溴化1-辛基-3-甲基咪唑聚集狀態(tài)對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)晶的影響研究

于筱溪，閆真真，蔣其輝，吳霞，張余曉，王曉娟，黃方，3

（1 中國(guó)石油大學(xué)（華東）化學(xué)工程學(xué)院，山東青島 266580；2 中國(guó)石油集團(tuán)工程技術(shù)研究院有限公司井下作業(yè)研究所，北京 102206；3 中國(guó)石油大學(xué)（華東）重質(zhì)油國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島 266580）

引言

蛋白質(zhì)結(jié)晶是生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。蛋白質(zhì)晶體具有較高的孔隙率和生物相容性[1],在藥物輸送、生物傳感和生物催化等方面有著潛在的應(yīng)用可能;此外,蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)是藥物設(shè)計(jì)的前提[2],X 射線衍射是現(xiàn)階段解析蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的主要手段之一[3],高質(zhì)量蛋白質(zhì)晶體的培養(yǎng)是這一技術(shù)的關(guān)鍵。由此可見(jiàn),蛋白質(zhì)結(jié)晶過(guò)程對(duì)蛋白質(zhì)工程、藥物設(shè)計(jì)[4]和藥物輸送等領(lǐng)域都有著舉足輕重的地位。

由于蛋白質(zhì)分子量大,對(duì)環(huán)境極度敏感,蛋白質(zhì)分子的有序聚集過(guò)程難度大且不易控制[5]。諸多研究表明,在結(jié)晶體系中加入小分子添加劑有助于蛋白質(zhì)分子聚集成核[6],離子液體就是其中的一種[7]。離子液體由陽(yáng)離子和陰離子組成,其生物相容性高,結(jié)構(gòu)具有很大的設(shè)計(jì)性[8]。將離子液體作為添加劑引入蛋白質(zhì)結(jié)晶過(guò)程,能夠顯著提高晶體尺寸,優(yōu)化晶體的衍射質(zhì)量[9],在蛋白質(zhì)結(jié)晶的研究領(lǐng)域越來(lái)越受到關(guān)注。Chen 等[10]通過(guò)在溶菌酶結(jié)晶溶液中添加1,3-丁基咪唑氯化物,得到尺寸大、衍射質(zhì)量高的溶菌酶晶體。Judge 等[11]證明了用離子液體作為添加劑后,過(guò)氧化氫酶、肌紅蛋白、胰蛋白酶、葡萄糖異構(gòu)酶等晶體的X 射線衍射分辨率優(yōu)于沒(méi)有添加離子液體的蛋白質(zhì)晶體。本文選擇溴化1-辛基-3-甲基咪唑([C8mim]Br)作為添加劑。作為化學(xué)反應(yīng)中優(yōu)良的綠色替代溶劑，咪唑類(lèi)離子液體有較高的生物相容性和低毒性[12]。從化學(xué)結(jié)構(gòu)上看，[C8mim]Br 的溶解性好，具有類(lèi)似陽(yáng)離子表面活性劑的咪唑親水基團(tuán)和疏水烷基鏈，是一類(lèi)新型表面活性劑[8]；Zheng 等[13]發(fā)現(xiàn)，咪唑類(lèi)離子液體的表面活性?xún)?yōu)于同碳鏈長(zhǎng)度的傳統(tǒng)表面活性劑。因此[C8mim]Br 在溶液中能夠有序聚集[14]，根據(jù)溶液性質(zhì)的不同可以形成膠束、液晶、凝膠、囊泡或微乳液等，拓展了傳統(tǒng)表面活性劑的聚集特征[15]。由此可知，離子液體[C8mim]Br 與蛋白質(zhì)之間的相互作用較為復(fù)雜，可能改變蛋白質(zhì)的構(gòu)象與聚集狀態(tài)[16]，影響蛋白質(zhì)的結(jié)晶過(guò)程。選擇溶菌酶為研究對(duì)象，研究了[C8mim]Br 聚集狀態(tài)對(duì)溶菌酶結(jié)晶的影響，通過(guò)測(cè)定溶菌酶結(jié)晶熱力學(xué)與動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)，采用動(dòng)態(tài)光散射監(jiān)測(cè)溶液中聚集體的變化趨勢(shì)，利用ζ-電勢(shì)考察離子液體與蛋白質(zhì)之間的相互作用，對(duì)離子液體對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)晶過(guò)程的影響機(jī)制進(jìn)行了探討。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

雞蛋白溶菌酶，購(gòu)自上海西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司；溴化1-辛基-3-甲基咪唑([C8mim]Br)，購(gòu)自上海成捷化學(xué)有限公司，純度99%；溶壁微球菌粉，購(gòu)自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院；氯化鈉(分析純)；乙酸(分析純)；氫氧化鈉(分析純)，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

倒置熒光顯微鏡，上海徠卡顯微系統(tǒng)貿(mào)易有限公司；納米粒度分析儀，英國(guó)馬爾文儀器有限公司；紫外分光光度計(jì)，上海島津儀器有限公司；恒溫水浴槽,上海先歐科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 溶菌酶的結(jié)晶 溶菌酶結(jié)晶采用分批結(jié)晶法：依次吸取100 μl溶菌酶溶液(20、28、36、40 mg/ml)、100 μl 氯化鈉溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%)、10 μl 不同濃度的[C8mim]Br 溶液置于96 孔細(xì)胞板中，4℃下結(jié)晶。所有溶液均在pH4.5、0.1 mol/L 的乙酸鈉緩沖溶液中配制。

1.3.2 溶菌酶活性測(cè)定 溶菌酶活性檢測(cè)方法參考文獻(xiàn)[17]的溶菌酶活性簡(jiǎn)易測(cè)定，以無(wú)菌操作方式，將溶壁微球菌種子菌液按照1∶100 的比例接種至100 ml LB 液體培養(yǎng)基中，進(jìn)行菌株的擴(kuò)大培養(yǎng)，在37℃搖床中培養(yǎng)至450 nm 處吸光度值為1.300±0.010 的菌懸液。使用1 cm 光徑4 ml 容量的比色皿，吸取2.5 ml 450 nm 處吸光度值為1.300±0.010的菌懸液，加入0.5 ml 相應(yīng)酶反應(yīng)液(溶菌酶溶液、溶菌酶與離子液體的混合溶液)混勻立即計(jì)時(shí)，于25℃分別記錄10 s 和70 s 時(shí)450 nm 處吸光度值A(chǔ)1和A2，并計(jì)算其差值的絕對(duì)值。檢測(cè)前采用相應(yīng)的緩沖液調(diào)零。

1.3.3 溶菌酶溶解度測(cè)定 配制一系列已知濃度的溶菌酶系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，利用紫外分光光度計(jì)，測(cè)量其在280 nm 處的吸光值，繪制溶菌酶濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。配制一系列[C8mim]Br濃度梯度溶菌酶懸浮液，在4℃下溫和攪拌至溶液達(dá)到平衡，取200 μl平衡懸浮液離心(14000 r/min、15 min)，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)上清液在280 nm 處的吸光度值，計(jì)算溶菌酶在此條件下的平衡濃度。

1.3.4 溶菌酶結(jié)晶動(dòng)力學(xué)測(cè)定 配制一系列[C8mim]Br 濃度梯度溶菌酶結(jié)晶溶液，迅速降溫至4℃并保持恒溫，每隔2 h 取500 μl 溶液離心(14000 r/min、15 min)，將上清液稀釋20倍，利用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)上清液在280 nm 處的吸光度值，得到溶菌酶溶液濃度隨結(jié)晶時(shí)間的變化曲線。

1.3.5 結(jié)晶溶液中分子聚集狀態(tài)表征 配制一定濃度(大于1 mg/ml)的溶菌酶溶液、[C8mim]Br 溶液以及溶菌酶-[C8mim]Br 混合溶液，通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射對(duì)溶液中的分子聚集體粒徑進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定前所有溶劑需采用0.22 μm 膜過(guò)濾。將動(dòng)態(tài)光散射所測(cè)量的相關(guān)曲線與指數(shù)函數(shù)模型擬合，可計(jì)算出擴(kuò)散系數(shù)(D)，進(jìn)一步運(yùn)用Stokes-Einstein 方程[18]，可得流體力學(xué)直徑，即聚集體的粒徑。Stokes-Einstein 方程可用式(1)表示:

式中，DH表示流體力學(xué)直徑；k表示Boltzmann常數(shù)；f表示粒子摩擦系數(shù)；η表示溶劑黏度；T表示熱力學(xué)溫度；D表示擴(kuò)散系數(shù)。

1.3.6 溶菌酶溶液ζ-電勢(shì)測(cè)定 配制不同濃度的[C8mim]Br-溶菌酶混合溶液，用0.22 μm 膜過(guò)濾，4℃下靜置一周，待溶液體系穩(wěn)定，利用納米粒度分析儀測(cè)定溶液中的聚集體表面ζ-電勢(shì)。通過(guò)Henry方程計(jì)算ζ-電勢(shì)[19]，Henry方程可用式(2)表示：

式中，z表示ζ-電勢(shì)；UE表示電泳遷移率；ε表示介電常數(shù)；η表示黏度；f(ka)表示Henry 函數(shù)，對(duì)本研究體系取1.5。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 ［C8mim］Br對(duì)溶菌酶晶體形貌和數(shù)量的影響

溶菌酶晶體的顯微鏡形貌如圖1所示。圖1（a）為無(wú)[C8mim]Br存在時(shí)的晶體形貌，晶體表面存在明顯缺陷，且晶體尺寸不均一；加入[C8mim]Br后，晶體表面形貌明顯改善，缺陷減少，晶體尺寸更加均一，如圖1（b）～（f）所示。由此可見(jiàn)，[C8mim]Br 的加入對(duì)溶菌酶晶體形貌有改善作用。此外，[C8mim]Br的加入對(duì)晶體數(shù)量也有影響。與無(wú)添加劑時(shí)的結(jié)晶過(guò)程相比，加入低濃度[C8mim]Br(＜0.06 mol/L)時(shí)，晶體數(shù)量略有減少；[C8mim]Br 加入量超過(guò)0.1 mol/L 后，晶體數(shù)量明顯減少；當(dāng)[C8mim]Br 濃度超過(guò)0.3 mol/L后，晶體數(shù)量變化不大，如圖2所示。

圖1 溶菌酶晶體顯微鏡形貌圖（比例尺:100 μm）Fig.1 Microgscope photos of lysozyme crystals(scale bars：100 μm)

圖2 不同濃度[C8mim]Br下溶菌酶晶體數(shù)量Fig.2 Numbers of lysozyme crystals under different[C8mim]Br concentration

2.2 離子液體對(duì)溶菌酶活性的影響

采用比濁法，以溶壁微球菌為底物檢測(cè)離子液體對(duì)溶菌酶活性的影響，結(jié)果如圖3 所示。定義室溫25℃下，1 mg/ml 的溶菌酶溶液為標(biāo)準(zhǔn)樣，其酶活為1。實(shí)驗(yàn)表明，加入不同濃度的[C8mim]Br 對(duì)溶菌酶的活性基本無(wú)影響。

圖3 不同濃度[C8mim]Br下溶菌酶活性Fig.3 Lysozyme activity ratio under different[C8mim]Br concentration

2.3 ［C8mim］Br對(duì)溶菌酶溶解度的影響

蛋白質(zhì)的溶解度決定了過(guò)飽和度，影響著晶體的成核速率和生長(zhǎng)速率[20]。測(cè)定了添加[C8mim]Br后的溶菌酶溶解度，結(jié)果如圖4所示。圖中顯示，當(dāng)[C8mim]Br濃度＜0.1mol/L時(shí)，溶菌酶的溶解度幾乎沒(méi)有變化；隨著[C8mim]Br濃度的增加(＞0.1 mol/L)，溶菌酶的溶解度開(kāi)始增加，[C8mim]Br 濃度超過(guò)0.3 mol/L后，溶解度增加趨勢(shì)減慢。對(duì)溶菌酶而言，整個(gè)蛋白質(zhì)分子由內(nèi)到外，疏水殘基逐漸減少，親水殘基不斷增多[21]。高濃度[C8mim]Br 在溶菌酶溶液中聚集形成膠束，與溶菌酶相互作用，使溶菌酶的構(gòu)象發(fā)生一定變化。溶菌酶表面親水殘基增多，疏水性降低[22]，因此，在高濃度(＞0.1 mol/L)的[C8mim]Br 中，溶解度增大。

圖4 不同濃度[C8mim]Br下溶菌酶溶解度Fig.4 Solubility of lysozyme under different[C8mim]Br concentration

2.4 ［C8mim］Br對(duì)溶菌酶結(jié)晶動(dòng)力學(xué)的影響

不同濃度的[C8mim]Br 下結(jié)晶30 h 溶菌酶濃度變化趨勢(shì)如圖5 所示，初始狀態(tài)(0 h)時(shí)的蛋白質(zhì)濃度保持一致。由圖5 可知，低[C8mim]Br 濃度下(0.02 mol/L 和0.06 mol/L 時(shí))，[C8mim]Br 加入后溶菌酶濃度下降過(guò)程比0 mol/L時(shí)更快，說(shuō)明此時(shí)[C8mim]Br 對(duì)溶菌酶的結(jié)晶有促進(jìn)作用；隨著[C8mim]Br 濃度的增加(＞0.1 mol/L)，溶菌酶濃度的下降過(guò)程比0 mol/L 時(shí)更慢，結(jié)晶有所緩慢；[C8mim]Br 濃度超過(guò)0.3 mol/L后，濃度變化趨勢(shì)差別不大，與晶體數(shù)量和溶解度數(shù)據(jù)相對(duì)應(yīng)。由溶解度數(shù)據(jù)可知，高濃度[C8mim]Br 下，溶菌酶溶解度升高。因此，與0 mol/L相比，當(dāng)初始濃度一致時(shí)，過(guò)飽和度降低，結(jié)晶速率降低。低濃度[C8mim]Br下，盡管過(guò)飽和度與0 mol/L相近，但結(jié)晶速率存在差異，可能與[C8mim]Br 的存在狀態(tài)有關(guān)。由此可見(jiàn)，[C8mim]Br的聚集狀態(tài)對(duì)溶菌酶的結(jié)晶過(guò)程有重要的影響。

圖5 不同濃度[C8mim]Br下溶菌酶結(jié)晶動(dòng)力學(xué)Fig.5 Lysozyme crystallization kinetics under different[C8mim]Br concentration

2.5 ［C8mim］Br與溶菌酶的作用機(jī)制

溶菌酶是一種球形親水性蛋白質(zhì)[23]，分子量在14×103左右，含有18個(gè)陽(yáng)離子氨基酸和12個(gè)陰離子氨基酸[24]。溶菌酶的穩(wěn)定性主要來(lái)源于氨基酸殘基之間的氫鍵和疏水作用[25]。因此，可以通過(guò)測(cè)定溶菌酶溶液中聚集狀態(tài)及其表面電勢(shì)來(lái)探究離子液體與蛋白質(zhì)的相互作用[26]。

圖6 表示不同濃度[C8mim]Br 下溶菌酶溶液的平均ζ-電勢(shì)。隨著[C8mim]Br濃度的增加，溶菌酶溶液的聚集體ζ-電勢(shì)變化呈現(xiàn)出三個(gè)階段。第一階段([C8mim]Br濃度0～0.04 mol/L)，隨著[C8mim]Br濃度的升高，溶菌酶表面ζ-電勢(shì)升高；第二階段([C8mim]Br 濃度0.04～0.1 mol/L)溶菌酶表面ζ-電勢(shì)急劇下降；第三階段([C8mim]Br 濃度0.1～0.7 mol/L)，溶液平均ζ-電勢(shì)緩慢下降至穩(wěn)定不變。

圖6 不同濃度[C8mim]Br下溶菌酶聚集體ζ-電勢(shì)Fig.6 The ζ-potential of lysozyme under different[C8mim]Br concentration

在第一階段，[C8mim]+濃度低，以單體形式存在，溶菌酶分子表面的疏水殘基與溶液中游離的[C8mim]+發(fā)生相互作用[27]，使得溶菌酶表面ζ-電勢(shì)增加，此時(shí)，[C8mim]+與溶菌酶分子間主要為疏水作用[28]。在第二階段，溶液中的[C8mim]+濃度升高，更多[C8mim]+通過(guò)疏水作用集中在溶菌酶分子表面，此時(shí)部分[C8mim]+自發(fā)聚集形成不穩(wěn)定的“半膠束”狀態(tài)[26]，因此溶菌酶表面ζ-電勢(shì)出現(xiàn)急劇下降。這一階段[C8mim]+與溶菌酶分子間依然以疏水作用為主。疏水作用對(duì)維持蛋白質(zhì)穩(wěn)定性至關(guān)重要[25]，[C8mim]+通過(guò)疏水相互作用與溶菌酶的疏水殘基相互融合，使溶菌酶分子表面疏水性略有增加。盡管溶解度幾乎不變，表面疏水性的改變可以促進(jìn)蛋白質(zhì)分子間的聚集，提高溶菌酶的結(jié)晶速率[29]。因此，當(dāng)[C8mim]Br 濃度較低(＜0.1 mol/L)時(shí)，溶菌酶的結(jié)晶過(guò)程加快。

第三階段，溶液內(nèi)[C8mim]+濃度持續(xù)升高至臨界膠束濃度，[C8mim]+自發(fā)聚集成膠束，溶液的平均ζ-電勢(shì)持續(xù)降低。由于溶液中游離的Br-濃度增加，與溶菌酶表面的雙電子層發(fā)生靜電作用；此外，實(shí)驗(yàn)測(cè)得[C8mim]+膠束自身ζ-電勢(shì)約為5 mV，因此，隨著[C8mim]+膠束濃度的升高，溶液的平均ζ-電勢(shì)進(jìn)一步降低。由于溶液中溶菌酶分子數(shù)量保持不變，隨著[C8mim]Br的增加，[C8mim]Br與溶菌酶分子間的相互作用位點(diǎn)達(dá)到飽和[30]，因此在最后階段表現(xiàn)出ζ-電勢(shì)穩(wěn)定不變，與文獻(xiàn)中報(bào)道的趨勢(shì)一致[26]。由此可見(jiàn)，[C8mim]Br 與溶菌酶分子間的作用方式與[C8mim]Br的聚集狀態(tài)有關(guān)。

蛋白質(zhì)成核過(guò)程是分子進(jìn)行有序聚集然后形成穩(wěn)定團(tuán)簇的過(guò)程，是蛋白質(zhì)結(jié)晶的決定階段[31]。實(shí)驗(yàn)表明，[C8mim]Br 與溶菌酶之間的相互作用與[C8mim]Br的聚集狀態(tài)有關(guān)，因此通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射分別考察了溶液中溶菌酶與[C8mim]Br的聚集狀態(tài)，如圖7所示。結(jié)果表明，[C8mim]Br溶液在濃度0.15 mol/L時(shí)，開(kāi)始形成直徑約為3 nm 的聚集體，符合球狀膠束特征，與文獻(xiàn)中的臨界膠束濃度相接近[32]，聚集體的尺寸隨著[C8mim]Br的濃度增加而增加，如圖7（a）所示?？梢宰C明，高濃度的[C8mim]Br在溶液中能夠形成膠束聚集體。

圖7 [C8mim]Br溶液中聚集體粒徑分布(a);結(jié)晶溶液中聚集體粒徑分布(b)Fig.7 Particle size distribution of aggregates in[C8mim]Br solution(a);Particle size distribution of aggregates in crystallization solution with protein and[C8mim]Br(b)

如圖7（b）紅色曲線所示，溶菌酶純?nèi)芤褐蟹肿泳奂w尺寸約為5 nm，與溶菌酶二聚體的尺寸相當(dāng)。加入0.02 mol/L [C8mim]Br 后，聚集體尺寸略有增加[圖7(b)黑色曲線]，說(shuō)明有少量基團(tuán)聚集在溶菌酶表面，導(dǎo)致溶菌酶聚集體尺寸變大，與ζ-電勢(shì)的結(jié)果相吻合。

圖7（b）藍(lán)色與綠色曲線分別表示加入0.15 mol/L與0.3 mol/L[C8mim]Br后溶液中的聚集狀態(tài)。溶液中出現(xiàn)了3 nm左右和6 nm左右的兩種聚集體。3 nm處的峰表示溶菌酶單體[33]，而6 nm 處的峰表示溶菌酶-[C8mim]Br 膠束復(fù)合物。高濃度下，[C8mim]+自發(fā)形成的膠束可以與溶菌酶分子發(fā)生相互作用形成溶菌酶-[C8mim]Br 膠束復(fù)合物，使得部分溶菌酶分子解聚為單體，因此出現(xiàn)了兩種類(lèi)型的聚集體。

圖8 所示為成核階段溶液聚集體的尺寸變化。曲線A 和B 分別表示加入0.3 mol/L [C8mim]Br 以及無(wú)[C8mim]Br 時(shí)的聚集體尺寸變化，可以看出加入0.3 mol/L[C8mim]Br后的聚集體尺寸明顯增大，約為無(wú)[C8mim]Br 時(shí)的聚集體尺寸兩倍。根據(jù)蛋白質(zhì)結(jié)晶兩步成核理論，溶液中的溶質(zhì)分子會(huì)首先聚集形成無(wú)序聚集體，當(dāng)聚集體達(dá)到一定程度之后，會(huì)重新排列成有序狀態(tài)，形成有序排列的晶核[34]。研究表明，對(duì)溶菌酶成核過(guò)程，聚集體的基本單元為八聚體[35]。結(jié)合圖7（b）的結(jié)果，可以推測(cè)，在無(wú)[C8mim]Br存在時(shí)，溶液中的溶菌酶分子首先形成聚集體，隨后重新排列形成晶核；與之相對(duì)，加入0.3 mol/L[C8mim]Br后，溶液中的溶菌酶首先解聚與[C8mim]Br膠束形成溶菌酶-[C8mim]Br 膠束復(fù)合物，隨后以溶菌酶-[C8mim]Br 膠束復(fù)合物為基本單元形成聚集體，進(jìn)而成核。因此，與無(wú)[C8mim]Br 存在時(shí)相比，成核過(guò)程速率較慢，晶核數(shù)量較少。曲線C 和D 分別表示溶液中只含有溶菌酶與[C8mim]Br(不含沉淀劑)時(shí)聚集體的尺寸變化，可以看出隨著時(shí)間的增加，聚集體的尺寸穩(wěn)定不變，說(shuō)明溶菌酶-[C8mim]Br膠束復(fù)合物可以較長(zhǎng)時(shí)間保持穩(wěn)定，且單獨(dú)離子液體[C8mim]Br 并不能作為溶菌酶結(jié)晶過(guò)程的沉淀劑。

圖8 成核階段聚集體尺寸變化Fig.8 Aggregates change during induction period

3 結(jié)論

本文研究了以離子液體[C8mim]Br 為添加劑時(shí)溶菌酶的結(jié)晶過(guò)程。[C8mim]Br作為添加劑能明顯改善溶菌酶晶體形貌。[C8mim]Br對(duì)結(jié)晶過(guò)程的影響隨添加的濃度改變。[C8mim]Br濃度較低(＜0.1 mol/L)時(shí)對(duì)溶菌酶的結(jié)晶過(guò)程有促進(jìn)作用，而高濃度[C8mim]Br(＞0.1 mol/L)可以減緩溶菌酶的結(jié)晶過(guò)程。研究表明，當(dāng)濃度超過(guò)0.15 mol/L 時(shí)，[C8mim]Br可以在溶液中形成膠束聚集體，故[C8mim]Br 的作用機(jī)制與[C8mim]Br 的聚集狀態(tài)有關(guān)。當(dāng)[C8mim]Br 濃度較低時(shí)(＜0.1 mol/L)，[C8mim]Br 以單分子形式與溶菌酶發(fā)生疏水作用，促進(jìn)溶菌酶分子聚集，提高結(jié)晶速率。當(dāng)[C8mim]Br濃度增加時(shí)，[C8mim]Br開(kāi)始與溶菌酶分子形成復(fù)合聚集體，并以該聚集體為基本單元形成無(wú)序聚集體，進(jìn)而成核，故晶核數(shù)量減少，成核速率減慢。