治療丙型肝炎藥物的研究進展

陳鐸之，郝小江

(中國科學院昆明植物研究所 植物化學與西部植物資源持續(xù)利用國家重點實驗室，云南 昆明 650201)

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)是引起急性與慢性肝臟疾病的主要病因.目前全球約有2億人感染HCV，其中80%患者會最終發(fā)展成為慢性肝炎甚至肝硬化、肝癌[1-3].目前尚無疫苗預防HCV感染.長效聚乙二醇I型干擾素(PEGIFN-α)和利巴韋林(RBV)聯(lián)合應用是近10年來治療丙肝的最佳藥物，但仍有50%以上I型HCV(GT 1HCV)感染者對該聯(lián)合抗病毒治療無效，同時有較為明顯的毒副作用(如流感樣癥狀、貧血以及抑郁癥等)而且該療法療程較長，通常長達一年，因此限制了該療法在臨床上的應用[4-6].由于目前臨床常用藥有此類問題，因此近些年來，越來越多的研究人員將注意力集中在一些新機制抗HCV藥物上，目前該類研究已取得了大量科研成果，甚至有一些治療丙肝的新藥已進入臨床試驗階段.為了更好地研發(fā)治療丙型肝炎藥物，對自1995年以來治療丙型肝炎藥物的研究進展進行綜述，并提出了一個比較有前景的研究方向.

1 干擾素

干擾素一直是治療病毒感染的首選藥物，慢性丙型肝炎臨床癥狀較乙型肝炎輕，但同樣可以進展到肝硬化，且有比較高的致癌幾率，所以需要抗病毒治療.而目前HCV肝炎抗病毒治療最有效的藥物為干擾素(IFN)[7-8].

1.1 普通干擾素

干擾素是一組細胞因子，是機體細胞在病毒感染或其他外源性刺激下生成的，其主要功能為分泌糖蛋白，干擾素具有廣譜抗病毒活性，同時，在一些情況下，干擾素還同時可以調節(jié)免疫以及抗增生[9].干擾素不直接殺滅病毒，而是通過與細胞表面靶蛋白結合，經(jīng)過信號通路傳導后，抑制病毒蛋白的合成，從而抑制病毒的復制，在抑制病毒復制的同時，干擾素還可以調節(jié)免疫應答從而協(xié)同抑制病毒復制.盡管IFN目前最常用的抗病毒藥物，但是其對HCV治療效果并不理想，主要表現(xiàn)在持續(xù)病毒應答(SVR)率較低，僅為20%左右，但是也有學者認為，當丙氨酸轉氨酶(ALT)持續(xù)正常超過6～12個月，且HCV RNA陰性，以此標準來看，IFN還是一類比較理想的抗HCV藥物[10].但是IFN會造成比較嚴重的不良反應如流感樣癥狀、貧血以及免疫系統(tǒng)疾病.

1.2 新型干擾素類藥物

利用現(xiàn)代分子生物學和單克隆技術，一些新型的治療效更好，安全性更高的干擾素得到了長足發(fā)展，其中最具代表性的便是復合干擾素和聚乙二醇干擾素.

1.2.1 復合干擾素(CIFN)

復合干擾素是用基因工程技術合成的28肽干擾素，是近年用于臨床的一種新的干擾素制劑.它能更強地激活NK細胞的抗病毒和抗增殖活性，如干復津(infergen)主要用于治療慢性丙型肝炎.它有9和 15 μg 2種劑型，9 μg CIFN相當于普通干擾素 3 MU.臨床結果表明，皮下注射CIFN 9和 15 μg，每周3次，共24周，與IFN α-2a標準治療比較， 9 μg 組與IFN α-2a組治療終末應答(ETR)和持續(xù)病毒應答(SVR)無差異；15 μg 組ETR和 SVR均顯著高于IFNα-2a組，提示復合干擾素可提高干擾素的療效[11].

1.2.2 長效干擾素

1970年聚乙二醇(PEG)化技術的出現(xiàn)為優(yōu)化治療性蛋白質的分子特性提供了新方法，用大分子多聚體(PEG)對蛋白質進行修飾，通過酰胺鍵將聚乙二醇分子結合于干擾素分子上[11].聚乙二醇化的干擾素分子大幅度地延長了它在體內的半衰期，提高了生物利用度，增強了治療效果，降低了毒性，減少了給藥次數(shù).美國FDA現(xiàn)已批準2種商品化的Pegylated IFNs.Lindsay[12]報道，HCV感染者接受IFN與聚乙二醇聯(lián)合治療，HCV清除率比提高4倍.由于其半衰期長，不會因每天給藥引起抗藥性、耐受性.

2 與干擾素聯(lián)用的藥物——利巴韋林(RBV)及其類似物

RBV對HCV幾乎無直接抑制作用主要用作輔助藥物與IFN聯(lián)用以起到抗病毒的作用.當二者聯(lián)用時，可顯著增加患者抗HCV治療的應答.國際推薦治療方案為IFN-α 3-5 MU，每周3次，RBV 800～1 200 mg/d，為期6個月以上.RBV可能是通過作用于次黃嘌呤核苷單磷酸脫氫酶而抑制鳥嘌呤-5′-三磷酸(GTP)的合成，阻止病毒合成.同時還能增強T細胞輔助細胞-1(Th1)的作用，通過抑制T細胞輔助細胞-2(Th2)，從而調節(jié)免疫[13-15].

圖1 利巴韋林及其類似物結構

RBV類似物viramidine是一種RBV的前藥，它主要在肝臟中被丙氨酸脫氨酶迅速轉化為RBV，所以它在肝臟中的需要濃度比RBV高3倍，其不良反應比RBV低.Levovirin是一種第2代RBV左旋對映體，它保留了免疫調節(jié)作用，能在體外增強Thl的細胞因子反應，在體內可以刺激機體產(chǎn)生廣譜的抗病毒狀態(tài)，并具有比RBV低得多的不良反應，在紅細胞中幾乎不見積累[16-19].

3 直接抗病毒藥物(direct-acting antivirals，DAAs)

對HCV復制周期的研究使得一類治療HCV新策略得到了發(fā)展，這就是直接作用于HCV組件的藥物，被稱之為“直接抗病毒藥物”(DAAs)，這些藥物已經(jīng)被用作治療新感染HCV或固有HCV感染的病人并且取得了令人鼓舞的結果.目前進行臨床試驗的治療HCV的DAAs其靶點只要是HCV NS3蛋白酶，HCV NS5B RNA聚合酶以及NS5A蛋白[20].NS3蛋白酶抑制劑主要作用于絲氨酸蛋白酶同時抑制經(jīng)過翻譯的HCV多聚蛋白的水解從而阻止該蛋白進一步形成成熟的HCV.NS5B是由HCV編碼的RNA聚合酶，其作用是催化正鏈RNA基因的形成[21].對該聚合酶的抑制會阻礙HCV基因復制.NS5A的功能目前并未完全研究清楚，不過可以肯定的是其在病毒復制過程中起到很重要的作用如調解NS5B聚合酶、細胞信號傳導及病毒微粒釋放等[22].

3.1 NS3蛋白酶抑制劑

3.1.1 BILN2061(Ciluprevir)

由加拿大Boehringer Ingelheim 公司研制的BILN 2061是世界上第一個進入臨床研究的NS3蛋白酶抑制劑，該藥物在臨床前研究過程中發(fā)現(xiàn)，BILN 2061是一種非共價特異性GT1 HCV NS3/4A蛋白酶抑制劑，同時該藥物還可以很好的阻滯HCV多聚蛋白的形成，從而抑制HCV復制[23].當慢性肝炎患者口服ciluprevir 2 d，其血液中HCV RNA降低了2～4 log10(IU/mL)[24].這些令人滿意的結果第一次在臨床角度驗證了DAA的有效性.盡管ciluprevir最終由于細胞毒性止步于一期臨床研究，但是其臨床研究結果促進了其他NS3/4A抑制劑的發(fā)展.特別要指出的是，科研人員通過對ciluprevir的基本骨架進行結構修飾已經(jīng)發(fā)展出一系列的大環(huán)類NS3蛋白酶抑制劑如TMC-435等(表1).

表1 NS3/4a蛋白酶抑制劑活性情況

3.1.2 VX950(Telaprevir)

VX950是由Vertex Pharmaceuticals和Tibotec BVBA兩家公司共同研制的另一類NS3/4A抑制劑，該藥物通過與蛋白酶形成可逆的共價復合體從而抑制酶作用的發(fā)揮，其抑制指數(shù)(Ki)達到 7 nmol/L.需要指出的是，該藥物對于GT2、GT3 HCV的抑制指數(shù)分別高出GT1型4～7倍與40倍，這就說明，VX-950是具有基因型選擇性的[25].

在二期臨床研究過程中，GT1感染病人單獨服用VX950(每8h 750 mg) 15 d 后體內病毒減少1.3～5.3 log10IU/mL.在二期臨床PROVE 1、2階段中，在先進行為期12周的pIFNα/利巴韋林/VX950三元療法后，再分別進行36周(PROVE 1)和12周(PROVE 2)的pIFNα/利巴韋林二元療法，結果表明，在與VX950聯(lián)用時pIFNα/利巴韋林的治療時間可以顯著縮短，該療法帶來的毒副作用因此也會顯著降低[26].

PROVE 3階段中，SOC無效的患者利用相同的治療方法進行治療，結果發(fā)現(xiàn)有38%～39%的患者產(chǎn)生了SVR，而單純進行SOC療法的患者中，這一數(shù)字僅為9%[27].這一結果表明，有VX950存在的三元療法可以顯著提高病人SVR產(chǎn)生率.

由于HCV的高復制率總是伴隨著NS5B聚合酶的高變異性，因此在服用VX950 2周后便會出現(xiàn)抗藥性，但是在與pIFNα/利巴韋林聯(lián)用時，機體對VX950的抗藥性會顯著減少.與SOC相比，VX950沒有明顯的毒副作用，僅有個別患者會出現(xiàn)胃腸不適、貧血以及皮疹等癥狀[28].

所有的研究結果都表明，VX950是一個很有前景的抗HCV新藥并且該藥物已于2011年上市.

3.1.3 SCH503034(Boceprevir)

SCH503034 由Merck公司研制的一類NS3/4A蛋白酶抑制劑，在為期 14 d 的治療過后，對SOC無效的患者體內HCV RNA水平降低了約 1.6 log10(IU/mL)，在與pIFN聯(lián)用后病毒降低 2.9 log10(IU/mL).

基于這些結果，仙靈苞雅進行了2期臨床試驗，對GT1 HCV感染患者首先進行為期4周pIFNα/利巴韋林聯(lián)合給藥，接著是44或24周的pIFNα/利巴韋林/ SCH503034聯(lián)合給藥[29].令人喜出望外的是，研究結果表明三元療法可以顯著提高SVR形成比例(75%，44周；56%，24周).試驗數(shù)據(jù)還表明，在發(fā)生RVR的患者中，產(chǎn)生SVR的患者比例在82%，這就說明將治療周期從48周縮短到24周并不會顯著降低治療效果.

在臨床試驗過程中，個別患者會出現(xiàn)疲勞、貧血、惡心和頭痛等不良反應.

3.1.4 TMC 435

TMC435是一種非共價大環(huán)NS3/4A蛋白酶抑制劑，是由比利時Tbotec公司和瑞典Medivir公司共同研制的，在二期臨床研究中，新感染和過往感染患者進行了不同給藥劑量(75、150或 200 mg)TMC435與pIFNα/利巴韋林聯(lián)合給藥，為期4周.三元療法過后為44周的pIFNα/利巴韋林治療，結果發(fā)現(xiàn)在 28 d 過后89%的患者發(fā)生了SVR而且其病毒濃度降低4.7～5.4 log10，觀察到的副作用為惡心、腹瀉以及頭痛，但癥狀輕微[30].

3.1.5 RG7227(Danoprevir)

RG7227也是一種非共價大環(huán)NS3/4A蛋白酶抑制劑，一期臨床表明，在單獨服用RG7227 14 d 后，GT1 HCV感染患者體內病毒水平降低 3.9 log10，在聯(lián)合服用pIFNα/利巴韋林后，病毒水平進一步降低了4.7～5.7 log10，在為期2周三元治療過程中，13%～57%的患者體內基本上監(jiān)測不到HCV RNA[31].在一期臨床研究階段，RG7227所造成的毒副作用都是溫和且暫時的.

有趣的是，將RG7227與另一種NS5B聚合酶RG7128聯(lián)用可以顯著增加體外抗HCV活性，實驗表明在RG7227/RG7128聯(lián)用2周后便會出現(xiàn)明顯持續(xù)抗病毒作用.而且該療法副作用較小并無耐藥反應[32].

3.1.6 其他NS3蛋白酶抑制劑

目前，有許多NS3蛋白酶抑制劑在研發(fā)過程中，其中有3個藥物已進入2期臨床階段，這3個藥物分別是：MK-7009 (vaniprevir)、SCH 900518 (Narlaprevir)和BI 201335.在2期臨床研究中，MK-7009在與pIFNα/利巴韋林聯(lián)用4周后患者體內RVR水平為69%～82%，再繼續(xù)用藥8周，患者EVR水平將提高到77～89%[33].當SCH 900518與pIFNα/利巴韋林聯(lián)用 8 d 后，病人體內HCV降低4～5.5 log10，當病人連續(xù)服藥4周后，其RVR與EVR分別提高至58～87%與84%～87%[34].當單獨服用BI201335 14 d 后，患者體內HCV RNA降低3～4.2 log10，當繼續(xù)聯(lián)合用藥 14 d 后該數(shù)字達到4.8～5.3 log10.

3.2 HCV NS5B RNA聚合酶(RdRp)抑制劑

HCV RNA聚合酶的三維晶體結構是經(jīng)典的“拇指-手掌-食指”狀結構[35]，在這個“手掌”中，“拇指”與“指尖”中間存在著大量相互作用力，形成了一個環(huán)狀活性位點，在接下來對該酶與核苷酸共結晶研究表明，在“拇指”與“食指”相連的地方存在一個rGTP口袋.這個“口袋”起變構的作用[36].HCV RdRp對病毒的復制至關重要，而且無宿主等價酶，因此，該酶被作為抗病毒治療的主要位點，至今為止，大多數(shù)抗病毒藥物靶點均是病毒聚合酶[37].

目前HCV RdRp抑制劑從結構上主要可以分為2類：核苷類衍生物和非核苷類衍生物.核苷類衍生物主要通過競爭性與聚合酶活性位點結合起作用，該類化合物抗病毒譜往往較寬.而另一方面，非核苷類抑制劑起作用則更具特異性，通過與活性位點直接結合或阻止聚合酶引發(fā)而起效.

吉利德四代抗丙肝藥物

HCV NS5B RNA聚合酶(RdRp)抑制劑的代表藥物就是由吉利德公司研發(fā)的四代抗HCV藥物.吉一代 (Sofosbuvir,索非布韋)2013年12月獲批上市；吉二代(Harvoni，索非布韋與雷迪帕韋的復方藥)2014年10月獲批上市；吉三代(Epclusa，索非布韋與維帕他韋的復方藥)2016年6月獲批上市.吉四代(Vosevi，索非布韋、維帕他韋與伏西拉普瑞韋組成的復方藥物)，該藥物可以實現(xiàn)對丙型肝炎患者的完全治愈.

索非布韋是首個無需聯(lián)合干擾素就能安全有效的治療丙肝的藥物，臨床證實主要針對1和4型的丙肝.針對2型丙肝，該藥物聯(lián)合利巴韋林的持續(xù)病毒應答率(SVR)為89%～95%.針對3型丙肝，該藥物聯(lián)合利巴韋林的SVR為61%～63%.Harvoni主要用于1、4、6型丙型肝炎的治療,是FDA批準的第一個用于治療基因1型丙型肝炎的全口服復方制劑，無需聯(lián)用注射干擾素，可單藥使用，12周對慢性丙肝患者的治療有效率達到95%～98%.Epclusa適用于全部6種基因型丙肝患者的治療，效果更佳，治愈率更高，副作用更小.第四代Vosevi是一種含3種固定劑量成分的組合藥片，也是首個獲批的每日一次單片治療的藥物,適用患者群體為先前用含有NS5A抑制劑方案治療失敗的基因型1、2、3、4、5或6成年病人，以及先前使用含有索非布韋但無NS5A抑制劑方案失敗的基因型1a或3成人，實現(xiàn)了對丙肝病人的全覆蓋.得益于上述四代藥物的開發(fā)，目前丙型肝炎可以說已被人類完全攻克.

3.2.1 核苷類抑制劑

核苷類抑制劑，不論是鏈阻滯劑還是非鏈阻滯劑，可以有效抑制病毒復制，當進入細胞后，核苷類似物首先轉化成核苷三磷酸(NTP).這種非自然的核苷類抑制劑一方面作為聚合酶的競爭物質另一方面還可以整合進起始鏈中，這種整合使得RNA鏈的延長過早終止[38].同時，整合的核苷抑制劑會造成堿基錯配，進而造成病毒的累積突變以至于所謂的“誤差災變”.但是，其他研究表明，在治療HCV過程中，利巴韋林與干擾素聯(lián)用可以幫助患者恢復免疫響應[39]，這就說明利巴韋林是一種多效性的藥物，但是由于利巴韋林的作用機制目前還不明確，因此其也是美國食品藥品管理局(FDA)批準的唯一一個核苷類抗HCV藥物.

近些年，有關研究報道了幾個糖醛類和堿基類核苷衍生物可以抑制RdRp酶活性進而阻滯HCV復制[40-41].在這些化合物中，最具應用前景的就是C-2、3-位取代核糖核酸類衍生物.默克實驗室研究發(fā)現(xiàn)2-C-甲基胞苷(1)和2-O-甲基胞苷(2)在體外具有很好的抑制NS5B聚合物活性[42].通過研究其作用機制發(fā)現(xiàn)該化合物通過與RNA競爭性結合并且在整合至RNA中后作為終止子終止了鏈的復制.C-2位上甲基通過阻礙了通過空間位阻使得序列無法與核苷酸進行融合.2-C-甲基鳥苷(3)以及另外一些核苷類似物與2-C-甲基腺苷、2-甲基胞苷作用機理相似，此外，其他含有C-2甲基的腺苷類似物也具有很好的抗HCV活性.

2-去氧-2-氟-2-C-甲基胞苷(4)具有很好的抗HCV活性，其EC90=5.4 M，可以與2-去氧-2-氟胞嘧啶核苷相媲美.而且，該化合物細胞毒性很弱.有趣的是，該化合物對牛痢疾病毒(一種與HCV密切相關的病毒)無抑制作用[43].此外，有研究發(fā)現(xiàn)了一系列3-脫氧核苷衍生物，該類化合物可以作為終止子終止RNA鏈的延長.其中有一個典型化合物即3-脫氧胞苷(5)具有非常好的HCV抑制活性[44].

NM283(6)，是一類很有前途的口服高生物利用度藥物2-C-甲基胞苷(NM107)的前藥.NM283通過2條途徑對病毒編碼的RNA聚合酶起作用：直接作用于聚合酶以及整合進入延長中的病毒RNA從而終止其復制.NM283是第1個進入2期臨床的抗HCV藥物.通過為期四周的口服藥物治療表明：NM283與pIFNα/利巴韋林聯(lián)用表現(xiàn)出良好的治療效果同時期藥物耐受度也較理想[45].

圖2 核苷類抑制劑結構圖

最近，Roche公開了一項研究成果，在一項多劑量遞增實驗中，R1626(一個新結構HCV聚合酶抑制劑)，表現(xiàn)出了優(yōu)異的抗HVC活性，該化合物是R1479的前藥，通過臨床研究發(fā)現(xiàn)，R1626在體內能夠高效轉化成R1479.在服用R1626 14 d，每天 1 500 mg 后，病人血液中HCV RNA降低了 1.2 log10[46].

3.2.2 非核苷類抑制劑

與活性位點不同，通過對NS5B與化合物共晶的X線衍射分析，發(fā)現(xiàn)了在與之前發(fā)現(xiàn)的活性位點相距較遠的地方，有一個構象調節(jié)位點，該位點也成為發(fā)展新型抗病毒藥物的靶點之一[47].因此，當化合物與RdRp活性位點或者構想調節(jié)位點相互作用可以影響底物與酶的結合或者其構象的轉化，這些化合物因此也可以高效抑制HCV.目前，有結構不同的幾類非核苷類抑制劑已經(jīng)被發(fā)現(xiàn).

近日，一類α，γ-二酮酸類化合物被證明可以作為HCV抑制劑[48].對該類化合物進行構效關系研究后發(fā)現(xiàn)，該類化合物中的二酮酸對于抗HCV活性至關重要，同時，將γ-位的芳基替換為噻吩基以后，化合物的療效和選擇性都有了顯著提高[49].對該化合物進行更進一步的優(yōu)化以后得到了一個活性優(yōu)良的HCV NS5b RNA 聚合酶抑制劑，其EC50為 45 nmol/L.

有研究認為認為二羥基嘧啶類衍生物可以像二酮酸類化合物一樣與酶活性位點內兩分子催化性鎂離子結合[50].但是目前并沒有該類化合物的體內試驗數(shù)據(jù).

苯并噻二嗪及其衍生物也是一類具有良好抗HCV活性的化合物，其中一個化合物其抑制NS5B聚合酶EC50為 80 nmol/L，對HCV其EC50為 500 nmol/L[51]，此外，該類衍生物還表現(xiàn)出對HCV RdRp的高選擇性，不會對其余病毒以及聚合酶起抑制作用.當與干擾素聯(lián)用時，該類化合物可以表現(xiàn)出很強的協(xié)同作用[52].進一步研究發(fā)現(xiàn)，該類化合物并不是通過與NTP競爭性整合到RNA從而阻止RNA復制而起作用，而是通過與HCV NS5B聚合酶活性位點結合起效.當分子中的喹啉酮結構被吡咯酮取代以后，會使得化合物抗HCV活性顯著提高[53].

苯并咪唑類衍生物是第1類非核苷HCV NS5B RNA聚合酶，其中一個化合物其對HCV NS5B RNA聚合酶EC50達到亞微摩爾級在對該化合物作用機理進行研究后發(fā)現(xiàn)，該化合物并不與NTP競爭整合至RNA，而是通過抑制異構酶活性從而起到抑制RNA聚合酶的活性[54].對苯并咪唑與苯并噻二嗪的交互抗性和協(xié)同作用研究研究發(fā)現(xiàn)這兩類結構迥異的化合物無交叉位點，因此說明以上兩類化合物其作用機理不同[55].Boehringer Ingelheim公司通過拓撲擴大的方法合成了一系列含苯并二唑的雜環(huán)化合物[56].有趣的是，后來通過將苯并咪唑取代為吡唑-嘧啶結構而得到的衍生物具有良好的抗HCV NS5B聚合酶活性[57].研究人員之后又發(fā)現(xiàn)了兩類HCV RNA聚合酶抑制劑.苯基丙氨酸和噻吩羧化物.經(jīng)過研究，其中的典型化合物是通過與一個異構化位點結合從而抑制HCV NS5B RNA聚合酶的活性[58-59].

除此以外，還有一些前景光明的非核苷抑制劑正在進行臨床研究.

R803是一個小分子 HCV RdRp抑制劑，其EC50=10 nmol/L，R803目前正在進行多劑量1、2期臨床試驗，但是由于發(fā)生了比較嚴重的毒副反應，該藥物的臨床試驗目前已終止.HCV-086是另一個口服小分子HCV NS5B RNA聚合酶抑制劑，一期臨床研究表明，該藥物效果良好，安全系較高，但是，該藥物總體藥效難以保證，因此已停止研發(fā).HCV-796是一種新型非核苷類聚合酶抑制劑，目前正在進行與干擾素聯(lián)用的臨床試驗，通過雙盲、安慰劑對照以及遞增劑量試驗表明，該藥物藥效良好且不會造成嚴重的毒副反應[60].

4 作用于宿主細胞的藥物及候選先導化合物

除以上機制外，另一類比較有前景的治療丙肝的策略是將宿主細胞作為治療靶點，宿主細胞是HCV復制不可或缺的條件，因此對宿主細胞中某些因素進行調控可以影響HCV的復制.目前主要從抑制病毒進入細胞、核糖體內部進入位點抑制劑、抑制病毒RNA復制以及阻滯病毒裝配和釋放4個方面來進行研究.

4.1 熱激同源蛋白70(Hsc70)抑制劑

有越來越多的證據(jù)表明：宿主蛋白是病毒粒子的組成部分之一，這些蛋白會幫助病毒躲避人體免疫系統(tǒng)的識別或者幫助病毒更好的進入細胞釋放.蛋白組學研究結果表明Hsc70是高純度HCV J6/JFH病毒粒子的重要組成部分.將HCV病毒顆粒與Hsc70抗體聯(lián)合培養(yǎng)會降低病毒感染性.

2010年蔣建東課題組首先發(fā)現(xiàn)了一個可以下調宿主Hsc70表達的苦參堿類衍生物——IMB-DM122(圖3)，通過對其抗HCV活性進行測定發(fā)現(xiàn)，該化合物可以安全有效的抑制HCV的復制，在研究中發(fā)現(xiàn)，IMB-DM122通過作用于Hsc70 mRNA 3′非編碼區(qū)，從而阻礙mRNA復制，同時在藥物作用下HCV mRNA半衰期縮短達78%.在研究中他們還發(fā)現(xiàn)，抑制Hsc70表達可以阻止病毒衣殼組裝從而達到抑制病毒復制的作用[61].

圖3 苦參堿類衍生物結構圖

最近，研究中發(fā)現(xiàn)，石蒜西定(lycoricidine)也是一類通過抑制Hsc70表達從而抑制HCV復制的生物堿，其EC50=0.52 nmol/L，在此基礎上，我們設計合成了20個石蒜西定衍生物并對其構效關系進行了研究，結果發(fā)現(xiàn)，石蒜西定C-1與10b-位的雙鍵以及C-2、C-3、C-4、5-位的烷基化對化合物活性有顯著影響[62](見表2).

表2 石蒜西定衍生物構效關系

綜上所述，對Hsc70抑制劑抗HCV活性的研究，在治療HCV的新療法以及廣譜抗病毒藥物研究方面有著廣闊的應用前景.

4.2 親環(huán)蛋白抑制劑

4.2.1 進行臨床實驗的親環(huán)蛋白抑制劑

目前，有一類很有發(fā)展前景的親環(huán)蛋白抑制劑被開發(fā)出來，特別要指出的是有3個候選化合物：Alisporivir(Novartis), NIM-811 (Novartis)以及 SCY-635(Scynexis)已進入臨床試驗階段，從1、2期臨床試驗數(shù)據(jù)可以看出，這3個化合物有著理想的安全性以及治療效果(表3).

表3 親環(huán)蛋白抑制劑活性總結

續(xù)表3

1) Alisporivir Alisporivir是一類通過合成得到的cyclosporineA(CsA)衍生物，它也是第一個投入臨床試驗的口服非免疫抑制型親環(huán)蛋白抑制劑在體外試驗中，該藥物表現(xiàn)出了有優(yōu)異的抗HCV活性，這種活性的表達與抑制親環(huán)蛋白具有非常密切的關系.

(a) Ⅰ期臨床研究 該藥物Ⅰ期臨床試驗歷時 15 d，采取雙盲、安慰劑對照的方式進行.每日口服2次，每次口服劑量 1 200 mg.該藥物經(jīng)口服后可以被迅速吸收，2 h 后血藥濃度達到峰值，其半衰期長達 100 h.在服用alisporivir的受試個體中，HCV-RNA降至3.6 log10水平，在16名服用藥物的個體中，有15人HCV病毒載量降了 2 log10以上.其中更有3名病人在治療開始8～15 d 后體內病毒幾乎難以被檢測到.在該研究中，所有3種HCV基因型(GT1、GT2以及GT4)對歸一化藥量響應良好同是沒有一例參試樣本出現(xiàn)病毒學反彈現(xiàn)象.通過這些實驗可以表明，alisporivir具有泛基因型抗病毒能力及低耐藥性.但是，該藥物引起的暫時性高膽素血癥使得在一些病人身上進行的試驗不得不中止[63-65].

(b) Ⅱ期臨床研究 在該藥物Ⅱ期臨床階段，主要考察了該藥物與pIFNα連用對慢性丙型肝炎患者的治療效果[66-71].90例參試對象分別按以下4種給藥方案之一進行了為期 29 d 的治療：(a)pIFNα + 安慰劑；(b)pIFNα + alisporivir(200 mg/d)；(c)pIFNα+alisporivir(600 mg/d)；(d)pIFNα+alisporivir(1 000 mg/d)以及(e). alisporivir(1 000 mg/d).在感染了GT1和GT4基因型HCV的乙肝患者中，在治療 29 d 后，其體內HCV RNA降低值如表4所示.

表4 Alisporivir臨床數(shù)據(jù)統(tǒng)計

在利用d給藥方案的12位患者中，有8位在經(jīng)過了 29 d 的治療后，在其體內幾乎檢測不到HCV病毒，治愈率達到67%，而使用方案a和方案e的患者中，這一數(shù)字顯著降低到了僅25%.在對感染GT2和GT3型HCV的6位患者單獨使用alisporivir治療(方案e)時，有4位患者體內幾乎檢測不到HCV病毒，治愈率達到67%，改組病人HCV RNA下降了4.22 log10.在較低劑量時，alisporivir的安全性與安慰劑相當.在口服 1 000 mg 藥物的24名患者中，僅有5人表現(xiàn)出可逆高膽素血癥癥狀.Alisporivir與pIFNα連用對感染GT1 HCV的患者的療效也經(jīng)過了考察：病人分別進行alisporivir/pIFNα/利巴韋林或安慰劑/pIFNa/利巴韋林治療，時間為24周或48周，其SVR應答水平分別為76%和55%.于此同時，病人對alisporivir有良好的耐受性與極低的病毒學反彈幾率[72-73].在服用alisporivir的患者中，70%的患者在停止給藥或降低藥量后出現(xiàn)了病毒學反彈現(xiàn)象.在口服alisporivir進行為期24周的應答指導治療的患者中，3%的患者表現(xiàn)出強烈的高膽素血癥.另有7%的接受48周治療的患者有相同的副作用癥狀.但是這些副作用均可逆且未伴隨轉氨酶升高.上述結果表明，alisporivir 與pIFNα/利巴韋林聯(lián)用在治療GT1型HCV感染方面有顯著地優(yōu)越性.

在Ⅱ期臨床試驗中，alisporivir還測試其對感染GT2、GT3 HCV患者的治療效果.數(shù)據(jù)顯示，每天1次聯(lián)合口服alisporivir 和利巴韋林對幾乎一半的GT2、GT3 HCV患者有治療作用.32%的患者在停藥6周后機體依舊有清楚病毒的能力.除此以外，97%的被治療患者在繼續(xù)服用alisporivir 和利巴韋林后，在停藥后的12周時間里，機體依舊具有清除病毒的能力[74].以上結果表明，alisporivir為今后治療HCV感染提供了1個頗具潛力的選項.

2) NIM811 (Novartis) NIM811是第1個通過合成得到的Cyp抑制劑，它同樣也是一類CsA衍生物，對該藥物的研究發(fā)現(xiàn)，該藥物免疫抑制活性非常微弱.同時，和Alisporivir一樣，NIM811同樣表現(xiàn)出了很明確的體外抗HCV活性.

(a) Ⅰ期臨床研究 在Ⅰ期臨床試驗中，NIM811利用遞增計量的隨機雙盲安慰劑對照的方式對GT1型HCV感染者進行 14 d 治療，病人每日或每2日單獨口服NIM811 10～600 mg.在所有劑量下，病人對NIM811均表現(xiàn)出良好適應性，病人轉氨酶水平正常，未見病毒作用跡象[75].

(b)Ⅱ期臨床研究 在Ⅱ期臨床研究中，GT1感染者口服NIM811(600 mg)或者安慰劑 14 d，在治療期的第 1 d 或第 8 d 聯(lián)合服用pIFNα.結果表明，在聯(lián)合用藥的患者體內，其HCV RNA降低了 2.85 log10，而單獨口服pIFNα的患者相同指標僅為 0.56 log10，同時，該藥物未發(fā)現(xiàn)顯著地副作用.

3) SCY-635 (SCYNEXIS) SCY-635是最新的非免疫抑制型Cyp抑制劑之一，該藥物同樣是CsA衍生物之一，也同樣具有顯著地體外抗HCV活性.

(a) Ⅰ期臨床研究 在Ⅰ期臨床研究中，對GT1 HCV感染病人進行了為期 15 d，隨機、雙盲、安慰劑對照、多計量給藥.參試者被分為3組，分別遞增給藥至總量300、600、900 mg.在每組內，病人以6∶1的比例隨機口服SCY-635或安慰劑，在治療期間進行藥代動力學評估和病毒監(jiān)測.服用安慰劑以及低劑量SCY-635(300或 600 mg/d)的患者其病毒復制并無明顯變化.而在口服 900 mg/d 的病人中，其體內病毒有明顯的減少，其中最高降低了 2.2 log10，甚至有一名患者在口服藥物 15 d 后體內幾乎監(jiān)測不到病毒.在1期臨床過程中，并未發(fā)現(xiàn)病人出現(xiàn)明顯的毒副作用[76].

4.2.2 研發(fā)中的Cyp抑制劑

1) Sangamides (BIOTICA) Sanglifehrin A，是一類與CsA結構不同的天然聚酮類化合物，在自然界中，該化合物及其衍生物是土壤細菌Streptomycessp. A92-308110次級代謝產(chǎn)物，因此，該化合物的工業(yè)化制備也是通過生物發(fā)酵方法.Sanglifehrins A～D 具有比CsA更強的抑制CypA異構化的能力[77].Sangamides是sanglifehrin A的氨基化衍生物，其具有優(yōu)異的體外跨基因型抗病毒能力，該化合物可以有效清除肝癌細胞中的HCV病毒，并且在和一些直接作用藥物聯(lián)用的時候有明顯的協(xié)同作用.初步的藥代動力學研究表明Sangamides適合日?？诜o藥.與CsA所不同的是，Sangamides不會顯著抑制MDR1——一類可以加強藥物配伍作用的蛋白.同時，Sangamides還被證明對MRP2沒有明顯的抑制作用[78].

2) EP-CyP546 (ENANTA) EP-CyP546是一類非免疫抑制Cyp抑制劑，體外實驗表明，該化合物抗HCV活性為EC50=100 nmol/L(GT1b)及 121 nmol/L(GT1a).同時，有趣的是，EP-CyP546在40%人血清存在條件下依然持續(xù)保持有效，這與其他Cyp抑制劑有明顯不同.此外，該化合物與pIFNα以及DAAs聯(lián)用是有明顯的協(xié)同作用，且相互間無不良反應.EP-CyP546與一類NS5A抑制劑聯(lián)用時，可以顯著降低常見的藥物耐受作用[79].目前并無對該類化合物成功合成的報道.

3) F680 與F684 這2種化合物是通過基于片段藥物分子設計方法(FBDD)設計的小分子(100～150Da)，這2個化合物有明顯的抑制CypA、CypB和CypD的活性.更為重要的是，兩者在顯示出良好活性(F680∶IC50=3.12 μmol/L；F684∶IC50=0.87 μmol/L)的同時并未表現(xiàn)出明顯的細胞毒性[80].

4.2.3 親環(huán)蛋白

2003年Watashi等首先發(fā)現(xiàn)親環(huán)蛋白抑制劑——CsA和NM811可以在體外抑制HCV復制，該發(fā)現(xiàn)首次揭示了Cyp與HCV之間的關系[81].這項里程碑式的發(fā)現(xiàn)又陸續(xù)被其他幾個研究小組所證實[82-87].通過暫時下調CypA、CypB、CypC、CypH、Cyp40以及CypE可以抑制HCV復制，從而表明Cyps在HCV復制方面起著重要作用.而最新的研究表明，3個獨立研究組的研究結果表明，在Cyp家族中，相比CypB與CypC，CypA對于HCV的復制至關重要[88-90].CypA 最初是從牛胸腺細胞中提取出來的廣泛存在于真核細胞細胞質中[91].Fischer以及他的同事們發(fā)現(xiàn)，作為肽基脯氨酸順反異構酶(PPIase)的一部分，CpyA的作用是催化脯氨酸殘基的反轉[92-94].CsA可以與CpyA疏水空腔結合從而抑制其異構酶活性[95-96]，從而說明CpyA是Cpys抑制劑的主要體內靶點.

4.2.4 親環(huán)蛋白抑制劑的作用機制

有研究表明，HCV NS5A蛋白是CypA的直接配體[97-104].該發(fā)現(xiàn)也恰好與在Cyp抑制劑飼喂下HCV基因突變位點往往是NS5A基因的現(xiàn)象吻合.而最為關鍵的是，Cyp抑制劑阻止和破壞CypA-NS5A聚合體的形成[105]，在不同基因型HCV病毒中，CypA和病毒NS5A蛋白間的相互關系式保守存在的[106].這就可以完美解釋為什么Cyp抑制劑不論在體內還是體外均可以抑制不同基因型HCV的現(xiàn)象.這也就是說，阻止CypA與NS5A的結合可以有效抑制HCV復制.通過晶體學研究手段可以表明：CypA可以直接與NS5A蛋白中的domains Ⅱ、Ⅲ區(qū)域結合[107]，由于該區(qū)域分布大量脯氨酸殘基，正好與CpyA是作為PPIase一部分的事實相吻合.有趣的是，已經(jīng)有研究表明NS5A蛋白domain Ⅱ區(qū)中含有一個NS5B RNA聚合酶結合位點[108]，如果CypA和NS5B都可與與這個位點結合，那就引出了一種可能性即：CypA可以作用于NS5A、NS5B或者同時作用于兩者.假如以上假設成立，則會發(fā)生以下2種情況：一方面，NS5A作為一種內源性NS5B負調節(jié)蛋白，當其與NS5B結合后，會阻礙NS5B聚合酶活性的發(fā)揮，換言之，當Cyp與NS5A結合從而抑制其與NS5B結合時，NS5B可以自由的發(fā)揮其病毒RNA聚合作用使得HCV病毒得以復制(圖4，Model Ⅰ)，當Cpys抑制劑與CpyA結合而使得其無法與NS5A結合進而令NS5A與NS5B結合從而阻止了HCV RNA的復制；另一方面，NS5A作為NS5B的正調節(jié)蛋白(圖4，Model Ⅱ)，CypA通過與NS5A結合以促進其對NS5B的正調節(jié)作用.而Cyps抑制劑的加入使CypA-NS5A復合物被破壞從而破壞了NS5A對NS5B的激活作用，進而破壞了HCV的復制.

值得注意的是，最新的研究成果表明，Cyp抑制劑SCY-635在體內具有調節(jié)干擾素響應的活性，當每天口服SCY-635時，患者體內IFNα血藥濃度會迅速提高(2 h 之內)，反觀服用安慰劑和服用SCY-635的非HCV感染者體內干擾素水平并未顯著變化.這些數(shù)據(jù)表明，在體內，對于CpyA的抑制可以既阻礙病毒復制又增加機體自身符合干擾素的表達.之前有研究表明NS5A可以抑制干擾素的表達.因此可以推測Cyp抑制劑通過破壞CypA-NS5A復合物的形成從而起到2方面作用：①干擾HCV復制；②激活自身干擾素表達.

圖4 Cyps抑制劑作用機理

5 總結與展望

隨著人們對于丙型肝炎的逐漸重視，對于治療丙型肝炎藥物的研發(fā)也吸引著越來越多科研工作者的目光，并且取得了一定進展，隨著越來越多的抗HCV藥物的上市，醫(yī)療人員在治療該類疾病是也有了越來越多治療手段和治療策略.但是，不可否認的是，由于HCV本身所具有的的高變異性特點以及藥物本身的安全性問題，因此，要開發(fā)出來一類在各方面都令人滿意的抗丙肝新藥，還有很多問題亟待科研工作者去解決.鑒于通過傳統(tǒng)機制起效的藥物由于機制本身條件限制都會有不同程度的問題，因此，對一些新機制，尤其是針對宿主方面機制的新型藥物的研發(fā)或許是一個比較有前景的研究方向.