不同生境下長(zhǎng)梗韭生物學(xué)特性及遺傳差異研究

趙 露，董恬雅，張社歡，劉桂霞

（河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北保定 071002）

長(zhǎng)梗韭[Allium neriniflorum（Herb.）G.Don]，蔥屬多年生草本植物，生長(zhǎng)于黑龍江、吉林、遼寧、河北、山西、山東、內(nèi)蒙古、北京等地的山坡、濕地、草地或海邊沙地[1]；長(zhǎng)梗韭不具蔥蒜味，胚珠數(shù)多，花被片下部靠合，鱗莖球狀或近球狀，單生，開紫花，花色艷麗，是園林造景中花境的好材料，植于石旁更具情趣。它是一類集菜用、調(diào)味、藥用、保健、飼用和防風(fēng)固沙為一體的多功能野菜植物[2]。野生蔥屬植物是重要的蔬菜植物，在民間，人們將嫩葉和鱗莖作涼拌菜、餡或湯食用，甚至花序也用作調(diào)制食物[3]。長(zhǎng)梗韭含抗壞血酸（ascorbic acid），《蒙植藥志》記載，其鱗莖味辛、苦，性溫，有通陽(yáng)散結(jié)、下氣之效，可用于胸悶刺痛、心絞痛、瀉痢后重、慢性氣管炎、咳嗽痰多等病癥的治療，鮮品可解河豚中毒。長(zhǎng)梗韭又有消腫散瘀之功效，可用于治療跌打損傷、瘀血疼痛、腫脹、閃傷、扭傷[4]。

長(zhǎng)梗韭富含多種營(yíng)養(yǎng)元素，同時(shí)富含粗纖維。此外，長(zhǎng)梗韭還有溫中行氣、散血解毒、保暖、健胃整腸等功效。長(zhǎng)梗韭的觀賞、食用及藥用價(jià)值較高，但野生資源量在下降。目前，對(duì)長(zhǎng)梗韭保護(hù)和開發(fā)利用的力度不夠，與其相關(guān)的研究十分缺乏且大多集中于染色體方面[5]。從野生長(zhǎng)梗韭染色體數(shù)目和形態(tài)方面研究其分類學(xué)意義，認(rèn)為將長(zhǎng)梗韭放在蔥屬合被組中更為合理[6]；通過引種栽培發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)梗韭為二倍體2n-x2-16，其染色體帶有1 對(duì)中間隨體[7]；也有研究討論了隨體染色體的數(shù)目、形態(tài)變異及雜合現(xiàn)象在蔥屬進(jìn)化中的作用，認(rèn)為隨體染色體形態(tài)變異及雜合現(xiàn)象的出現(xiàn)是蔥屬中遺傳變異的重要源泉之一[8]。當(dāng)前對(duì)有關(guān)野生長(zhǎng)梗韭種質(zhì)資源和遺傳多樣性的研究還非常欠缺。

ISSR 是一種雙親遺傳的核基因組分子標(biāo)記技術(shù)，操作簡(jiǎn)單快速，擴(kuò)增特異性強(qiáng)，重復(fù)性好，能夠檢測(cè)到更多的變異位點(diǎn)等，且無需預(yù)知基因組序列信息，減少了多態(tài)性分析的預(yù)備工作。因此，這一分子標(biāo)記被越來越廣泛地應(yīng)用在研究瀕危珍稀物種的遺傳多樣性中[9-12]，真實(shí)地反映不同地理種群的遺傳多樣性、遺傳結(jié)構(gòu)及種群之間的基因交流情況[12]。

為了合理地評(píng)估野生長(zhǎng)梗韭的遺傳多樣性及其遺傳結(jié)構(gòu)狀況，并為該物種的保護(hù)提供參考依據(jù)，本研究采用ISSR 分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)來自不同生境，分別是易縣林下耐陰環(huán)境和張家口草原干旱環(huán)境生長(zhǎng)的長(zhǎng)梗韭，進(jìn)行了生物學(xué)特性和遺傳多樣性方面的研究，分析長(zhǎng)梗韭對(duì)不同環(huán)境的適應(yīng)性，以期為長(zhǎng)梗韭資源的保護(hù)和開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料

本研究所用材料取自野生的長(zhǎng)梗韭，共用27 個(gè)樣品，其中：易縣樣本16 個(gè)，取自河北省保定市易縣千佛山林下，均為新長(zhǎng)出的嫩葉；張家口樣本11 個(gè)，取自河北省張家口市塞北管理區(qū)干旱草地，也均是新長(zhǎng)出的嫩葉。

圖1 河北壩上典型草原長(zhǎng)梗韭（花期）

圖2 張家口壩上長(zhǎng)梗韭（花期）

2 方法

2.1 野外考察

2014 年7－10 月底到河北省張家口和易縣進(jìn)行野外考察，觀察野生長(zhǎng)梗韭的野外生長(zhǎng)情況，記錄整理長(zhǎng)梗韭的生物學(xué)特性值，并采集不同生境的材料用于遺傳差異分析。

2.2 ISSR 遺傳多樣性分析

2.2.1 基因組DNA 的提取。用試劑盒提取基因組DNA，將得到的樣品于冰箱-20℃的環(huán)境下保存?zhèn)溆谩Ｍ瑫r(shí)，為了得到非常直觀的效果，用1%的瓊脂糖電泳檢測(cè)DNA 的質(zhì)量；為了得到十分確切的DNA 濃度，用紫外分光光度計(jì)測(cè)量DNA 的OD 值。

2.2.2 ISSR 引物的選取。為了保證試驗(yàn)進(jìn)行的完整性，引物應(yīng)不止1 種，選取所需ISSR 引物，并請(qǐng)生物公司合成，表1 為所合成的引物。

表1 ISSR 引物

2.2.3 PCR 擴(kuò)增。按試驗(yàn)的退火溫度確定合適的PCR擴(kuò)增程序。按10mL 反應(yīng)體積，對(duì)模板DNA、Taq 酶、dNTP 和引物劑量分別進(jìn)行優(yōu)化篩選。經(jīng)多次試驗(yàn)比較，PCR 反應(yīng)最優(yōu)體系見表2（加超純水至10μL）。

表2 PCR 反應(yīng)最優(yōu)體系（10μL）

為了獲得最佳反應(yīng)體系，在PCR 儀上對(duì)Mg2+濃度、dNTPs 濃度、引物濃度、TaqDNA 聚合酶單位數(shù)進(jìn)行試驗(yàn)篩選。體系優(yōu)化選用引物為ISSR-3（CCAGTGGTGGTGGTG），依照擴(kuò)增條帶強(qiáng)弱、主帶是否清晰與雜帶多少判斷體系的優(yōu)劣。擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5min；94℃變性1min；45℃復(fù)性1min；72℃延伸1.5min，35 個(gè)循環(huán)；72℃延伸15min。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，將擴(kuò)增產(chǎn)物在含有溴化乙錠（EB）的3%瓊脂糖凝膠中電泳分離，DNA 分子量標(biāo)記為DL 2000，以5V/cm 的電壓電泳1.5h。電泳結(jié)束后，在紫外分析儀上觀察擴(kuò)增條帶。

2.2.4 ISSR-PCR 產(chǎn)物的檢測(cè)。ISSR-PCR 產(chǎn)物在3%瓊脂糖凝膠上電泳80min，電壓設(shè)定為100V，用EB 顯色，凝膠成像儀拍照記錄。

3 結(jié)果與分析

3.1 野外考察結(jié)果與分析

野外觀察測(cè)量2 種生境長(zhǎng)梗韭的一些生物學(xué)特性值。由表3 分析可知，2 種長(zhǎng)梗韭的生物學(xué)特性差異較大，尤其是花期、花色、花葶高度和葉片長(zhǎng)度，都發(fā)生了顯著變化。因此，初步確定同一物種在不同的生境下發(fā)生了形態(tài)上的變化。有研究者對(duì)長(zhǎng)梗韭進(jìn)行引種栽培，第1 年取原產(chǎn)地生長(zhǎng)的鱗莖所發(fā)的根尖觀察，發(fā)現(xiàn)隨體染色體無任何雜合現(xiàn)象；第2 年取在新環(huán)境下生長(zhǎng)的鱗莖所發(fā)的根尖觀察，發(fā)現(xiàn)隨體染色體首先作出反應(yīng)，發(fā)生變異產(chǎn)生了雜合，這是由自然條件發(fā)生了較大的變化而造成的[9]。事實(shí)上，植物種內(nèi)不同種群的差異大多由基因控制，基因?qū)π誀畹目刂破鹬鴽Q定性的作用，因此從分子水平研究遺傳多態(tài)性是否發(fā)生了變化更為可靠[13]。

表3 長(zhǎng)梗韭各項(xiàng)生物學(xué)特性數(shù)值

3.2 ISSR 遺傳多樣性分析

3.2.1 試劑盒提取的基因組DNA 的電泳結(jié)果與分析。①經(jīng)DNA 的凝膠電泳檢測(cè)顯示，點(diǎn)樣孔不發(fā)亮，DNA主帶清晰，無彌散帶，無明顯的RNA 帶，說明質(zhì)量較高。②通過紫外分光光度計(jì)測(cè)量OD 值來測(cè)量提取的DNA 樣品濃度，26 個(gè)樣品中，DNA 濃度較為均一，在3～5mg/uL 之間。因?yàn)闈舛容^高，所以需要稀釋100 倍左右作為模板進(jìn)行PCR。

3.2.2 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果與分析。通過引物優(yōu)化，從50 個(gè)引物中篩選出12 條擴(kuò)增條帶較多、信號(hào)較強(qiáng)、背景清晰的引物用于2 個(gè)長(zhǎng)梗韭群體DNA 樣品的擴(kuò)增。通過PCR 擴(kuò)增，獲得了70 條強(qiáng)度和清晰度均較好的條帶，每條單引物平均擴(kuò)增條帶數(shù)達(dá)6 條。擴(kuò)增條帶數(shù)和多態(tài)位點(diǎn)百分率在12 個(gè)引物中存在顯著差異。這些引物的擴(kuò)增片斷大小范圍在250～2000bp 之間。引物ISSR-3 在2 個(gè)長(zhǎng)梗韭群體部分樣品中的擴(kuò)增電泳圖譜見圖3。如圖3 中箭頭所示，引物ISSR-3 共擴(kuò)增到9 條主帶，其中4 個(gè)條帶表現(xiàn)為多態(tài)性。

圖3 ISSR-3 引物對(duì)部分長(zhǎng)梗韭樣品的擴(kuò)增結(jié)果

3.2.3 長(zhǎng)梗韭遺傳差異分析。供試材料遺傳差異性分析結(jié)果如圖3 所示，根據(jù)條帶特異性不同，可知因?yàn)樯姝h(huán)境的不同，生活在壩上干旱草地的和生活在易縣林下的長(zhǎng)梗韭遺傳基因已經(jīng)發(fā)生了變化，這種基因改變是否有利于其更好地適應(yīng)環(huán)境有待進(jìn)一步探究。因此，可通過POPGENE 軟件對(duì)2 種生境長(zhǎng)梗韭遺傳變異進(jìn)行分析。

經(jīng)POPGENE 軟件分析，易縣長(zhǎng)梗韭和張家口長(zhǎng)梗韭2 個(gè)群體及其兩群體整體水平的遺傳多樣性指數(shù)見表4。分析可知，易縣長(zhǎng)梗韭的遺傳多樣性水平與張家口長(zhǎng)梗韭的遺傳多樣性水平不一樣，生境不同群落的遺傳多樣性發(fā)生了改變。

表4 2 個(gè)長(zhǎng)梗韭群體的遺傳多樣性分析

如表5 所示，通過總基因多樣性（Ht）和群體內(nèi)基因多樣性（Hs）計(jì)算得到兩群體之間的基因分化系數(shù)Gst 為0.517，表明遺傳變異存在于種群內(nèi)，群體間的遺傳變異較大。經(jīng)群體遺傳分化分析，群體之間的Nm=0.4791＜1，說明易縣長(zhǎng)梗韭和張家口長(zhǎng)梗韭之間由于遺傳漂變而發(fā)生了分化。因此，可以斷定2 個(gè)種群間遺傳多樣性與環(huán)境有關(guān)，2 個(gè)生境的長(zhǎng)梗韭基因發(fā)生了變化，同時(shí)在基因的表達(dá)過程中也發(fā)生了改變。

表5 2 個(gè)長(zhǎng)梗韭群體基因多樣性Nei’s 分析

4 討論

4.1 長(zhǎng)梗韭ISSR 反應(yīng)體系的優(yōu)化

有研究認(rèn)為，為了獲得重復(fù)性和可靠性較高的ISSR 譜帶，并提高分析的準(zhǔn)確性，對(duì)不同試驗(yàn)條件下的ISSR-PCR 反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化是必要的[14]。應(yīng)用ISSR 技術(shù)研究植物遺傳差異需要進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，篩選出較穩(wěn)定的ISSR-PCR 的反應(yīng)體系。在優(yōu)化體系初始過程中，我們采用多次單因素設(shè)計(jì)的方法，因多種因素影響，試驗(yàn)周期較長(zhǎng)，做了大量的PCR 擴(kuò)增，工作效率較低。另一種方法可采用數(shù)學(xué)分析，因?yàn)橛?jì)算較為復(fù)雜并且影響因素較多，難以較快實(shí)施，2 種方法都需要進(jìn)一步優(yōu)化。

4.2 遺傳差異性分析意義

遺傳差異性對(duì)一個(gè)物種適應(yīng)環(huán)境變化長(zhǎng)期生存繁衍至關(guān)重要。為了合理制定瀕危物種的保護(hù)管理策略，應(yīng)對(duì)種群內(nèi)和種群間遺傳差異有較清晰的認(rèn)識(shí)[15]。本試驗(yàn)中的基因分化系數(shù)Gst 為0.5107，表明2 種生境長(zhǎng)梗韭種群的遺傳結(jié)構(gòu)水平較低，這也表明群體間的遺傳變異占總體遺傳變異的相當(dāng)比例。因而，可以推測(cè)認(rèn)為，為了適應(yīng)環(huán)境的需求，不同群體的長(zhǎng)梗韭的基因發(fā)生了改變。通過基因分化系數(shù)（Gst）推導(dǎo)出長(zhǎng)梗韭群體之間每代遷移個(gè)體數(shù)（Nm）僅有0.4791，較低的Nm可能反映了這2 個(gè)長(zhǎng)梗韭種群在歷史上沒發(fā)生過基因交流。因此，保護(hù)長(zhǎng)梗韭需要盡可能地保護(hù)不同生境下的有效種群，這樣才能保護(hù)這個(gè)物種的遺傳多樣性。

本研究進(jìn)行的ISSR 遺傳變異分析表明兩群體的種群分化水平較高而基因流水平較低，兩地長(zhǎng)梗韭在遺傳上差異較大。試驗(yàn)結(jié)果與杭焱等[10]的研究結(jié)論一致，表明ISSR 技術(shù)能應(yīng)用于不同地理種群的遺傳多樣性、遺傳結(jié)構(gòu)及種群之間的基因交流情況方面的研究。長(zhǎng)梗韭為研究較少的野生種，在2 種完全不同的生境中仍然能很好地生存，可以對(duì)此2 種生境的個(gè)體進(jìn)行基因測(cè)序，從基因的水平更好地研究植物抗旱耐濕的機(jī)制，這對(duì)我們將野生種的優(yōu)勢(shì)利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)轉(zhuǎn)到傳統(tǒng)種植作物上有很大的幫助。同時(shí)，長(zhǎng)梗韭作為野菜和藥用資源，研究其遺傳差異性，可為長(zhǎng)梗韭保護(hù)方案提出合理性建議，為長(zhǎng)梗韭品種改良與種質(zhì)資源創(chuàng)新提供依據(jù)，有助于了解物種的遺傳分化機(jī)制，對(duì)保護(hù)并進(jìn)一步合理利用長(zhǎng)梗韭資源具有重要理論意義與實(shí)踐價(jià)值。