00—8：00最佳，此時花粉活力最強(qiáng)，大大增加雜交的成功率。所獲得的種子經(jīng)草銨膦篩選并進(jìn)行陽性植株的PCR驗證，最終篩選出純合體用于GUS染色試驗。

1.2.3 GUS染色分析 將上述雜交后代的種子播種于添加草銨膦的MS培養(yǎng)基中，以gus23為對照播種到MS培養(yǎng)皿中，春化2～3 d，放入培養(yǎng)室中培養(yǎng)并分別收集14 d的幼苗，參照Tang等［28］方法染色，具體操作如下：將去根的幼苗放入配好的X-Glucsolution染色液中，真空抽氣10～15 min后置于37 ℃條件下染色16～20 h，隨后利用75%的乙醇37 ℃脫色1 d。最后，利用體式顯微鏡觀察并拍照。

1.2.4 基因表達(dá)分析 分別在TAIR網(wǎng)站（www.arabidopsis.org）和miRBase數(shù)據(jù)庫中獲取LEC1、ABI3、FUS3以及miR156ɑ-j的序列，利用PrimerSelect和EditSeq軟件設(shè)計熒光定量引物（表1），并用NCBI Primer Blast進(jìn)行引物的特異性比對。以擬南芥不同組織的cDNA為模板，采用SYBR Premix Ex Taq（Tli Rnase H Plus）（TaKaRaBio.，Code No.RR420A）進(jìn)行實時熒光定量（qRT-PCR）測定不同基因的相對表達(dá)量，應(yīng)用2-ΔΔCt方法進(jìn)行分析。每個樣品進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)，3次技術(shù)重復(fù)。

表1 引物序列信息Table 1 Primer sequences information

1.2.5 AtmiR156靶標(biāo)基因的預(yù)測與分析 使用psRNA Target程序（http://plantgrn.noble.org/psRNA Target/）對TAIR數(shù)據(jù)庫中擬南芥的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行miRNA靶標(biāo)預(yù)測。psRNA Target參數(shù)設(shè)置為默認(rèn)值。從TAIR網(wǎng)站中獲取SPL基因家族成員在野生型擬南芥不同發(fā)育時期的胚組織中的表達(dá)水平相關(guān)信息及基因序列信息，分別運(yùn)用GraphPad Prism 6和MEGA5.02軟件對SPL基因家族成員進(jìn)行表達(dá)水平與進(jìn)化樹分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 miR156可能參與種子成熟調(diào)控過程

為在種子貯藏蛋白積累層面探究miR156是否參與調(diào)控種子成熟過程，以來自加拿大農(nóng)業(yè)部倫敦研究與開發(fā)中心崔玉海研究員實驗室的擬南芥gus23突變體（βCG:GUS的異位表達(dá)）為母本，與miR156下調(diào)突變體MIM156進(jìn)行雜交，利用獲得的雜交后代進(jìn)一步GUS染色。gus23突變體gus23具有β-葡萄糖苷酸酶（GUS）蛋白構(gòu)建大豆種子貯藏蛋白基因（SSPs，Seed Storage Proteins）的報告基因體系，正常情況下GUS基因只在種子中表達(dá)，而在幼苗中有一些種子成熟抑制因子存在，所以GUS不能表達(dá)。當(dāng)幼苗中的種子成熟抑制因子功能缺失或正向的種子成熟調(diào)控基因異位表達(dá)后，幼苗葉片便會具有GUS表型。如圖1A所示，以14 d苗齡的擬南芥gus23突變體為對照，經(jīng)X-Glucsolution染色后，所有MIM156-gus23株系中，幼苗真葉呈現(xiàn)出GUS表型，說明種子貯藏蛋白基因在此葉片中得到了異位表達(dá)，而調(diào)控該基因表達(dá)的極有可能就是miR156。由此可推測，miR156負(fù)向調(diào)控種子貯藏蛋白基因的表達(dá)。

根據(jù)前人報道，LEC1、ABI3和FUS3是調(diào)控種子成熟的關(guān)鍵因子，在種子成熟過程中起至關(guān)重要的作用。為進(jìn)一步驗證miR156對種子成熟過程的調(diào)控，本研究選取開花后7 d的擬南芥果莢材料，采用（qRT-PCR）技術(shù)對基因LEC1、ABI3和FUS3進(jìn)行表達(dá)量的測定，此時期果莢內(nèi)的種子中各種貯藏物質(zhì)開始合成。結(jié)果表明，以野生型擬南芥WT為對照，MIM156下調(diào)表達(dá)突變體中LEC1、ABI3和FUS3的表達(dá)水平均有不同程度升高，且與WT存在極顯著差異（圖1B），說明miR156確實可以調(diào)控種子成熟過程。

圖1 MIM156-gus23的GUS表型分析及種子成熟關(guān)鍵調(diào)控基因的表達(dá)分析Fig.1 Analysis of GUS phenotype in MIM156-gus23 and expression of key genes during seed maturation

2.2 影響種子發(fā)育的miR156家族成員的鑒定

擬南芥miR156基因家族共有10個成員，分別為miR156ɑ～j，為確定是哪個成員對擬南芥種子發(fā)育產(chǎn)生影響、探明這些miR156在不同組中發(fā)揮的作用，本研究收集野生型擬南芥4個組織材料，分別為播種后14 d的幼苗、果莢、花和蓮座葉，并采用實時熒光定量技術(shù)對不同miR156家族成員進(jìn)行組織表達(dá)特異性分析，結(jié)果見圖2。以14 d幼苗的表達(dá)量為參照，miR156ɑ、miR156d、miR156e和miR156j在果莢中的表達(dá)量最高，最低為幼苗表達(dá)量的20倍，最高可達(dá)7 000倍；miR156b、miR156h、miR156i在花中表達(dá)量最高，分別約為幼苗表達(dá)量的2.5、301.1和25.9倍，而miR156c則是在幼苗中的表達(dá)量最高；此外，沒有檢測到miR156f和miR156g。上述結(jié)果表明，miR156家族中大部分成員在擬南芥的果莢和花中有較高表達(dá)，特別是果莢中，miR156可能調(diào)控擬南芥種子的發(fā)育過程，此外miR156c在幼苗期有較高表達(dá)，說明其可能抑制與種子發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)。

圖2 擬南芥miR156基因家族在不同組織部位中的相對表達(dá)量分析Fig.2 Relative expression analysis of miR156 gene family in different tissues of Arabidopsis

2.3 miR156靶標(biāo)基因的生物信息學(xué)分析

為進(jìn)一步研究miR156家族的生物學(xué)功能，本試驗采用psRNA Target程序?qū)AIR數(shù)據(jù)庫中擬南芥的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行miR156靶標(biāo)基因的預(yù)測，共鑒定到10個SPL基因（圖3A），分別為SPL2、SPL3、SPL4、SPL5、SPL9、SPL10、SPL11、SPL13（A和B）和SPL15。從圖3A可以看出，miR156與上述SPL基因的序列能夠較為完美的匹配，僅個別堿基存在錯配現(xiàn)象，非常符合植物中miRNA與其靶標(biāo)基因的序列匹配原則。

圖3 擬南芥miR156靶基因的預(yù)測、表達(dá)模式和系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.3 Analysis of miR156 target genes on prediction,expression patterns and phylogenetics in Arabidopsis

利用TAIR網(wǎng)站查詢上述10個SPL基因在野生型擬南芥不同胚胎發(fā)育時期的表達(dá)量水平，分析結(jié)果見圖3B，自胚的八分體時期起發(fā)育至完全成熟綠胚的8個階段中，大部分SPL基因能夠展現(xiàn)不同程度的特異性表達(dá)，其中，SPL2、SPL10和SPL11的表達(dá)量較高，尤其是SPL2和SPL10。在八分體時期，SPL10的表達(dá)水平最高、達(dá)4.36，為同一發(fā)育時期SPL13A表達(dá)量的62倍，其次是SPL2、表達(dá)量為3.97（圖3B）。在球型胚、早期心型胚、晚期心型胚和早期魚雷型胚時期，SPL2的表達(dá)量均最高，隨后的胚發(fā)育過程中，其表達(dá)量逐漸降低。在胚發(fā)育整個過程中，SPL3、SPL4、SPL5、SPL9和SPL15的表達(dá)量極低甚至在前期SPL4根本不表達(dá)。綜上，miR156可能通過靶標(biāo)SPL2、SPL10和SPL11調(diào)控種子的發(fā)育過程。

為研究miR156靶標(biāo)基因間的進(jìn)化關(guān)系，本研究進(jìn)行了10個SPL基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，結(jié)果表明，與表達(dá)模式相似，SPL3/4/5、SPL2/10/11以及SPL9/15分別被劃分到三組，如圖3C，在胚發(fā)育時期具有較高表達(dá)量的SPL2、SPL10和SPL11的親緣關(guān)系最近，在進(jìn)化上最為相似，說明它們可能發(fā)揮相同的生物調(diào)控作用。

2.4 miR156介導(dǎo)SPL2、SPL10和SPL11調(diào)控種子成熟過程

鑒于SPL2、SPL10和SPL11在種子胚發(fā)育過程中具有較高的表達(dá)量，且親源關(guān)系很近，我們將這3個SPL基因作為miR156靶標(biāo)基因重點探究其對植物種子發(fā)育的影響。本研究對SPL2進(jìn)行克隆并利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法創(chuàng)制了gus23背景下的SPL2ox過表達(dá)突變體材料，從中挑選2個株系進(jìn)行GUS染色分析，經(jīng)染色后發(fā)現(xiàn)SPL2-ox-1和SPL2-ox-2的子葉呈藍(lán)色（圖4）。將CS66330、CS66332、CS66334和CS66335與gus23的雜交后代分別進(jìn)行染色，結(jié)果顯示，所有雜交后代均能顯現(xiàn)出GUS表型，但組織部位略有差異，其中，CS66330和CS66335在新發(fā)葉上有藍(lán)色GUS表型，CS66332的GUS表型集中于真葉上，CS66334則在子葉和新發(fā)葉上均表現(xiàn)異位的GUS活性（圖4）。種子貯藏蛋白基因在幼苗中得到表達(dá)，即SPL2、SPL10和SPL11基因的過表達(dá)影響種子貯藏蛋白基因的表達(dá)。

圖4 擬南芥AtSPL2ox、AtSPL10ox-gus23和AtSPL11ox-gus23突變體中GUS表型分析Fig.4 GUS phenotypic analysis of AtSPL2ox,AtSPL10oxgus23 and AtSPL11ox-gus23 mutants of Arabidopsis

SPL2、SPL10和SPL11作為miR156的靶標(biāo)基因，受miR156的切割而與miR156呈負(fù)調(diào)控關(guān)系。miR156下調(diào)表達(dá)突變體MIM156以及靶標(biāo)基因SPL2、SPL10和SPL11的GUS染色結(jié)果顯示，miR156的下調(diào)表達(dá)及上述SPLs的過表達(dá)均可影響種子貯藏蛋白基因的表達(dá)，由此形成了一條miR156調(diào)控種子成熟的調(diào)控途徑，即擬南芥miR156通過調(diào)控SPL2、SPL10和SPL11影響種子貯藏蛋白的表達(dá)從而影響種子成熟過程。

3 討論

種子是植物生長發(fā)育的基礎(chǔ)，也是重要的農(nóng)業(yè)資源，目前我國種業(yè)發(fā)展處于瓶頸期，挖掘種子發(fā)育和成熟過程中的關(guān)鍵基因及其調(diào)控機(jī)制具有重要意義。大量研究報道表明，miR156作為保守的miRNA家族，在植物種子的胚形態(tài)建成、休眠和萌發(fā)等生物過程中發(fā)揮了重要作用，而其在植物種子成熟過程中的調(diào)控機(jī)制未見報道，為此，本研究選用擬南芥miR156下調(diào)突變體MIM156為父本與種子貯藏蛋白基因啟動子驅(qū)動GUS報告基因的檢測體系（gus23）進(jìn)行雜交，以其雜交后代14 d幼苗為試驗材料進(jìn)行GUS表型分析。如miR156參與種子成熟的正向調(diào)控，則在gus23檢測體系中過表達(dá)時，可能促使GUS和SSPs在幼苗中異位表達(dá)；如果參與種子成熟的負(fù)向調(diào)控，則在gus23檢測體系中功能缺失時會表現(xiàn)出相似結(jié)果。本研究結(jié)果中，MIM156是miR156的下調(diào)表達(dá)突變體，且在葉片中表現(xiàn)出藍(lán)色GUS活性，證明了miR156的表達(dá)量降低能夠促進(jìn)SSPs基因的異位表達(dá)，從而負(fù)向參與種子的成熟過程。已知調(diào)控擬南芥種子發(fā)育的3個重要因子為LEC1、ABI3和FUS3，其在種子發(fā)育的許多階段起重要作用。關(guān)于LEC1、ABI3和FUS3調(diào)控擬南芥種子發(fā)育已有相關(guān)報道詳細(xì)闡述其可能的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)［29-30］，然而，對于該調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的激活因子尚不明確。分析qRT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)，此3個基因在果莢中表達(dá)量顯著上調(diào)，這為miR156作為LEC1、ABI3和FUS3調(diào)控擬南芥種子發(fā)育的激活因子提供了有力證據(jù)。

基因家族各成員在不同組織中表達(dá)量差異的測定，常用來分析基因家族在某一生物過程中的主效基因，近年來應(yīng)用十分廣泛。最新研究通過分析鷹嘴豆各組織中miR156各成員表達(dá)量差異，進(jìn)而推斷miR156基因家族的表達(dá)模式的相關(guān)論述［31］。本研究通過對擬南芥播種后14 d的幼苗、果莢、花和蓮座葉中miR156家族個成員的表達(dá)量分析，發(fā)現(xiàn)miR156ɑ、miR156d、miR156e和miR156j在果莢中的表達(dá)量最高，其中最高的miR156e，其表達(dá)量為在幼苗中的7 000倍，充分證明miR156e在擬南芥種子發(fā)育過程中起主要調(diào)控作用。同時發(fā)現(xiàn)miR156c在幼苗中的表達(dá)量最高，表明其可能對種子發(fā)育起抑制作用。由此推斷miR156家族在擬南芥種子發(fā)育過程中可能具有雙向調(diào)控的復(fù)雜系統(tǒng)。

miR156的靶標(biāo)為SPL基因家族已被公認(rèn)，但在調(diào)控種子萌發(fā)過程中，miR156是否同樣通過調(diào)控SPL基因家族發(fā)揮作用，目前還未見相關(guān)報道。本研究利用psRNATarget程序進(jìn)行靶標(biāo)預(yù)測，篩選出10個SPL靶基因，再通過TAIR網(wǎng)站上獲取擬南芥種子發(fā)育各個階段的表達(dá)量進(jìn)行分析，研究發(fā)現(xiàn)果莢中表達(dá)量較高的3個基因分別是SPL2、SPL10和SPL11。進(jìn)而通過對SPL基因家族系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹的分析，結(jié)果顯示SPL2、SPL10和SPL11聚類在同一組中。相似地，在前人研究中，同樣證明了SPL10和SPL11的氨基酸相似性高達(dá)78%［32］，且在對SPL2、SPL10和SPL11的研究中，發(fā)現(xiàn)三者N-末端有3個保守結(jié)構(gòu)域，一個是轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域：AHA-like motif［33］，另兩個分別是絲氨酸富集結(jié)構(gòu)域和功能未知RTYF結(jié)構(gòu)域，三者都是保守蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，說明這些蛋白在植物生長發(fā)育過程中具有重要作用［34］，而這3個SPLs基因的功能極有可能存在較高相似性。綜上，可推測miR156可能是通過調(diào)控SPL2、SPL10和SPL11的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控種子發(fā)育和成熟過程。

為驗證SPLs基因?qū)ΨN子成熟過程中的作用，本研究采用gus23檢測體系進(jìn)一步檢測，結(jié)果顯示CS66330和CS66335在新發(fā)葉上有藍(lán)色GUS表型，CS66332在真葉上出現(xiàn)GUS表型，CS66334則在子葉和新發(fā)葉上均表現(xiàn)出異位的GUS活性，研究結(jié)果充分證明SPL2、SPL10、SPL11對種子貯藏蛋白起正向調(diào)控作用，鑒于miR156負(fù)向調(diào)控種子成熟過程及靶標(biāo)SPL基因家族，可以推測該調(diào)控網(wǎng)絡(luò)為miR156通過調(diào)控SPL2、SPL10、SPL11基因的表達(dá)，進(jìn)而作用于LEC1、ABI3和FUS3調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，再由該調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)一步控制種子貯藏蛋白基因的表達(dá)，從而影響種子的發(fā)育與成熟。

本文通過對miR156與其靶基因SPL2、SPL10、SPL11的相關(guān)研究，揭示了由miR156調(diào)控擬南芥種子發(fā)育和成熟過程中可能的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。但是對于SPL2、SPL10、SPL11基因如何將功能作用于LEC1、ABI3和FUS3調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，目前的研究尚不能解決此問題，還需要進(jìn)一步試驗，將這一過程的調(diào)控機(jī)制闡明和完善。

4 結(jié)論

本研究利用前期研究建立的報告基因篩選體系，對miR156下調(diào)突變體進(jìn)行了GUS表型分析，表明14 dMIM156-gus23的幼苗中真葉均存在GUS活性，說明miR156基因的下調(diào)表達(dá)激活了SSPs基因的異位表達(dá)，且與種子成熟過程呈負(fù)向調(diào)控關(guān)系。為進(jìn)一步驗證這一結(jié)果，本研究對種子成熟過程中的關(guān)鍵調(diào)控基因LEC1、ABI3和FUS3在MIM156中進(jìn)行表達(dá)分析，結(jié)果顯示miR156的下調(diào)表達(dá)影響了這些基因在種苗中的表達(dá)情況，且與野生型擬南芥相比，LEC1、ABI3和FUS3的表達(dá)豐度顯著升高，同樣證實了miR156參與調(diào)控種子成熟過程。進(jìn)一步通過生物信息學(xué)的分析及GUS表型分析，結(jié)果表明miR156的靶標(biāo)基因SPL2、SPL10和SPL11正向調(diào)控種子貯藏蛋白基因的異位表達(dá)。綜上所述，本研究推測miR156極有可能作為重要調(diào)控因子作用于其靶標(biāo)基因SPL2、SPL10和SPL11通過影響種子貯藏蛋白基因SSPs的表達(dá)從而對種子成熟過程進(jìn)行調(diào)控。