黑蒜多糖的超聲波輔助提取及其降血糖作用研究

侯演林，李天嬌，李 慧，羊璽月，丁予虹，鄒潤琪，程碧君

（吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，吉林吉林 132101）

大蒜為百合科植物蔥蒜屬蒜的地下根莖，含有豐富的營養(yǎng)元素，但口味辛辣，大蒜發(fā)酵制品如黑蒜能減輕辛辣口感。黑蒜是新鮮大蒜在溫度為40～45 ℃，高濕度的發(fā)酵箱中發(fā)酵60～90 d 制成的。大蒜通過自體酶發(fā)生美拉德反應(yīng)在高濕條件下制成黑蒜[1]，黑蒜保留了鮮蒜的營養(yǎng)成分（如蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素等），同時(shí)減輕了鮮蒜的辛辣刺激，具有很好的抗氧化[2-3]、降血糖、降血脂和殺菌消炎[4]等生理功能。

黑蒜中豐富的營養(yǎng)成分及特有的多糖結(jié)構(gòu)使黑蒜具有降血糖、降血脂、抗疲勞、抗氧化等功效[5-7]；黑蒜多糖所含的硫酸基和糖醛酸使其具有較強(qiáng)的抗氧化能力[8]。近年來糖尿病發(fā)病率逐年升高，注射胰島素對(duì)人體有明顯副作用，黑蒜多糖降血糖的研究報(bào)告相對(duì)較少，因此探討黑蒜多糖的降血糖作用非常必要。本實(shí)驗(yàn)通過改進(jìn)水提醇沉的方法加以超聲波輔助提取黑蒜多糖的工藝來提高多糖提取率[9-12]，超聲波將黑蒜細(xì)胞壁破碎及引起次級(jí)效應(yīng)，加快還原糖溶出，使提取液中還原糖的含量升高[13-14]。

本研究擬用有機(jī)溶劑無水乙醇溶解提取物中的脂溶性雜質(zhì)來提高多糖提取率[15]。提取的黑蒜多糖溶于水制成不同濃度的溶液，用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[16]，探究黑蒜多糖的降血糖作用，為促進(jìn)黑蒜保健食品的開發(fā)、拓展黑蒜的應(yīng)用范圍提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

JJ-124BF 型電子天平，常熟市雙杰測(cè)試儀器廠；超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；TG-WS 型臺(tái)式高速離心機(jī)，上海豫明儀器有限公司；HH-6 恒溫水浴鍋，上海力辰邦西儀器科技有限公司；S1411C 干燥箱，日本Yamato（雅馬拓）大和株式會(huì)社；LW-2008 低溫超聲波萃取儀，上海利聞科學(xué)儀器有限公司；多功能粉碎機(jī)，永康市久品工貿(mào)有限公司；血糖儀、試紙、針頭，杭州微泰醫(yī)療器械有限公司。

1.2 材料與試劑

黑蒜，山東金鄉(xiāng)縣久紅食品有限公司。

無水乙醇、甲醇、蔗糖，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；氫化可的松，華中藥業(yè)股份有限公司；三氯甲烷，天津市永大化學(xué)試劑有限公司；正丁醇，天津市大茂化學(xué)試劑廠。以上試劑均為分析純。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 試驗(yàn)流程

黑蒜→切塊粉碎（過60 目篩）→脫脂→超聲波輔助提取→黑蒜多糖含量測(cè)定→離心提取上清液→濃縮→蛋白除雜→酒精沉淀→離心取沉淀→干燥→高糖小鼠模型的建立→小鼠灌胃30 d→測(cè)定血糖[17]。

1.3.2 黑蒜多糖的超聲波輔助提取

將黑蒜去皮后切片，用蒸餾水沖洗2 min，干燥箱內(nèi)60 ℃干燥24 h，冷卻至室溫，粉碎，過60 目篩，將過篩后的黑蒜粉末用三氯甲烷∶甲醇（2∶1）混合溶液浸泡2 h，浸泡2 次，進(jìn)行除脂。過濾，收集沉淀物，精密稱取20 g沉淀物于錐形瓶中，加入100 mL 蒸餾水，按照料液比1∶10（g/mL）、提取溫度55 ℃、提取時(shí)間30 min、超聲功率400 W 進(jìn)行提取。將超聲提取后的樣品經(jīng)九層紗布過濾，將濾液濃縮至五分之一成為濃縮液，加入濃縮液3 倍體積的sevage 試劑（氯仿∶正丁醇=5∶1），除去濃縮液體中的蛋白。將混合液體在3 500 r/min 離心10 min，離心3 次，離心沉淀物加入3 倍于濃縮液體積的無水乙醇，進(jìn)行沉淀放置12 h 后，將上清液扔掉，并將剩余沉淀物在4 200 r/min 下離心15 min，用無水乙醇洗滌沉淀物3次，沉淀物置于55 ℃恒溫干燥箱中干燥12 h 至恒質(zhì)量，得到黑蒜多糖[18]。用電子天平進(jìn)行精確稱量，記錄數(shù)據(jù)。

1.3.3 黑蒜多糖提取率測(cè)定

采用苯酚-硫酸法測(cè)定黑蒜多糖的提取率。量取10 mg/mL 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL，分別定容至100 mL 容量瓶中，量取2 mL 標(biāo)準(zhǔn)液向其中加入1 mL 6%苯酚溶液和4 mL 濃硫酸溶液，置于40 ℃水浴鍋中40 min 后，冷卻至室溫，用紫外分光光度計(jì)在490 nm 下測(cè)定吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

配制黑蒜多糖供試液，按照式（1）（2）計(jì)算黑蒜多糖提取率。

式中，c-多糖中葡萄糖濃度，mg/mL；V-定容的體積，mL；n-溶液稀釋倍數(shù)；m-黑蒜粉末質(zhì)量，g。

1.3.4 單因素試驗(yàn)

分別進(jìn)行料液比、提取時(shí)間、提取溫度、超聲功率四個(gè)因素對(duì)黑蒜多糖提取率影響的單因素試驗(yàn)。準(zhǔn)確稱取20 g 處理后的黑蒜粉末，在55 ℃、400 W 的條件下提取30 min，料液比設(shè)置為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25（g/mL），以黑蒜多糖提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，優(yōu)化料液比。同理，提取時(shí)間分別設(shè)定為20、25、30、35、40 min，提取溫度分別設(shè)定為45、50、55、60、65 ℃，超聲功率分別設(shè)定為250、300、350、400、450 W，計(jì)算黑蒜多糖的提取率。

1.3.5 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)料液比、提取時(shí)間、提取溫度、超聲功率這4 個(gè)因素進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

表1 黑蒜多糖超聲輔助提取的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Orthogonal test design for assisted ultrasonic extraction of black garlic polysaccharide

1.4 黑蒜多糖的降血糖作用研究

1.4.1 高血糖小鼠動(dòng)物模型的建立

采用高血糖飼料（70%鼠飼料、15%氫化可的松、15%蔗糖）飼養(yǎng)小鼠，每組6 只試驗(yàn)小鼠，同時(shí)飲用15%的蔗糖水溶液輔助促進(jìn)小鼠血糖的升高。經(jīng)血糖儀測(cè)定高血糖小鼠血糖平均值大于6.9 mmol/L 時(shí)，符合高血糖條件（正常小鼠血糖值為5.6 mmol/L），此時(shí)完成了高血糖小鼠動(dòng)物模型的建立。

1.4.2 動(dòng)物試驗(yàn)

選取昆明小鼠30 只，要求肢體完好、健康活潑、體質(zhì)量20～25 g，對(duì)體質(zhì)量進(jìn)行稱量并記錄，全部為雄鼠，隨機(jī)分配。試驗(yàn)設(shè)多糖提取液低劑量組、中劑量組、高劑量組、高血糖對(duì)照組、空白組。低劑量組的黑蒜多糖溶液濃度為2 mg/mL，中劑量組為20 mg/mL，高劑量組為40 mg/mL，試驗(yàn)組中每只試驗(yàn)小鼠灌胃黑蒜多糖提取液1 mL，喂養(yǎng)高血糖飼料。高血糖對(duì)照組小鼠給予高血糖飼料喂養(yǎng)，作為黑蒜多糖對(duì)外界因素誘導(dǎo)動(dòng)物機(jī)體引發(fā)糖尿病保護(hù)作用的參照組?？瞻捉M不進(jìn)行黑蒜多糖提取液灌胃，只給予正常的飼料飼養(yǎng)，試驗(yàn)小鼠不攝入任何試驗(yàn)藥物。每天測(cè)量小鼠的血糖值，得到每組小鼠30 d 的平均血糖。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑蒜多糖含量測(cè)定

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到黑蒜多糖線性回歸方程：y=2.742x-0.006。黑蒜中黑蒜多糖含量為91.68 mg/g，符合本試驗(yàn)中對(duì)黑蒜中黑蒜多糖含量的要求，因此本產(chǎn)品黑蒜可用于試驗(yàn)。

2.2 黑蒜多糖提取方法的優(yōu)化

2.2.1 料液比對(duì)黑蒜多糖提取率的影響

從圖1 可以看出，隨著料液比的降低，黑蒜粗多糖提取率先升高后下降，當(dāng)料液比為1∶15（g/mL）時(shí)，黑蒜粗多糖提取率最高，為8.62%。因此，最佳料液比為1∶15（g/mL）。

圖1 料液比對(duì)黑蒜多糖提取率的影響Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on extraction rate of black garlic polysaccharide

2.2.2 提取時(shí)間對(duì)黑蒜多糖提取率的影響

由圖2 可得，隨著提取時(shí)間的延長，黑蒜多糖提取率呈先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)提取時(shí)間為35 min 時(shí)，多糖提取率達(dá)到最高，為8.85%。單因素試驗(yàn)顯示最佳提取時(shí)間為35 min，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)曲線為峰型圖，但在正交試驗(yàn)中選取適宜試驗(yàn)條件須同時(shí)考慮縮短試驗(yàn)時(shí)間，提取時(shí)間過長會(huì)使多糖水解，因此最佳提取時(shí)間為30min。

圖2 提取時(shí)間對(duì)黑蒜多糖提取率的影響Fig.2 Effect of extraction time on extraction rate of black garlic polysaccharide

2.2.3 提取溫度對(duì)黑蒜多糖提取率的影響

由圖3 可知，隨提取溫度的升高，多糖提取率呈先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)提取溫度為55 ℃時(shí)，達(dá)到峰值8.96%，因此，最適提取溫度為55 ℃。

圖3 提取溫度對(duì)黑蒜多糖提取率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on extraction rate of black garlic polysaccharide

2.2.4 超聲功率對(duì)黑蒜多糖提取率的影響

由圖4 可知，黑蒜多糖提取率隨超聲功率的增大先增大后減小，當(dāng)超聲功率為400 W 時(shí)，提取率最高，為9.35%，因此，最佳超聲功率為400 W。試驗(yàn)數(shù)據(jù)曲線為峰型圖，超聲功率過高，導(dǎo)致溶液中多糖反滲透進(jìn)入細(xì)胞壁中，使?jié)舛冉档?，因此，同時(shí)考慮節(jié)約能源，選取350 W作為正交試驗(yàn)中間量。

圖4 超聲功率對(duì)黑蒜多糖提取率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic power on extraction rate of black garlic polysaccharide

2.3 正交試驗(yàn)

由表2 可知，影響黑蒜多糖提取率的主次因素為D＞A＞C＞B，即超聲功率＞提取溫度＞提取時(shí)間＞料液比。最佳提取條件為A2B2C2D3，即提取溫度55 ℃，料液比1∶15，提取時(shí)間30 min，超聲功率400 W。經(jīng)驗(yàn)證試驗(yàn)，該條件下黑蒜多糖的平均提取率為9.37%，均優(yōu)于其他試驗(yàn)組。

表2 黑蒜多糖超聲輔助提取的正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Orthogonal test results for ultrasound-assisted extraction of black garlic polysaccharide

2.4 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

2.4.1 黑蒜多糖對(duì)高血糖小鼠血糖的影響

經(jīng)過30 d 的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，五組實(shí)驗(yàn)小鼠的血糖平均值如表3 所示。由表可知，在30 d 中，空白組實(shí)驗(yàn)小鼠血糖平均值為5.6 mmol/L，符合正常值范圍；高血糖對(duì)照組血糖為6.5 mmol/L，顯著高于正常值水平；低劑量組血糖為6.2 mmol/L，顯著高于空白組：中劑量組血糖為5.9 mmol/L，顯著高于空白對(duì)照組；高劑量組血糖為5.6 mmol/L，為正常值水平；由此可見高劑量組40 mg/mL 黑蒜多糖提取液，對(duì)外界因素誘導(dǎo)高血糖反應(yīng)具有明顯的保護(hù)作用。

表3 黑蒜多糖對(duì)高血糖小鼠血糖的影響Table 3 Effect of black garlic polysaccharide on blood sugar in hyperglycemia mice

2.4.2 黑蒜多糖對(duì)高血糖小鼠體質(zhì)量的影響

表4 為各組小鼠實(shí)驗(yàn)30 d 后體質(zhì)量的比較。由表知，空白組小鼠即正常小鼠質(zhì)量，高劑量組小鼠體質(zhì)量與空白組相同，均最高，為24 g，然后依次是中劑量組、低劑量組和高血糖對(duì)照組，其中低劑量組、高血糖對(duì)照組與空白對(duì)照組、高劑量組差異顯著。由此可知，高濃度黑蒜多糖提取液能促進(jìn)高血糖小鼠正常生理代謝，保持正常體質(zhì)量。

表4 黑蒜多糖對(duì)高血糖小鼠體質(zhì)量的影響Table 4 Effect of black garlic polysaccharide on the body mass of hyperglycemic mice

2.4.3 黑蒜多糖對(duì)高血糖小鼠肝質(zhì)量的影響

表5 為各組小鼠實(shí)驗(yàn)30 d 后肝質(zhì)量的比較。由表知，空白組小鼠肝質(zhì)量最高，為5.3 g，高劑量組小鼠肝質(zhì)量接近空白組，然后依次是中劑量組、低劑量組，高血糖對(duì)照組小鼠肝質(zhì)量值最低。根據(jù)實(shí)驗(yàn)可得，黑蒜多糖提取液可以促進(jìn)糖尿病小鼠對(duì)糖原正常吸收。綜上所述，40 mg/mL 的黑蒜多糖提取液對(duì)高血糖小鼠具有明顯保護(hù)作用，多糖提取液濃度為2～40 mg/mL 時(shí)，隨著提取液濃度逐漸增加，保護(hù)作用逐步增強(qiáng)。

表5 黑蒜多糖對(duì)高血糖小鼠肝質(zhì)量的影響Table 5 Effect of black garlic polysaccharide on liver quality in hyperglycemic mice

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)輔以超聲波產(chǎn)生的次級(jí)效應(yīng)和機(jī)械振動(dòng)，用水提醇沉的方法提取黑蒜多糖，研究了影響黑蒜多糖提取率的各個(gè)因素。經(jīng)測(cè)定該產(chǎn)品黑蒜中多糖含量為91.68 mg/g，符合實(shí)驗(yàn)要求。影響黑蒜多糖提取率的主次因素為超聲功率＞提取溫度＞提取時(shí)間＞料液比。最佳提取條件為提取溫度55 ℃，料液比1∶15（g/mL），提取時(shí)間30 min，超聲功率400 W，在此條件下，黑蒜多糖提取率為9.37%。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證黑蒜多糖對(duì)外界因素誘導(dǎo)高血糖動(dòng)物的保護(hù)作用，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)置五組，分別為空白組、高血糖對(duì)照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組。結(jié)果顯示，黑蒜多糖對(duì)外界因素誘導(dǎo)高血糖動(dòng)物具有保護(hù)作用，并且黑蒜多糖提取液濃度為40 mg/mL 時(shí)有顯著保護(hù)作用，經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)30 d 后，血糖平均值可達(dá)到5.6 mmol/L，符合正常小鼠血糖范圍。黑蒜作為大蒜的發(fā)酵食品對(duì)人體無任何副作用，且具有預(yù)防糖尿病，促進(jìn)機(jī)體維持正常血糖的生理功能，本研究為功能性食品黑蒜在降血糖方面的研究提供參考。