葉黃素納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的制備與表征

孫清瑞，申哲偉，李晶，趙雪龍，郝冬雪

（黑龍江八一農(nóng)墾大學食品學院，大慶 163319）

葉黃素是一種重要的具有多種生理活性的含氧類胡蘿卜素，其具有降低多種慢性疾病的發(fā)病風險的功效。其生理活性主要有防治因老年黃斑變性病引起的視力下降與失明、抗氧化、抗癌、抗誘變、延緩動脈硬化等作用[1-4]。因其分子含18 個碳原子的共軛長鏈和位于兩側(cè)的兩個不同的紫羅酮環(huán)，葉黃素易受光、熱、氧及加工條件的影響而降解，此外，其還具有水分散性差和生物利用度低的缺陷，從而限制了其應用范圍[3]。

近年來，納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體（Nanostructured Lipid Carriers，NLC）作為一種包埋食品功能成分的技術(shù)，已引起越來越多的關(guān)注[5-9]。作為在固體脂質(zhì)納米?；A(chǔ)上發(fā)展而來的新一代載運技術(shù)，納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體是以液體脂質(zhì)部分地取代固體脂質(zhì)，這樣其固體脂質(zhì)中大量的無序晶格可更多地容納生物活性物質(zhì)[10-12]。NLC 技術(shù)具有生物相容性好、生物利用度高、物理穩(wěn)定性高、良好緩釋特性及易于規(guī)?；a(chǎn)的優(yōu)點[8]，從而該技術(shù)在載運功能性食品成分方面極具應用前景。目前，食品領(lǐng)域的納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體相關(guān)文獻報道主要集中在運載β-胡蘿卜素、DHA、輔酶Q10、姜黃素、蝦青素、番茄紅素。這些被脂質(zhì)包埋的活性成分都具有生物利用度較低，水分散性及穩(wěn)定性較差的共同特點。通過納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體技術(shù)可提高這些活性成分的生物利用度、水分散性及理化穩(wěn)定性。因此，研究通過葉黃素納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體（L-NLC）包埋技術(shù)的研究，以期提高葉黃素的水分散性和生物利用度。

目前，國內(nèi)尚未見有關(guān)葉黃素納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體（L-NLC）的報道。研究旨在為L-NLC 工業(yè)化生產(chǎn)提供前期的理論和技術(shù)參考，這對拓寬葉黃素在功能性食品等領(lǐng)域的應用具有十分重要的意義。

1 材料與設(shè)備

1.1 主要材料與試劑

葉黃素原料（純度92%），華北制藥股份有限公司；葉黃素標品（貨號X6250），Sigma-Aldrich 公司；分析純試劑正己烷、無水乙醇、丙酮、化學純試劑吐溫80，國藥集團化學試劑有限公司；山崳酸甘油酯（ATO），嘉法獅有限公司；辛癸酸甘三酯（MCT），上海通用藥業(yè)有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

Zetasizer Nano-ZS90 型激光粒度儀，英國Malvern 公司；Dimension Icon 型掃描探針顯微鏡（AFM），美國Bruker 公司；D8 型X-射線衍射儀（XRD），Bruker AXS（德國）有限公司；IS10 型傅立葉變換紅外光譜儀，Nicolet（美國）公司；LabRAM HR Evolution 型共聚焦顯微拉曼光譜儀，Horiba Jobin Yvon（法國）公司；UV765 型紫外-可見分光光度計，上海儀電分析儀器有限公司。

DF-101S 型集熱磁力攪拌器，常州金壇良友儀器有限公司；TGL-16M 型離心機，湘儀離心機儀器有限公司；Alpha 1-2 LD plus 型冷凍干燥機，德國CHRIT 公司；FS450N 超聲波細胞破碎儀：上海生析超聲儀器有限公司。

2 試驗方法

2.1 葉黃素納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的制備

在預試驗的基礎(chǔ)上，葉黃素納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的制備采用溶劑擴散-超聲分散聯(lián)用法：首先，在回流裝置中，于磁力攪拌條件下，基于100 mL 質(zhì)量分數(shù)為2%的吐溫80 水溶液，將一定量的固體脂質(zhì)ATO、葉黃素、液體脂質(zhì)MCT 及5 mL 無水乙醇加熱回流（75 ℃，10 min），使其呈均一相；然后，快速加入100 mL 同溫的質(zhì)量濃度為2%的吐溫80 水溶液，磁力攪拌（200 r·min-1）5 min，再經(jīng)超聲分散（超聲功率350 W，脈沖為每運行20 s 間歇5 s）5 min；最后，用冰水浴將其迅速冷卻至室溫，得到L-NLC 溶液，置于冰箱（4 ℃），備測。

2.2 包封率、有效載量的測定

葉黃素總含量的測定采用丙酮增溶法[13-14]。取適量葉黃素納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體（L-NLC）放入10 mL 刻度試管中，加入1 mL 丙酮，漩渦震蕩1 min，用丙酮定容至10 mL。同法以空白-NLC 為對照，用紫外-可見光分光光度計測定其波長440 nm 下的吸光值并計算葉黃素含量。葉黃素含量測定的標準曲線方程為y=0.229 73 x-0.032 67。其中，y 為吸光值；x 為試樣的濃度，μg·mL-1；線性范圍為0.5～4.5 μg·mL-1，R2=0.996 89。同條件下試樣平行測定3 次，取其算數(shù)平均值。

游離葉黃素的測定采用改進的有機溶劑萃取法[14-15]。取適量L-NLC 放入15 mL 刻度試管中，加入1 mL 正己烷，漩渦震蕩1 min，離心（5 000 r·min-1）2 min，取上層正己烷萃取液。重復萃取2 次，合并正己烷萃取液，再用正己烷定容至10 mL。用紫外—可見分光光度法測游離葉黃素含量。標準曲線方程為y=0.254 57 x+0.008 71，其中，y 為440 nm 處吸光值；x為試樣的濃度，μg·mL-1；線性范圍為0.5～4.5 μg·mL-1，R2=0.996 05。同條件下的試樣平行測定3 次，取其算數(shù)平均值。

包封率、載量及有效載量分別按公式（1）、（2）和（3）計算。

2.3 粒徑的測定

首先，用去離子水稀釋葉黃素納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體（L-NLC）試樣至適當倍數(shù)。接著將稀釋后的試樣置于聚苯乙烯比色皿（折光指數(shù)1.33）中，在（25±0.1）℃恒溫3 min，用配有He/Ne 激光器（λ=633 nm）的Nano-ZS90 粒徑分析儀測定粒徑（散射角為90 °），記錄平均粒徑和多分散指數(shù)PDI 值。PDI 數(shù)值越小，表明粒徑分布越集中，數(shù)值在0～0.3 之間表明具有較好的分散均勻性[16]。

2.4 葉黃素納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的表征

表征葉黃素納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體（L-NLC）微觀結(jié)構(gòu)時所用的原子力顯微鏡（AFM）、X-射線衍射儀（XRD）、紅外光譜儀（IR）及拉曼光譜儀的分析操作采用文獻[14]的方法，具體方法如下：

原子力顯微鏡（AFM）：首先將適量L-NLC 用超純水稀釋2 000 倍，隨后取1 μL 樣品在新解離的云母表面鋪展，接著將其于室溫下放置30 min，使LNLC 顆粒充分吸附于云母表面。待樣品室溫干燥24 h 后，將其置于原子力顯微鏡的掃描探頭（Si 探針）下，以ScanAsyst 模式掃描（頻率320 kHz，彈簧系數(shù)42 N·m-1），進行檢測。圖像采集采用高度模式，設(shè)置參數(shù)如下：0.977 Hz 掃描速率，512×512 分辨率，5 μm×5 μm 掃描尺寸。圖像處理采用NanoScopeTM 軟件。

X-射線衍射（XRD）：L-NLC 及空白-NLC 凍干粉的晶相用D8 X-射線衍射儀分析，輻射源為Cu Kɑ，管電壓為45 kV，管電流為40 mA，掃描范圍為0 °～40 °，掃描速率為2 °·min-1。

紅外光譜（IR）：L-NLC 及空白-NLC 凍干粉的IR 譜圖采用IS10 傅立葉變換紅外光譜儀（美國，Nicolet 公司）測試，測試分辨率為2 cm-1，掃描次數(shù)為36 次，測試范圍為400～4 000 cm-1，測試溫度范圍為23～25 ℃。

拉曼光譜：取適量L-NLC 或空白-NLC 樣品滴于覆有錫箔紙的載玻片上，選用50 倍物鏡將激光束聚焦于凸起的球狀液滴上，并觀測和記錄譜線。測定條件：以He-Ne 激光器為光源，激發(fā)波長為632.81 nm，掃描范圍為600～3 000 cm-1，由CCD 多道探測，積分時間為30 s×1。

L-NLC 產(chǎn)品中葉黃素構(gòu)型變化，參照文獻[21]的HPLC 法進行分析，柱溫25 ℃；流動相為甲醇-水（98∶2，V·V-1）；流速1.0 mL·min-1；進樣量20 μL。

3 結(jié)果與分析

3.1 制備條件對葉黃素納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體品質(zhì)的影響

在預試驗的基礎(chǔ)上，重點考察葉黃素載量和液脂MCT 質(zhì)量分數(shù)（基于固液總脂質(zhì)的質(zhì)量）對葉黃素納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體（L-NLC）品質(zhì)的影響，試驗結(jié)果如圖1 所示。

圖1 制備條件對L-NLC 品質(zhì)的影響Fig.1 Effects of preparation parameters on quality of L-NLC

包封率和有效載量是評價L-NLC 品質(zhì)與應用價值的兩個重要參數(shù)。固定總脂質(zhì)質(zhì)量濃度為5%（g·mL-1）和MCT 質(zhì)量分數(shù)為30%的條件下，測定所得樣品的包封率、粒徑和PDI。圖1（A1）顯示，隨載量的升高，葉黃素的包封率有一定程度的下降，當載量為3%時，包封率降至73.6%。有效載量可以直觀評價葉黃素載入脂質(zhì)的能力。葉黃素的有效載量隨載量增大而逐漸增加的趨勢表明，在所試載量范圍內(nèi)，葉黃素能夠有效地載入到NLC 中。圖1（A2）表明，隨載量的提高，L-NLC 的平均粒徑逐漸增加，當載量為2%時，平均粒徑為168.2 nm。PDI 值隨載量的升高呈逐漸增大的趨勢，載量2.5%時，PDI 值已大于0.3，表明此時體系分散性較差。因此，在后續(xù)研究中固定葉黃素載量為2%。

固定總脂質(zhì)質(zhì)量濃度為5%和載量為2%的條件下，測定所得樣品的包封率、粒徑和PDI。圖1（B1）顯示，液脂MCT 含量為30%時，包封率最高均值達到88.9%。圖1（B2）表明，MCT 含量在15%～40%范圍內(nèi)，L-NLC 粒子的平均粒徑先減小后增大，PDI 值呈逐漸增大趨勢。在MCT 含量為30%時，對應的平均粒徑最小值為168.2 nm，PDI 值為0.28（小于0.3）。平均粒徑的先下降，可能是液態(tài)脂質(zhì)和固態(tài)脂質(zhì)黏度不同，脂相的黏度隨液態(tài)脂質(zhì)含量的增加而降低，從而降低了NLC 粒子的內(nèi)部黏度，也相應地降低了固-液界面張力，易于生成粒徑小且表面光滑的粒子[13]。平均粒徑隨后的增大，說明除了黏度因素影響外，還有表面能隨分散度增高而增大的影響。初始生成的小粒子表面能高，未及時吸附其他物質(zhì)或未及時被包覆時，可能自發(fā)地聚集成較大粒子，導致NLC 粒子的粒徑增加。

固定MCT 質(zhì)量分數(shù)為30%和載量為2%的條件下，測定所得樣品的包封率、粒徑和PDI。圖1（C1）顯示，隨著L-NLC 中總脂質(zhì)質(zhì)量濃度的增加，包封率出現(xiàn)先上升后下降的趨勢，相比較而言，在總脂質(zhì)質(zhì)量濃度為5%時，包封率具有最高值88.9%。同時圖1（C2）顯示，隨著總脂質(zhì)質(zhì)量濃度的增加，L-NLC 粒子的平均粒徑呈逐漸增加的趨勢，PDI 值亦呈不斷增加的趨勢，當總脂質(zhì)質(zhì)量濃度為5%時，平均粒徑為168.9 nm，PDI 值仍小于0.3。為進一步優(yōu)化L-NLC的制備工藝，后續(xù)進行了正交試驗。

3.2 正交試驗

葉黃素納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體（L-NLC）制備的正交試驗因素水平表見表1，正交試驗結(jié)果及極差分析見表2，正交試驗結(jié)果方差分析見表3。

表1 正交試驗因素與水平表Table 1 Factors and levels of the orthogonal experiments

表2 正交試驗結(jié)果表Table 2 Design and the results of the orthogonal experiments

表3 正交試驗方差分析結(jié)果Table 3 Analysis of variance of orthogonal test

極差分析結(jié)果表明，各因素對葉黃素納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的影響大小依次為MCT 質(zhì)量分數(shù)＞葉黃素載量＞總脂質(zhì)質(zhì)量濃度，方差分析結(jié)果表明，MCT 質(zhì)量分數(shù)對包封率有顯著影響（P<0.05）。制備葉黃素納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的最佳反應組合為A2B2C2。為得到較高含量的葉黃素納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體水溶液，并綜合單因素試驗的結(jié)果，該工藝確定為：葉黃素載量為2%，總脂質(zhì)質(zhì)量濃度5%（g·mL-1），MCT 質(zhì)量分數(shù)（液體脂質(zhì)占總脂質(zhì)的比率）為30%，表面活性劑質(zhì)量濃度2%（g·mL-1），超聲功率337.5 W，脈沖為每運行20 s間歇5 s，總時長5 min。按最佳組合方案A2B2C2作驗證試驗，經(jīng)3 次重復試驗，包封率均值為89.0%，表明正交試驗得出的最佳工藝符合實際試驗要求。

3.3 粒徑分布及光學特征

圖2（A）為葉黃素納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體（L-NLC）的粒徑分布圖。該圖顯示，L-NLC 粒子的平均粒徑為168.2 nm，PDI 值為0.28，小于0.3，表明L-NLC 試樣的粒子分散較均一。圖2（B）表明，L-NLC 膠體體系的丁達爾效應明顯（試樣B2和B3），這體現(xiàn)了膠體體系中納米粒子的共有光學特征。

圖2 L-NLC 的粒徑分布與光學特征Fig.2 The size distribution and the outer appearance of L-NLC sample

3.4 葉黃素納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體（L-NLC）結(jié)構(gòu)特征

3.4.1 形貌

圖3 是試樣的AFM 分析圖像，在5 μm×5 μm的掃描范圍內(nèi)，可觀測到類球形的粒子的平均粒徑為162 nm，這些粒子無聚集、融合現(xiàn)象，分散均勻。相比較而言，AFM 測得的平均粒徑略小于動態(tài)光散射（DLS）法測的結(jié)果（168 nm），這因DLS 法測得的是L-NLC 水化粒子的粒徑，而AFM 法觀測的是其經(jīng)干燥后的試樣粒徑。

圖3 新制得的L-NLC 試樣的AFM 分析圖Fig.3 AFM image of fresh L-NLC sample

3.4.2 晶態(tài)

在NLC 粒子中，NLC 的載量和包封率由起到骨架作用的固體脂質(zhì)晶型所影響[17]；液體脂質(zhì)的加入可促進固體脂質(zhì)非完美晶格生成，從而增大NLC 的包埋空間。L-NLC 凍干粉、空白-NLC 凍干粉及山崳酸甘油酯（ATO）的XRD 分析結(jié)果如圖4 所示。3 種試樣在2 θ 值為21.2 °和23.5 °處均出現(xiàn)較強的衍射峰，反映出ATO 的β 晶型特征[7]。此外，在該圖中未發(fā)現(xiàn)葉黃素晶體的衍射峰，說明葉黃素分子以非晶態(tài)形式分散于NLC 脂質(zhì)中，這有利于葉黃素的穩(wěn)定包埋。

圖4 ATO、L-NLC 凍干粉和空白-NLC 凍干粉的XRD 譜圖Fig.4 XRD patterns of L-NLC freeze-dried powders，Blank-NLC freeze-dried powders and ATO

3.4.3 紅外光譜特性

圖5 是采用FTIR 技術(shù)研究NLC 包埋葉黃素的狀況。圖中顯示，L-NLC 凍干粉和空白-NLC 凍干粉的紅外光譜幾乎一致?，F(xiàn)有的研究[18-19]表明，葉黃素分子在964 cm-l左右存有一個典型的特征吸收峰，該峰為葉黃素共軛多烯鏈中C－H 面外彎曲振動所產(chǎn)生。而L-NLC 凍干粉的紅外光譜中，964 cm-l處吸收峰幾近消失，這表明葉黃素已被包埋于NLC 中。

圖5 L-NLC 凍干粉、空白-NLC 凍干粉及葉黃素的紅外光譜Fig.5 FTIR spectra of L-NLC freeze-dried powders and Blank-NLC freeze-dried powders

3.4.4 拉曼光譜特性

拉曼光譜法具有試樣無需前處理和破壞、分析結(jié)果不受溶劑水分子振動干擾的優(yōu)點。如圖6 所示，利用拉曼光譜技術(shù)對NLC 粒子中的葉黃素分子包埋狀況進行了研究。葉黃素的拉曼光譜主要由4 個峰組成，即分子中多烯鏈的C=C 鍵的同相伸縮振動（ν1）、C－C 鍵的同相伸縮振動（ν2）、甲基的平面內(nèi)擺動（ν3）和氫原子的平面外擺動（ν4）[20]。圖6 中，LNLC 凍干粉試樣在波數(shù)1 532、1 197、1 164 cm-l處分別對應葉黃素的ν1、ν2和ν3的3 個主要拉曼峰。結(jié)合3.4.3 的紅外光譜分析結(jié)果，可認為葉黃素分子已被包埋于NLC 的固液脂基粒子中。

圖6 L-NLC 試樣和空白-NLC 試樣的拉曼光譜Fig.6 Roman spectra of L-NLC sample and Blank-NLC sample

3.4.5 產(chǎn)品中葉黃素構(gòu)型變化

為了進一步鑒定葉黃素納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體（LNLC）中葉黃素異構(gòu)體的組成，采用配有DAD 檢測器的HPLC 對L-NLC 進行分析，結(jié)果如圖7 所示。試驗結(jié)果表明，L-NLC 制備前（圖7B）所用原料葉黃素99%以上為全反式結(jié)構(gòu)（All-E），僅含有少量9 順式異構(gòu)體（9Z）；而L-NLC 制備后，圖7A 顯示，其載運的葉黃素發(fā)生了部分構(gòu)型轉(zhuǎn)化現(xiàn)象，依據(jù)李大婧等[21]的研究，可鑒別出13Z 葉黃素和13`Z 葉黃素明顯增加，且經(jīng)峰面積歸一化法可得總順式葉黃素異構(gòu)體占比達到8.5%，這是由于制備L-NLC 過程的熱致全反式葉黃素異構(gòu)化所導致。

圖7 L-NLC 的液相色譜圖Fig.7 Liquid chromatography of L-NLC

4 結(jié)論

葉黃素的載量和液脂MCT 含量和總脂質(zhì)濃度影響著L-NLC 的包封率、平均粒徑和分散均勻性。在葉黃素載量2%、MCT 質(zhì)量分數(shù)30%及總脂質(zhì)質(zhì)量濃度5%（g·mL-1）的條件下，通過溶劑擴散-超聲分散聯(lián)用法可制備出粒徑較?。ǖ陀?70 nm）、體系分散性良好（PDI＜0.3）的L-NLC，被包埋的葉黃素分子以非晶態(tài)形式分散到其固液脂基體系中。在載運葉黃素方面，該NLC 制備方法輔以少量綠色試劑乙醇為擴散助劑，具有操作簡單、設(shè)備要求不高的優(yōu)勢，所得產(chǎn)品有望應用到功能性食品等領(lǐng)域。此外，關(guān)于LNLC 中葉黃素生物利用度變化及在貯藏過程中化學穩(wěn)定性方面的研究，有待下一步開展。