麝香酮減輕高糖誘導的腎小管上皮細胞炎癥損傷的機制研究

張惠娜，谷 巍，王 菲

糖尿病腎病是常見的一種糖尿病并發(fā)癥，隨著疾病進展糖尿病腎病逐步發(fā)展為慢性腎衰竭，最終導致患者死亡。體內(nèi)持續(xù)高糖可促使腎小管上皮細胞炎癥反應的發(fā)生，并可進一步誘導腎小管上皮細胞凋亡，進而加重腎小管上皮細胞損傷，而腎小管上皮細胞損傷是引起糖尿病腎病的重要病理基礎[1]。中藥具有毒副作用小且效果好等優(yōu)點，在抗炎、抗細胞凋亡等方面具有重要作用，研究表明部分中藥可通過減輕高糖誘導的腎小管上皮細胞損傷，減緩糖尿病腎病的發(fā)展進程[2-4]。麝香酮屬于一種中藥活性單體，可緩解心肌缺血癥狀，研究表明其可通過抑制多柔比星誘導的心肌細胞凋亡，減輕心肌細胞損傷[5]。miR-191在腎臟缺血再灌注損傷細胞中表達升高，并可通過促進腎小管上皮細胞凋亡，促進腎臟缺血再灌注損傷[6]。但麝香酮和miR-191對高糖誘導的腎小管上皮細胞炎癥損傷的影響尚未可知。因此，本研究旨在探討麝香酮是否通過調(diào)控miR-191的表達進而影響高糖誘導的腎小管上皮細胞炎癥損傷。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 麝香酮購自上海同田生物技術(shù)有限公司(批號：541-91-3，純度≥98%)；人腎小管上皮細胞HK-2購自上海奧陸生物科技有限公司；凋亡檢測試劑購自碧云天生物技術(shù)研究所；Lipofectamine2000購自美國Invitrogen公司；miRNA提取試劑、逆轉(zhuǎn)錄與qRT-PCR試劑購自美國Thermo Fisher公司；anti-miR-191、anti-miR-NC、miR-191 mimics、miR-NC購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；白細胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；兔抗人Cleaved-caspase3、Cleaved-caspase9抗體購自美國CST公司。

1.2研究方法

1.2.1高糖誘導的腎小管上皮細胞培養(yǎng)[7]：HK-2細胞置于DMEM完全培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞(3×104個/ml)接種于6孔板(100 μl/孔)，用含30 mmol/L葡萄糖溶液的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，記為高糖組(HG組)；用含5.5 mmol/L葡萄糖溶液的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，記為正常對照組(Con組)。

1.2.2實驗處理及分組：HK-2細胞(1×104個/ml)接種于96孔板(100 μl/孔)，用含不同濃度(5、10、20 μmol/L)麝香酮[8]與30 mmol/L葡萄糖溶液的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，分別記為HG+低劑量組、HG+中劑量組、HG+高劑量組。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將anti-miR-NC、anti-miR-191分別轉(zhuǎn)染至HK-2細胞，加入含30 mmol/L葡萄糖溶液的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，分別記為HG+anti-miR-NC組、HG+anti-miR-191組。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將miR-NC、miR-191 mimics分別轉(zhuǎn)染至HK-2細胞，加入含20 μmol/L麝香酮與30 mmol/L葡萄糖溶液的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，分別記為HG+麝香酮+miR-NC組、HG+麝香酮+miR-191組。

1.2.3ELISA法檢測IL-6、TNF-α水平：收集各組HK-2細胞培養(yǎng)液上清，采用ELISA法檢測培養(yǎng)液中IL-6、TNF-α水平，按照試劑盒說明書操作，在反應孔內(nèi)加入標準品或待測樣品100 μl，在空白對照孔內(nèi)加入稀釋液100 μl，待空白對照孔細胞調(diào)零后應用酶標儀檢測450 nm波長處吸光度(A)值，根據(jù)標準品計算IL-6、TNF-α水平。

1.2.4流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率：取各組HK-2細胞經(jīng)1000 r/min離心6 min后棄上清，加入預冷PBS液洗滌細胞后再加入結(jié)合緩沖液重懸細胞500 μl，按照凋亡檢測試劑盒說明書操作并應用FACS Calibur流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.5qRT-PCR檢測細胞中miR-191表達：用miRNA提取試劑盒分別提取各組HK-2細胞總RNA，應用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA 2 μl進行PCR擴增反應，采用2-ΔΔCt法計算miR-191相對表達量。

1.2.6Western blot法檢測Cleaved-caspase3、Cleaved-caspase9蛋白表達：收集各組HK-2細胞加入蛋白裂解液提取細胞總蛋白，采用BCA法檢測蛋白濃度，按照每孔30 μg蛋白樣品上樣進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳條件：80 V 30 min，120 V 90 min，根據(jù)marker位置切膠并應用濕轉(zhuǎn)膜儀將蛋白凝膠轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜2 h，分別加入Cleaved-caspase3(1︰1000)、Cleaved-caspase9(1︰1000)一抗與內(nèi)參GAPDH抗體(1︰3000)稀釋液4℃孵育過夜，加入二抗稀釋液(1︰5000)室溫孵育1 h，電化學發(fā)光試劑顯影，應用Image J軟件分析各條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1麝香酮對高糖誘導的腎小管上皮細胞炎性因子表達的影響 與Con組比較，HG組IL-6、TNF-α水平升高(P<0.05)；與HG組比較，HG+低劑量組、HG+中劑量組、HG+高劑量組IL-6、TNF-α水平降低(P<0.05)，且隨著麝香酮處理劑量的增加IL-6、TNF-α水平逐漸降低(P<0.05)。見表1。

表1 麝香酮對高糖誘導的腎小管上皮細胞炎性因子表達的影響

2.2麝香酮對高糖誘導的腎小管上皮細胞凋亡的影響 與Con組比較，HG組Cleaved-caspase3、Cleaved-caspase9蛋白水平升高(P<0.05)；與HG組比較，HG+低劑量組、HG+中劑量組及HG+高劑量組Cleaved-caspase3、Cleaved-caspase9蛋白水平降低(P<0.05)，且隨麝香酮處理劑量的增加Cleaved-caspase3、Cleaved-caspase9蛋白水平逐漸降低(P<0.05)。見圖1和表2。Con組、HG組、HG+低劑量組、HG+中劑量組及HG+高劑量組細胞凋亡率分別為(5.77±0.56)%、(31.65±3.11)%、(23.86±2.09)%、(17.05±1.31)%、(9.43±0.81)%。與Con組比較，HG組細胞凋亡率升高(P<0.05)；與HG組比較，HG+低劑量組、HG+中劑量組及HG+高劑量組細胞凋亡率降低(P<0.05)，且隨麝香酮處理濃度的增加細胞凋亡率逐漸降低(P<0.05)。見圖2。

圖1 麝香酮對高糖誘導的腎小管上皮細胞凋亡相關(guān)蛋白表達的影響Con組予5.5 mmol/L葡萄糖溶液培養(yǎng)24 h，HG組予30 mmol/L葡萄糖溶液培養(yǎng)24 h，HG+低劑量組、HG+中劑量組、HG+高劑量組分別予30 mmol/L葡萄糖溶液+5、10、20 μmol/L麝香酮培養(yǎng)24 h

圖2 麝香酮對高糖誘導的腎小管上皮細胞凋亡流式圖Con組予5.5 mmol/L葡萄糖溶液培養(yǎng)24 h，HG組予30 mmol/L葡萄糖溶液培養(yǎng)24 h，HG+低劑量組、HG+中劑量組、HG+高劑量組分別予30 mmol/L葡萄糖溶液+5、10、20 μmol/L麝香酮培養(yǎng)24 h

表2 各組腎小管上皮細胞凋亡相關(guān)蛋白表達比較

2.3麝香酮對高糖誘導的腎小管上皮細胞miR-191表達的影響 Con組、HG組、HG+低劑量組、HG+中劑量組及HG+高劑量組miR-191表達量分別為1.00±0.00、3.58±0.22、2.81±0.21、1.97±0.17、1.36±0.12。與Con組比較，HG組miR-191表達量升高(P<0.05)；與HG組比較，HG+低劑量組、HG+中劑量組、HG+高劑量組miR-191表達量降低(P<0.05)，且隨麝香酮處理濃度的增加miR-191表達量逐漸降低(P<0.05)。

2.4干擾miR-191表達對高糖誘導的腎小管上皮細胞炎癥損傷的影響 與HG+anti-miR-NC組比較，HG+anti-miR-191組IL-6水平、TNF-α水平、細胞凋亡率和Cleaved-caspase3、Cleaved-caspase9蛋白水平均降低(P<0.05)，見圖3、表3。

表3 干擾miR-191表達對高糖誘導的腎小管上皮細胞炎癥損傷的影響

圖3 干擾miR-191表達對高糖誘導的腎小管上皮細胞凋亡的影響A.凋亡相關(guān)蛋白表達；B.細胞凋亡流式圖

2.5過表達miR-191逆轉(zhuǎn)麝香酮對高糖誘導的腎小管上皮細胞炎癥損傷的作用 與HG+麝香酮+miR-NC組比較，HG+麝香酮+miR-191組IL-6水平、TNF-α水平、細胞凋亡率和Cleaved-caspase3、Cleaved-caspase9蛋白水平均升高(P<0.05)。見圖4、表4。

表4 過表達miR-191逆轉(zhuǎn)麝香酮對高糖誘導的腎小管上皮細胞炎癥損傷的作用

圖4 過表達miR-191逆轉(zhuǎn)麝香酮對高糖誘導的腎小管上皮細胞凋亡的作用A.凋亡相關(guān)蛋白表達；B.細胞凋亡流式圖

3 討論

高血糖可引起線粒體功能障礙從而促進糖尿病腎病的發(fā)生，由于活性氧、促炎因子的大量生成導致腎小管上皮細胞損傷，因而減輕腎小管上皮細胞損傷成為治療糖尿病腎病的關(guān)鍵。高糖環(huán)境下可促使活性氧等過多生成造成核酸斷裂、酶失活等破壞性過程，進而導致細胞凋亡，文獻報道部分中藥可通過抑制高糖誘導的腎小管上皮細胞凋亡，減輕細胞損傷[9]。miRNA在高糖誘導的腎小管上皮細胞中異常表達，并可通過調(diào)控靶基因表達而參與腎小管上皮細胞損傷過程[10]。已有研究發(fā)現(xiàn),部分中藥可通過調(diào)控miRNA的表達減緩糖尿病腎病的發(fā)展進程[11]。

中藥麝香具有鎮(zhèn)心安神等功效，麝香酮是麝香的主要活性成分，研究表明麝香酮具有抑制神經(jīng)細胞凋亡的作用，可減輕模型大鼠早期創(chuàng)傷性腦損傷并改善其神經(jīng)功能[12-13]。麝香酮還可減輕脂多糖誘導的小膠質(zhì)細胞損傷[14]。本研究結(jié)果顯示，高糖誘導的腎小管上皮細胞培養(yǎng)液中IL-6、TNF-α水平升高，與文獻[15]報道結(jié)果相似，提示成功構(gòu)建了高糖誘導的腎小管上皮細胞炎癥損傷模型；且麝香酮還以濃度依賴性的方式降低高糖誘導的腎小管上皮細胞培養(yǎng)液中IL-6、TNF-α水平。本研究結(jié)果還顯示，高糖誘導的腎小管上皮細胞凋亡率和Cleaved-caspase3、Cleaved-caspase9蛋白水平升高，與既往研究[16]結(jié)果相似;且隨麝香酮處理濃度的增加，高糖誘導的腎小管上皮細胞凋亡率和Cleaved-caspase3、Cleaved-caspase9蛋白水平逐漸降低，提示麝香酮可能通過抑制高糖狀態(tài)誘導的腎小管上皮細胞炎癥反應，從而達到抑制細胞凋亡、減輕細胞炎癥損傷的目的。

本研究結(jié)果還顯示，高糖誘導的腎小管上皮細胞中miR-191表達量升高，且麝香酮以濃度依賴性的方式降低miR-191表達量，提示麝香酮可能通過抑制miR-191表達而發(fā)揮作用。研究表明，miR-191在急性缺血性腦卒中患者中表達升高，miR-191過表達可促進OGD/R誘導的內(nèi)皮細胞損傷[17]。miR-191在異氟烷誘導的神經(jīng)損傷小鼠模型海馬組織中表達上調(diào)，表達下調(diào)可減輕其神經(jīng)損傷程度[18]。miR-191在肝缺血再灌注損傷和缺氧復氧誘導的肝細胞損傷小鼠模型肝組織中表達上調(diào)，干擾其表達可抑制模型小鼠肝損傷進程[19]。本研究結(jié)果顯示，上調(diào)miR-191表達可以拮抗麝香酮對高糖誘導腎小管上皮細胞的炎癥損傷及凋亡作用，提示麝香酮可能通過調(diào)控miR-191表達，從而減緩糖尿病腎病的進程。

綜上，麝香酮通過抑制miR-191表達抑制高糖誘導腎小管上皮細胞的炎癥損傷及細胞凋亡，達到減輕細胞炎癥損傷的目的，可為麝香酮治療糖尿病腎病提供理論基礎，還可為糖尿病腎病治療藥物的研發(fā)提供新的方向。