• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    ZmbZIP76 通過減輕活性氧損傷和滲透脅迫增強植物對鹽堿脅迫的耐受性

    2021-10-05 08:48:38賀琳張苗苗吳紫璇孫立強楊克軍
    關(guān)鍵詞:耐受性株系脯氨酸

    賀琳,張苗苗,吳紫璇,孫立強,楊克軍

    (黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué),大慶 163319)

    干旱和鹽堿等非生物逆境是限制植物生長和減少作物產(chǎn)量的主要環(huán)境因素[1-2]。植物為了生存,在長期的進化過程中形成了復(fù)雜而高效的應(yīng)答機制,從分子、細(xì)胞、生理和生化水平做出適應(yīng)性調(diào)整,以抵御不利環(huán)境[2]。在植物應(yīng)答非生物逆境過程中,轉(zhuǎn)錄因子起著關(guān)鍵的調(diào)控作用。堿性亮氨酸拉鏈(basic leucine zipper,bZIP)轉(zhuǎn)錄因子家族是植物中規(guī)模最大、種類最豐富的轉(zhuǎn)錄因子之一,其通常又被稱為AREB(ABA-reactive element binding factor)或ABF(ABRE-binding factors)[3]。

    bZIPs 家族基因在植物抵御非生物脅迫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用,大部分bZIP 基因如ABF2/AREB1,ABF4/AREB2 和ABF3 可以被ABA、干旱和鹽誘導(dǎo)表達[4-5]。一些bZIP 基因的過表達可以提高植物對非生物脅迫的耐受性。例如,ABF3 和ABF4 蛋白通過上調(diào)ABA 和逆境相關(guān)基因表達進而提高轉(zhuǎn)基因擬南芥對干旱的耐受性[6]。擬南芥bZIP 基因AtTGA4 通過改善硝酸鹽的運輸和同化,提高轉(zhuǎn)基因植物的抗旱性[7]。AtABF3 在苜蓿(Medicago sativa)中過表達降低了葉片的蒸騰速率和活性氧的積累,增強了葉片對干旱、鹽和氧化脅迫的耐受性[8]。OsbZIP23 在水稻中的過表達顯著提高了水稻的抗旱性、耐鹽性以及對ABA 的敏感性[9]。OsbZIP72 在水稻中的過表達可以提高ABA 響應(yīng)基因的表達水平,轉(zhuǎn)基因植物對ABA的敏感性提高,抗旱性增強[10]。干旱和ABA 處理誘導(dǎo)了棉花GhABF2 的表達,但高鹽抑制了GhABF2 的表達,干旱和鹽處理后過表達GhABF2 的棉花脯氨酸含量、超氧化物歧化酶活性和過氧化氫酶活性均顯著高于野生型[11]。玉米ABP9 基因能夠被ABA、H2O2、干旱和鹽誘導(dǎo)表達,過表達ABP9 基因的擬南芥對干旱、鹽、冷和氧化脅迫等多種非生物逆境表現(xiàn)出較強的耐受性[12]。雖然目前關(guān)于bZIP 轉(zhuǎn)錄因子在鹽、旱和冷逆境下的功能研究較多,但是關(guān)于bZIP轉(zhuǎn)錄因子在植物抵御鹽堿復(fù)合脅迫過程中的功能的報道相對較少。

    Jakoby 等[13]根據(jù)堿性結(jié)構(gòu)域及保守結(jié)構(gòu)域,將擬南芥的75 個bZIP 類轉(zhuǎn)錄因子基因家族成員分為A、B、C、D、E、F、G、H、I 和S 類10 個亞家族。其中,A 亞族bZIPs 在種子和植物組織對ABA 和逆境脅迫的響應(yīng)信號網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮重要作用。例如,Ying 等[14]發(fā)現(xiàn)AbZIP 轉(zhuǎn)錄因子ZmbZIP72 在擬南芥中過表達可增強植物的抗旱性和耐鹽性,提高種子對ABA 和滲透脅迫的敏感性。大豆bZIP 基因GmbZIP44,GmbZIP62和GmbZIP78 分別屬于S、C 和G 亞家族,三者在擬南芥中過表達,均能提高轉(zhuǎn)基因擬南芥對鹽和低溫脅迫的耐受性[15]。B 亞家族的兩個成員AtbZIP17(At2g40950)和AtbZIP28(At3g10800)參與調(diào)控鹽脅迫反應(yīng)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫反應(yīng)[16-17]。F 亞家族是個小亞家族,其成員(F-bZIPs)主要參與調(diào)控植物的缺鋅脅迫反應(yīng)[18-19]。擬南芥僅含有3 個F-bZIPs 基因(At4g35040,At2g16770,At3g51960),其中At3g51960(AtbZIP24)在鹽脅迫網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮負(fù)面調(diào)節(jié)作用[20]。有報道指出玉米中有4 條F-bZIPs 基因(GRMZM-2G000171,GRMZM2G055413,GRMZM2G175870,G -RMZM2G033230)[21],但是迄今功能均未見報道。鑒于此,研究首先采用實時定量PCR 研究F-ZmbZIPs 的表達模式,發(fā)現(xiàn)ZmbZIP76(GRMZM2G055413)可以同時被ABA 和NaHCO3脅迫誘導(dǎo)表達。進而對轉(zhuǎn)基因材料進行深入分析,NaHCO3處理后,與野生型株系相比,ZmbZIP76 轉(zhuǎn)基因擬南芥的根長顯著增加,脯氨酸水平和活性氧清除能力顯著提高,相反,ZmbZIP76 轉(zhuǎn)基因擬南芥體內(nèi)的過氧化氫含量和丙二醛(MDA)含量顯著降低。研究結(jié)果表明ZmbZIP76 轉(zhuǎn)錄因子通過調(diào)控轉(zhuǎn)基因植物的多種生理過程來增強其對鹽堿脅迫的耐受性。

    1 材料和方法

    1.1 實驗材料

    野生型擬南芥(哥倫比亞型)為黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)作物逆境功能組學(xué)實驗室保存。為了獲得過表達ZmbZIP76 的擬南芥株系,構(gòu)建過表達載體35S:ZmbZIP76,轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌。挑取活化的EHA105(35S:ZmbZIP76)單菌落培養(yǎng)至OD600 為0.6~0.8,離心沉淀菌體。配制侵染液:5%Sugar+100 μM AS+100 μL·L-1Triton X-100+0.02% Silwet L-77+2 ng·L-16-BA+沉淀后的菌體,補充去離子水使農(nóng)桿菌的OD600 為0.8。侵染擬南芥花序,收集T0 代種子在含有50 mg·L-1卡那霉素的1/2MS 培養(yǎng)基上篩選,獲得T1 代苗,對其進行DNA 水平檢測,檢測成功的株系培養(yǎng)至T3代用于功能研究。

    1.2 基因表達分析

    為了分析ZmbZIP76 基因在鹽堿脅迫下的表達模式,用100 mM NaHCO3的溶液處理二葉時期的合344 玉米自交系土壤苗0,12,24 和72 h。不同處理條件下的幼苗根和葉分開取樣,液氮速凍,用TRIzol 法提取RNA,利用逆轉(zhuǎn)錄酶(FastQuant RT kit,TIANGEN,China)反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA 模板。以ZmActin1(GRMZM2G126010)為內(nèi)參,所用引物序列見表1。反應(yīng)體系為10 μL:SYBR Premix Ex TaqTmⅡ(TaKaRa公司)5 μL,上下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL,cDNA模板1 μL,無菌雙蒸餾水2 μL。反應(yīng)程序為:95 ℃3 min;95 ℃30 s,58 ℃30 s,72 ℃30 s,40 個循環(huán)。每個處理3 次重復(fù)。采用2-ΔΔCt方法計算各基因表達量,利用SPSS18.0 進行差異顯著性分析。

    表1 熒光定量PCR 引物序列Table 1 Primers of fluorescent quantitative PCR

    1.3 生長表型分析

    利用10% NaClO對不同株系(WT、OE3 和OE16)的擬南芥種子進行消毒。將消毒后的種子均勻播種于1/2 MS 培養(yǎng)基上,在22±2 ℃,光照強度100 μmol·m-2·s-1,光照周期為16 h 光照/8 h 黑暗的人工氣候室中培養(yǎng),1 周后將長勢相同的幼苗移栽到含有NaHCO3(0、6 mM)的1/2 MS 培養(yǎng)基表面進行豎直培養(yǎng),脅迫1 周后對相同處理條件下OE 株系與WT 株系之間根長的差異進行統(tǒng)計分析(P<0.05,one-way ANOVA)。每個株系每個處理至少50 株苗,實驗進行3 次獨立的生物學(xué)重復(fù)。

    1.4 生理指標(biāo)的測定

    選取1 周苗齡的野生型株系(WT)、過表達株系(OE3 和OE16)分別置于含有0、6 mM NaHCO3的1/2 MS 培養(yǎng)基上培養(yǎng)1 周,分別測定不同株系不同處理后的超氧化物歧化酶活性(SOD)、過氧化物酶活性(POD)、H2O2含量、脯氨酸含量和丙二醛(MDA)含量。SOD 和POD 活性分別采用氮藍四唑(NBT)光化還原法和愈創(chuàng)木酚法測定[22];H2O2含量測定參考Ve likova 等[23];脯氨酸含量采用磺基水楊酸提取,茚三酮比色法[24];MDA 含量采用硫代巴比妥酸比色法(TBA)測定[25]。實驗進行3 次獨立的生物學(xué)重復(fù),利用SPSS 軟件對相同處理條件下OE 株系與WT 株系之間生理指標(biāo)的差異進行統(tǒng)計分析(P<0.01,one-way ANOVA)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 玉米ZmbZIP76 基因在ABA 和NaHCO3 脅迫下的表達分析

    ABA 和NaHCO3處理的各個時間點ZmbZIP76在根中均顯著上調(diào)表達,NaHCO3處理12 h 后表達量最高,是對照的17.7 倍,隨后表達量開始降低,ABA 處理24 h 后表達量最高,為對照的7.7 倍,隨后表達量有所降低(圖1)。ABA 和NaHCO3處理下ZmbZIP76 在葉中的表達模式極為相似,都是在脅迫處理的24 h 開始出現(xiàn)顯著增加的表達量,在處理的72 h 表達量達到最高峰,ABA 和NaHCO3處理72 h時ZmbZIP76 的表達量分別是對照的5.9 倍和8.6 倍(圖1)。

    圖1 NaHCO3 和ABA 處理下ZmbZIP76 基因在玉米葉和根中的表達Fig.1 The expression of ZmbZIP76 gene in leaves and roots of maize under NaHCO3 and ABA treatments

    2.2 ZmbZIP76 基因過表達對擬南芥根長的影響

    為了比較NaHCO3脅迫下ZmbZIP76 過表達株系與WT 株系根長的差異,將1 周大小長勢一致的不同株系的幼苗分別轉(zhuǎn)移到含有0、6 mM NaHCO3的1/2 MS 培養(yǎng)基上豎直培養(yǎng)1 周,測量根長并拍照。結(jié)果如圖2 所示,正常生長條件下,野生型株系和過表達株系根長無顯著差異,但是經(jīng)過6 mM NaHCO3處理后,過表達株系OE3 和OE16 的根長分別是野生型株系根長的1.4 和1.45 倍(P<0.05,one-way ANOVA test),說明過ZmbZIP76 過表達提高了擬南芥幼苗對NaHCO3脅迫的耐受性。

    圖2 NaHCO3 處理下ZmbZIP76 轉(zhuǎn)基因擬南芥根長Fig.2 The root length of ZmbZIP76 transgenic Arabidopsis under NaHCO3 treatment

    2.3 ZmbZIP76 基因過表達對植物抗氧化防御系統(tǒng)的影響

    正常生長條件下,野生型株系和ZmbZIP76 過表達株系(OE3 和OE16)體內(nèi)SOD 和POD 活性未見顯著差異,然而,在NaHCO3脅迫下,OE3 和OE16 體內(nèi)SOD 活性分別是野生型植物的1.94 倍和1.97 倍,OE3 和OE16 體內(nèi)POD 活性分別是野生型植物的2.1 倍和2 倍(圖3)。鹽堿脅迫條件下ZmbZIP76 過表達株系中SOD 和POD 活性顯著高于野生型擬南芥(P<0.01,one-way ANOVA test),表明ZmbZIP76 基因?qū)OD 和POD 酶活具有正向調(diào)控作用。H2O2含量測定進一步顯示,NaHCO3脅迫條件下過表達株系OE3 和OE16 體內(nèi)H2O2含量顯著低于野生型株系(圖3),進一步證明ZmbZIP76 基因通過促進植物體內(nèi)活性氧的清除來提高植物對鹽堿脅迫的耐受性。

    圖3 NaHCO3 脅迫下ZmbZIP76 轉(zhuǎn)基因擬南芥活性氧清除能力Fig.3 The reactive oxygen scavenging ability of ZmbZIP76 transgenic Arabidopsis under NaHCO3 stress

    2.4 ZmbZIP76 基因過表達對植物脯氨酸含量的影響

    正常生長條件下,野生型株系和ZmbZIP76 過表達株系(OE3 和OE16)體內(nèi)脯氨酸含量未見顯著差異,然而,在NaHCO3脅迫下,OE3 和OE16 中脯氨酸含量分別是野生型株系的1.54 倍和1.46 倍(圖4)。ZmbZIP76 過表達株系中脯氨酸含量顯著高于野生型(P<0.01,one-way ANOVA test),表明鹽堿脅迫條件下ZmbZIP76 通過正向調(diào)控植物體內(nèi)脯氨酸的合成進而提高植物耐鹽堿性。

    圖4 NaHCO3 脅迫下ZmbZIP76 轉(zhuǎn)基因擬南芥脯氨酸含量Fig.4 The proline content of ZmbZIP76 transgenic Arabidopsis under NaHCO3 stress

    2.5 ZmbZIP76 基因過表達對植物MDA 含量的影響

    正常生長條件下,野生型株系和ZmbZIP76 過表達株系(OE3 和OE16)體內(nèi)MDA 含量未見顯著差異,然而,在NaHCO3脅迫下,ZmbZIP76 過表達株系中MDA 含量顯著低于野生型(P<0.01,one-way ANOVA test),OE3 和OE16 中MDA 含量分別較野生型株系下降了37.6%和39%(圖5)。

    圖5 NaHCO3 脅迫下ZmbZIP76 轉(zhuǎn)基因擬南芥MDA 含量Fig.5 The MDA content of ZmbZIP76 transgenic Arabidopsis under NaHCO3 stress

    3 討論

    bZIP 轉(zhuǎn)錄因子在多種生物學(xué)過程以及非生物脅迫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用,然而,大部分關(guān)于bZIPs 的報道集中于擬南芥和水稻中,玉米中關(guān)于bZIP 的報道有但相對較少。從玉米中分離了一條能夠同時響應(yīng) ABA 和 NaHCO3脅迫的bZIP基因GRMZM2G055413,命名為ZmbZIP76,證明了其在鹽堿脅迫下的正向調(diào)控功能。

    ABA 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在非生物脅迫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用,包括轉(zhuǎn)錄因子在內(nèi)的許多基因都可以響應(yīng)ABA 信號,如DREB/CBF,MYB,bHLH,ERF,bZIP 和NAC[26]。轉(zhuǎn)錄因子通過與靶基因啟動子中順式元件相互作用,在響應(yīng)ABA 信號中發(fā)揮重要作用[27]。其中,bZIP 是最大的轉(zhuǎn)錄因子基因家族之一,在調(diào)控依賴于ABA 的植物逆境反應(yīng)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。目前,擬南芥中bZIP 轉(zhuǎn)錄因子參與的ABA 信號模式已經(jīng)建立,PYR/PYL/RCARs→PP2C→SnRKs→AREBs→靶基因。其中,PYR/PYL/RCARs 是ABA 受體蛋白。PP2C(protein phosphatase 2C)是絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶,可以負(fù)調(diào)控ABA 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及多種逆境脅迫轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[28]。SnRK(sucrose non-fermenting 1-related protein kinase)是廣泛存在于植物中的Ser/Thr類蛋白激酶,可以與PP2Cs 發(fā)生相互作用從而導(dǎo)致自身失活和去磷酸化。非脅迫條件下,PP2Cs 可與SnRKs 結(jié)合,使其發(fā)生去磷酸化作用而失活[29]。逆境脅迫下,ABA 可以和受體PYR/PYL/RCAR 形成復(fù)合物,該復(fù)合物會阻斷PP2C 介導(dǎo)的SnRKs 的失活,未失活的SnRKs 激酶可以通過磷酸化bZIP 轉(zhuǎn)錄因子將其激活,bZIP 轉(zhuǎn)錄因子進一步通過識別ABRE 元件最終激活A(yù)BA 信號相關(guān)靶基因的表達[29]。研究發(fā)現(xiàn)ZmbZIP76 可以同時被ABA 和NaHCO3誘導(dǎo)表達,值得注意的是,ZmbZIP76 在兩種處理下的表達模式極為相似,其表達量在根中均是先升高再降低,在葉中都是于脅迫處理的24 h 開始顯著增加,在處理的72 h 達到表達的最高峰(圖1),表明ZmbZIP76參與調(diào)控的植物鹽堿脅迫反應(yīng)很可能依賴于ABA途徑,即ZmbZIP76 轉(zhuǎn)錄因子可能通過調(diào)節(jié)ABA 信號來提高轉(zhuǎn)基因擬南芥對鹽堿脅迫的耐受性。

    非生物脅迫條件下,有效的抗氧化系統(tǒng)是植物抵抗逆境的一個主要途徑[30]。鹽脅迫條件下ThbZIP1基因在煙草中過量表達,可以提高過氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)的活性,增加可溶性糖和可溶性蛋白的含量,還可以促進活性氧的消除[31]。玉米中發(fā)現(xiàn)的bZIP 轉(zhuǎn)錄因子ABP9 通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的ROS 水平提高轉(zhuǎn)基因擬南芥對多種逆境的耐受性[12]。研究發(fā)現(xiàn)NaHCO3脅迫下ZmbZIP76 過表達株系(OE3 和OE16)中SOD 和POD 活性顯著高于野生型,H2O2含量顯著低于野生型株系(圖3),表明NaHCO3脅迫條件下ZmbZIP76 基因可以通過提高抗氧化防御系統(tǒng)中關(guān)鍵酶SOD 和POD 的活性,加速對活性氧的清除。類似的是,Qu 等發(fā)現(xiàn)微藻ChbZIP1轉(zhuǎn)錄因子通過對活性氧清除系統(tǒng)的調(diào)節(jié)來提高轉(zhuǎn)基因擬南芥對鹽堿脅迫的耐受性[32]。

    逆境下植物體內(nèi)高水平的ROS 積累會引起膜脂過氧化,從而產(chǎn)生大量MDA,因此逆境下植物體內(nèi)ROS 和MDA 含量通常具有正向關(guān)性,MDA 含量既可以直接用于衡量膜系統(tǒng)受損程度,又可以間接用于反應(yīng)植物體內(nèi)ROS 的含量。研究發(fā)現(xiàn)NaHCO3脅迫條件下ZmbZIP76 過表達株系中MDA 含量和ROS含量均顯著低于野生型(圖3 和圖5),表明ZmbZIP76 的過表達可以通過加快ROS 的清除,減輕膜系統(tǒng)的損傷來提高轉(zhuǎn)基因擬南芥對NaHCO3脅迫的耐受性。與此一致的是,Bi 等報道TabZIP15 的過表達使小麥體內(nèi)H2O2含量和MDA 含量顯著降低,轉(zhuǎn)基因植物表現(xiàn)出提高的耐鹽性[33]。Wu 等發(fā)現(xiàn)野生大豆GsbZIP67 基因通過降低MDA 含量和提高POD活性從而來增強苜蓿對鹽堿脅迫的耐受性[34]。

    脯氨酸在植物抵御非生物脅迫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用,在遭受逆境時,植物體內(nèi)的脯氨酸濃度會增加,以此調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外滲透壓防止細(xì)胞受損。逆境條件下一些bZIP 轉(zhuǎn)錄因子可以同時調(diào)控抗氧化防御系統(tǒng)和脯氨酸的合成。例如,甘薯bZIP 轉(zhuǎn)錄因子IbbZIP1 的過表達在干旱和鹽脅迫下不但提高了植物體內(nèi)SOD 活性,減少了H2O2含量,還增加了脯氨酸含量,最終增強了IbbZIP1 轉(zhuǎn)基因擬南芥在干旱和鹽脅迫下的耐受性[35]。相類似的是,研究發(fā)現(xiàn)鹽堿脅迫條件下ZmbZIP76 過表達株系中脯氨酸含量顯著高于野生型,SOD 和POD 活性也顯著高于野生型,H2O2含量則顯著低于野生型株系(圖3 和圖4),表明玉米bZIP 轉(zhuǎn)錄因子同樣可以通過正向調(diào)控抗氧化防御系統(tǒng)和脯氨酸合成來提高植物對鹽堿脅迫的耐受性。由此可見,逆境相關(guān)bZIP 轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控的植物抗逆生理反應(yīng)在物種間具有相似性。

    4 結(jié)論

    ZmbZIP76 既可以受ABA 誘導(dǎo)表達,又可以受NaHCO3誘導(dǎo)表達,且在兩種處理下表達模式相似。鹽堿脅迫下,與野生型株系相比,ZmbZIP76 轉(zhuǎn)基因擬南芥的根長顯著增加,脯氨酸含量、SOD 和POD活性顯著提高,過氧化氫含量和MDA 含量顯著降低。研究證實了ZmbZIP76 轉(zhuǎn)錄因子是鹽堿脅迫下的正向調(diào)節(jié)因子,研究結(jié)果將為進一步利用轉(zhuǎn)基因手段培育玉米抗/耐品種提供理論依據(jù)和基因準(zhǔn)備。

    猜你喜歡
    耐受性株系脯氨酸
    國家藥監(jiān)局批準(zhǔn)脯氨酸恒格列凈片上市
    中老年保健(2022年3期)2022-11-21 09:40:36
    過表達NtMYB4a基因增強煙草抗旱能力
    4個地被菊新品系對濕熱脅迫的耐受性研究
    園林科技(2020年2期)2020-01-18 03:28:18
    植物體內(nèi)脯氨酸的代謝與調(diào)控
    嫦娥5號返回式試驗衛(wèi)星小麥育種材料研究進展情況
    反式-4-羥基-L-脯氨酸的研究進展
    干旱脅迫對馬尾松苗木脯氨酸及游離氨基酸含量的影響
    衢州椪柑變異株系—黃皮椪柑相關(guān)特性研究
    浙江柑橘(2016年1期)2016-03-11 20:12:31
    巴氏醋桿菌核酸修復(fù)酶UvrA對大腸桿菌耐受性的影響
    miR-29b通過靶向PI3K/Akt信號通路降低胃癌細(xì)胞對順鉑的耐受性
    男人舔奶头视频| 97超碰精品成人国产| 久久久久久久久久人人人人人人| 亚洲欧美日韩无卡精品| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图 | 日日撸夜夜添| 观看av在线不卡| 97在线视频观看| 中文字幕精品免费在线观看视频 | 国产精品av视频在线免费观看| 综合色丁香网| 99热这里只有是精品在线观看| 国产免费又黄又爽又色| 亚洲国产高清在线一区二区三| 日本wwww免费看| 久久99热这里只频精品6学生| 国产精品一区www在线观看| 乱码一卡2卡4卡精品| 99热全是精品| 欧美高清性xxxxhd video| 久久久久久久久久成人| 深夜a级毛片| 伦理电影免费视频| 毛片女人毛片| 青春草视频在线免费观看| 精品亚洲成国产av| 免费少妇av软件| 亚洲,欧美,日韩| 亚洲真实伦在线观看| 纵有疾风起免费观看全集完整版| av国产免费在线观看| 岛国毛片在线播放| 久久99热这里只频精品6学生| 久久影院123| 国产 一区 欧美 日韩| 中文字幕制服av| 免费观看a级毛片全部| 青春草亚洲视频在线观看| 精品国产一区二区三区久久久樱花 | 视频区图区小说| 免费观看性生交大片5| 黄色一级大片看看| 最新中文字幕久久久久| 日韩欧美精品免费久久| 黄色欧美视频在线观看| 插逼视频在线观看| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 一本久久精品| 最近最新中文字幕大全电影3| 夫妻性生交免费视频一级片| 少妇人妻久久综合中文| 亚洲,一卡二卡三卡| 亚洲精品456在线播放app| 伦精品一区二区三区| 免费高清在线观看视频在线观看| 日韩av免费高清视频| 久久久色成人| 精品久久久噜噜| 夫妻性生交免费视频一级片| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 国产高清不卡午夜福利| 男女下面进入的视频免费午夜| videos熟女内射| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 看非洲黑人一级黄片| 亚洲第一av免费看| 国产高潮美女av| 久久精品夜色国产| 伊人久久精品亚洲午夜| 国产真实伦视频高清在线观看| 舔av片在线| 99热这里只有是精品在线观看| 中国美白少妇内射xxxbb| 亚洲真实伦在线观看| 青春草亚洲视频在线观看| 麻豆乱淫一区二区| 日韩成人伦理影院| 精品国产三级普通话版| 国产淫片久久久久久久久| 妹子高潮喷水视频| 久久精品久久精品一区二区三区| 亚洲欧美日韩无卡精品| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 亚洲电影在线观看av| 中文欧美无线码| 免费av不卡在线播放| 亚洲av国产av综合av卡| 国产精品三级大全| 在线免费观看不下载黄p国产| 黄色欧美视频在线观看| 亚洲精品自拍成人| 99九九线精品视频在线观看视频| 下体分泌物呈黄色| 另类亚洲欧美激情| 日韩中字成人| 美女内射精品一级片tv| 国产爽快片一区二区三区| 国产成人精品福利久久| 国产精品一及| a 毛片基地| 日本欧美视频一区| 中文天堂在线官网| 免费大片18禁| 国产久久久一区二区三区| 网址你懂的国产日韩在线| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 青青草视频在线视频观看| 久久99热6这里只有精品| 国产精品人妻久久久久久| 午夜日本视频在线| 免费观看性生交大片5| 欧美 日韩 精品 国产| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 美女主播在线视频| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 日韩视频在线欧美| 久久99精品国语久久久| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 中文字幕制服av| 少妇高潮的动态图| 97超视频在线观看视频| 久久精品夜色国产| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 国产成人免费观看mmmm| 日本一二三区视频观看| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 欧美日韩视频精品一区| 一级毛片我不卡| av在线老鸭窝| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 日韩强制内射视频| 欧美日韩亚洲高清精品| 国产高清不卡午夜福利| 午夜激情久久久久久久| 在线免费观看不下载黄p国产| 91狼人影院| 亚洲熟女精品中文字幕| 成人无遮挡网站| 又爽又黄a免费视频| 在线天堂最新版资源| 亚洲av福利一区| 精品久久久精品久久久| 久久久精品免费免费高清| 男的添女的下面高潮视频| 久久久精品94久久精品| 国产欧美日韩一区二区三区在线 | 免费人妻精品一区二区三区视频| 一二三四中文在线观看免费高清| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 免费人妻精品一区二区三区视频| av国产久精品久网站免费入址| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 熟女电影av网| 欧美bdsm另类| 男人舔奶头视频| 99久国产av精品国产电影| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 一级毛片 在线播放| 最黄视频免费看| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 伦精品一区二区三区| 精品人妻一区二区三区麻豆| 日本黄色片子视频| 国产淫片久久久久久久久| 高清欧美精品videossex| 丰满少妇做爰视频| 日韩三级伦理在线观看| 国产永久视频网站| 日本午夜av视频| 欧美日韩精品成人综合77777| 免费大片18禁| 一个人免费看片子| 亚洲精品,欧美精品| 女人十人毛片免费观看3o分钟| av线在线观看网站| 久久久亚洲精品成人影院| 免费大片18禁| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 中文字幕精品免费在线观看视频 | 国产综合精华液| 中文字幕免费在线视频6| 国产精品久久久久久久电影| 深爱激情五月婷婷| 免费黄频网站在线观看国产| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 91在线精品国自产拍蜜月| 亚洲国产精品国产精品| 国产黄频视频在线观看| 国产精品嫩草影院av在线观看| 成人午夜精彩视频在线观看| 久久久久久伊人网av| 欧美精品亚洲一区二区| 日韩欧美一区视频在线观看 | 欧美精品人与动牲交sv欧美| 免费观看av网站的网址| 午夜福利高清视频| 国产精品偷伦视频观看了| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 精品国产三级普通话版| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 视频中文字幕在线观看| 热99国产精品久久久久久7| 午夜精品国产一区二区电影| 日日啪夜夜撸| 成人国产麻豆网| 啦啦啦在线观看免费高清www| 一本久久精品| 水蜜桃什么品种好| 在线观看人妻少妇| 国产黄频视频在线观看| 久久久久网色| 亚洲成色77777| 国产精品免费大片| 又爽又黄a免费视频| 这个男人来自地球电影免费观看 | 啦啦啦在线观看免费高清www| 超碰97精品在线观看| 精品熟女少妇av免费看| 国产精品久久久久久av不卡| 中文资源天堂在线| 亚洲av福利一区| 欧美 日韩 精品 国产| 纵有疾风起免费观看全集完整版| av卡一久久| 久久这里有精品视频免费| 美女主播在线视频| 亚洲精品第二区| 久久女婷五月综合色啪小说| 18禁在线播放成人免费| av在线老鸭窝| 亚洲怡红院男人天堂| 久久人人爽人人片av| 国产男女超爽视频在线观看| 观看美女的网站| 国产免费又黄又爽又色| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 少妇 在线观看| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 国产视频首页在线观看| 伊人久久国产一区二区| 哪个播放器可以免费观看大片| av不卡在线播放| 在线精品无人区一区二区三 | 国产精品不卡视频一区二区| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 国产亚洲一区二区精品| 日韩一本色道免费dvd| 国模一区二区三区四区视频| 伦精品一区二区三区| 国产成人精品婷婷| 又爽又黄a免费视频| 日本av免费视频播放| 热99国产精品久久久久久7| 国产在线免费精品| 久久人人爽av亚洲精品天堂 | 偷拍熟女少妇极品色| av在线老鸭窝| 最新中文字幕久久久久| 妹子高潮喷水视频| 亚洲一区二区三区欧美精品| 性色avwww在线观看| 十八禁网站网址无遮挡 | 下体分泌物呈黄色| 日本-黄色视频高清免费观看| 精品少妇久久久久久888优播| 日韩视频在线欧美| 亚州av有码| 如何舔出高潮| 深夜a级毛片| 亚洲国产色片| 人体艺术视频欧美日本| 国产免费视频播放在线视频| 亚洲无线观看免费| 搡老乐熟女国产| 国产高清三级在线| 精品一区二区免费观看| 欧美3d第一页| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 国产成人aa在线观看| 欧美区成人在线视频| 一区二区三区四区激情视频| 久久av网站| 国产成人精品婷婷| 亚洲第一av免费看| 一本色道久久久久久精品综合| 香蕉精品网在线| 日韩人妻高清精品专区| 一本一本综合久久| 全区人妻精品视频| 一级毛片我不卡| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 最近中文字幕高清免费大全6| 国产精品国产av在线观看| 丰满人妻一区二区三区视频av| 国产精品蜜桃在线观看| 欧美日韩在线观看h| 下体分泌物呈黄色| 欧美精品一区二区大全| 在线免费十八禁| 在线天堂最新版资源| 天堂8中文在线网| 在线免费观看不下载黄p国产| 久久 成人 亚洲| 国产v大片淫在线免费观看| 日韩国内少妇激情av| 亚洲精品乱久久久久久| 日韩一区二区三区影片| 午夜视频国产福利| 久久热精品热| 青青草视频在线视频观看| 纯流量卡能插随身wifi吗| 国产成人午夜福利电影在线观看| 国产高潮美女av| 五月玫瑰六月丁香| 久久 成人 亚洲| 极品教师在线视频| 免费看光身美女| 成人国产麻豆网| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 看十八女毛片水多多多| 日本av免费视频播放| 亚洲成人手机| 高清在线视频一区二区三区| 欧美日韩综合久久久久久| 国产一区亚洲一区在线观看| 能在线免费看毛片的网站| 日韩电影二区| 少妇的逼好多水| 久久久久久久亚洲中文字幕| 久久久久视频综合| 精品亚洲成国产av| 七月丁香在线播放| 一个人免费看片子| 777米奇影视久久| 免费黄频网站在线观看国产| 黑人高潮一二区| 亚洲av在线观看美女高潮| av国产免费在线观看| 欧美3d第一页| 精华霜和精华液先用哪个| 妹子高潮喷水视频| 日本午夜av视频| 婷婷色av中文字幕| 国产黄色免费在线视频| 国产中年淑女户外野战色| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 久久国内精品自在自线图片| 大陆偷拍与自拍| 卡戴珊不雅视频在线播放| 岛国毛片在线播放| 久久 成人 亚洲| 欧美激情极品国产一区二区三区 | a级一级毛片免费在线观看| 久久久国产一区二区| 成人综合一区亚洲| 久久人人爽人人爽人人片va| 99久久精品一区二区三区| 国产男女内射视频| 色哟哟·www| 亚洲人成网站高清观看| 久久人人爽人人爽人人片va| 99久久精品一区二区三区| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 丰满人妻一区二区三区视频av| 涩涩av久久男人的天堂| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 直男gayav资源| 视频区图区小说| 高清毛片免费看| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 亚洲不卡免费看| 99热国产这里只有精品6| 亚洲精品国产av蜜桃| 亚洲成人中文字幕在线播放| 免费黄网站久久成人精品| 最新中文字幕久久久久| 精品人妻一区二区三区麻豆| av又黄又爽大尺度在线免费看| 国产 一区 欧美 日韩| 爱豆传媒免费全集在线观看| 国产免费又黄又爽又色| 欧美少妇被猛烈插入视频| 另类亚洲欧美激情| 国产综合精华液| 国产探花极品一区二区| 国产精品久久久久久av不卡| 全区人妻精品视频| av女优亚洲男人天堂| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 国产精品99久久99久久久不卡 | 国产男女超爽视频在线观看| 大香蕉97超碰在线| 中文字幕av成人在线电影| 精品人妻熟女av久视频| 国产黄频视频在线观看| 午夜精品国产一区二区电影| 美女国产视频在线观看| 精品久久久噜噜| 麻豆国产97在线/欧美| av视频免费观看在线观看| 国产精品一区二区在线不卡| 免费看光身美女| 国产免费视频播放在线视频| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 午夜日本视频在线| 91精品国产九色| 五月伊人婷婷丁香| av黄色大香蕉| 大码成人一级视频| 另类亚洲欧美激情| 久久青草综合色| 九草在线视频观看| 午夜福利影视在线免费观看| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 国产精品99久久99久久久不卡 | 制服丝袜香蕉在线| 乱系列少妇在线播放| 午夜日本视频在线| 如何舔出高潮| 99久久中文字幕三级久久日本| 国产成人a区在线观看| 有码 亚洲区| 久久亚洲国产成人精品v| 超碰av人人做人人爽久久| 久久久久国产网址| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 永久网站在线| 亚洲人与动物交配视频| 国产精品成人在线| 国产91av在线免费观看| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 亚洲人成网站高清观看| 日韩强制内射视频| 九草在线视频观看| 中文字幕精品免费在线观看视频 | 亚洲精品中文字幕在线视频 | 国产国拍精品亚洲av在线观看| 亚洲人成网站在线观看播放| av国产精品久久久久影院| 波野结衣二区三区在线| 精品一区二区三区视频在线| 街头女战士在线观看网站| 晚上一个人看的免费电影| 亚洲av成人精品一二三区| 亚洲人成网站高清观看| 激情 狠狠 欧美| 伊人久久精品亚洲午夜| 一本久久精品| 亚洲精品视频女| 香蕉精品网在线| 亚洲综合色惰| 久久婷婷青草| 嫩草影院新地址| 成人免费观看视频高清| 久久国内精品自在自线图片| 这个男人来自地球电影免费观看 | 亚洲精品第二区| 精品人妻视频免费看| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 我的女老师完整版在线观看| 赤兔流量卡办理| 视频中文字幕在线观看| 欧美区成人在线视频| 亚洲国产精品成人久久小说| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 成年av动漫网址| 久久久久视频综合| 日韩在线高清观看一区二区三区| 91精品国产国语对白视频| 日本-黄色视频高清免费观看| 黄色视频在线播放观看不卡| 国产一区二区三区av在线| 久久久久久久大尺度免费视频| 色吧在线观看| 亚洲人成网站在线观看播放| 日韩国内少妇激情av| 啦啦啦在线观看免费高清www| 国产色爽女视频免费观看| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 亚洲成人一二三区av| 在线观看免费日韩欧美大片 | 午夜日本视频在线| 国产精品久久久久久久久免| 国产成人免费观看mmmm| 免费看不卡的av| 91精品国产国语对白视频| 日本黄大片高清| 色视频www国产| 久久久成人免费电影| 亚洲三级黄色毛片| 精品少妇久久久久久888优播| 99精国产麻豆久久婷婷| 水蜜桃什么品种好| 26uuu在线亚洲综合色| 国产色爽女视频免费观看| 精品一区在线观看国产| 一个人看的www免费观看视频| 男人爽女人下面视频在线观看| 91aial.com中文字幕在线观看| av黄色大香蕉| 国产高清国产精品国产三级 | 五月天丁香电影| 黄片无遮挡物在线观看| 中文在线观看免费www的网站| 精品一区在线观看国产| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 国产精品久久久久久精品电影小说 | 亚洲精品日韩在线中文字幕| 午夜福利视频精品| 大话2 男鬼变身卡| 久久午夜福利片| 麻豆成人av视频| xxx大片免费视频| 国产淫语在线视频| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91 | 女的被弄到高潮叫床怎么办| 亚洲av成人精品一二三区| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 亚洲av成人精品一二三区| 亚洲av综合色区一区| 日本色播在线视频| 亚洲国产精品国产精品| 亚洲av福利一区| 97超碰精品成人国产| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 人妻一区二区av| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 久久亚洲国产成人精品v| 国产一区二区三区av在线| 韩国高清视频一区二区三区| 久久99蜜桃精品久久| 欧美3d第一页| 亚洲天堂av无毛| 国产一级毛片在线| 一本色道久久久久久精品综合| 国产精品不卡视频一区二区| 精品久久久精品久久久| av在线观看视频网站免费| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 丰满乱子伦码专区| 大陆偷拍与自拍| 精品一区二区三区视频在线| 日韩av在线免费看完整版不卡| 秋霞在线观看毛片| 国产永久视频网站| 麻豆成人午夜福利视频| 三级国产精品欧美在线观看| a级毛色黄片| 精品久久久久久电影网| 免费少妇av软件| 成人漫画全彩无遮挡| 欧美激情极品国产一区二区三区 | 久久久久久人妻| 在线观看三级黄色| 午夜免费男女啪啪视频观看| 国产成人免费无遮挡视频| 亚洲色图av天堂| 亚洲四区av| freevideosex欧美| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 国产精品人妻久久久影院| 欧美高清成人免费视频www| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 欧美变态另类bdsm刘玥| 欧美一区二区亚洲| 岛国毛片在线播放| 好男人视频免费观看在线| 1000部很黄的大片| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 亚洲av男天堂| 国产av一区二区精品久久 | 乱系列少妇在线播放| 亚洲成人中文字幕在线播放| 精品人妻一区二区三区麻豆| 夫妻午夜视频| 日韩国内少妇激情av| 一区二区三区乱码不卡18| av在线蜜桃| 日韩 亚洲 欧美在线| 国产黄频视频在线观看| 亚洲精品一区蜜桃| 日韩av免费高清视频| 麻豆成人av视频| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 91久久精品电影网| 亚洲av综合色区一区| 亚洲综合色惰| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 久久久久久久精品精品| 欧美日韩综合久久久久久| 国产美女午夜福利| 欧美日韩精品成人综合77777| av在线老鸭窝| 成人漫画全彩无遮挡| 夫妻性生交免费视频一级片| 黄色视频在线播放观看不卡| 观看av在线不卡| 中文在线观看免费www的网站| 国国产精品蜜臀av免费| 国产精品99久久久久久久久| 性色avwww在线观看| 午夜日本视频在线| 九九爱精品视频在线观看| 一边亲一边摸免费视频| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 视频中文字幕在线观看| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 亚洲va在线va天堂va国产| 身体一侧抽搐| 国产精品国产三级国产专区5o| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 国产精品久久久久久精品古装|