雙氫青蒿素體外抑制新孢子蟲和弓形蟲試驗

楊冰祎，王振宇，千慧燕，閔鵬飛，張爽，賈立軍*

(1.東北寒區(qū)肉?？萍紕?chuàng)新教育部工程研究中心，延邊大學(xué)；2.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院： 吉林 延吉 133002)

新孢子蟲病是由犬新孢子蟲(Neosporacaninum)引起孕畜流產(chǎn)、死胎或木乃伊胎，以及新生兒運動神經(jīng)障礙的一種原蟲病[1]。弓形蟲病是一種人畜共患傳染病，該病多呈隱性感染，嚴(yán)重影響人類、家畜和野生動物的健康，被視為一種嚴(yán)重威脅疾病[2]。為減輕新孢子蟲病和弓形蟲病給畜牧業(yè)帶來的危害，篩選有效藥物和研制疫苗是當(dāng)前的研究重點[3]。雖然乙胺嘧啶在弓形蟲治療方面是首選藥物，青蒿素及其衍生物對弓形蟲和新孢子蟲也具有一定抑制作用，但針對弓形蟲與新孢子蟲的有效防控仍然是一項急需解決的難題[4-7]。

張步彩等[8]用白牛膽、垂花香薷、黃皮葉、樺褐孔菌多糖進(jìn)行抗弓形蟲試驗，發(fā)現(xiàn)幾種藥物均有一定程度的抗弓形蟲的作用。而且相關(guān)試驗證明，樺褐孔菌多糖也具有一定的抗弓形蟲作用[9]。該試驗以雙氫青蒿素作為研究對象，開展體外抗新孢子蟲和弓形蟲研究，以期確定雙氫青蒿素體外抑制2種蟲體的作用效果。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與藥品

DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液購自Gibico公司，胎牛血清(FBS)購自浙江天杭生物科技公司，雙抗(青鏈霉素混合液)、胰蛋白酶-EDTA消化液、PBS和二甲基亞砜(DMSO)均購自北京索萊寶科技有限公司。樺褐孔菌多糖(含量≥85%)由延邊大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)試驗室提取保存，雙氫青蒿素(含量≥98%)購自上海哈靈生物科技有限公司，青蒿素(含量≥98%)和乙胺嘧啶(含量≥98%)購自上海麥克林生化科技有限公司，黃芩苷(含量≥95% )由上海源葉生物科技有限公司。用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液將樺褐孔菌多糖稀釋，0.22 μm濾膜濾菌后4 ℃保存?zhèn)溆?；用二甲基亞砜將雙氫青蒿素、青蒿素、黃芩苷、乙胺嘧啶分別配置成母液并過0.22 μm濾膜，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 細(xì)胞及蟲體

Vero細(xì)胞、新孢子蟲NC-GFP株和弓形蟲MIC10-GFP株由延邊大學(xué)預(yù)防實驗室保存。

1.3 細(xì)胞與蟲體的培養(yǎng)

37 ℃、5% CO2培養(yǎng)Vero細(xì)胞，將NC-GFP與MIC10-GFP接種Vero細(xì)胞中，當(dāng)速殖子增殖游離于培養(yǎng)液中時，過27 G針頭和5 μm濾膜純化速殖子，并計數(shù)，備用。

1.4 MTT法測定雙氫青蒿素等藥物對Vero細(xì)胞毒性

按照謝素珠等[10]方法應(yīng)用MTT法測定雙氫青蒿素、青蒿素、樺褐孔菌多糖、黃芩苷、乙胺嘧啶等對Vero細(xì)胞的毒性。計算方法：增殖率=(試驗組OD值-空白對照組OD值)/(試驗對照組OD值-空白對照組OD值)×100%。

1.5 MTT法藥物體外抗新孢子蟲與弓形蟲試驗

按照謝素珠等[3]方法，雙氫青蒿素、青蒿素、樺褐孔菌多糖、黃芩苷、乙胺嘧啶以細(xì)胞毒性試驗中得到的安全濃度及用培養(yǎng)液稀釋至80%、50%、25%、5%，每孔150 μL，對照組加入150 μL 0.1% DMSO的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)60 h后，在熒光倒置顯微鏡下通過對GFP熒光信號的統(tǒng)計與隨機(jī)視野中速殖子的個數(shù)及納蟲泡進(jìn)行統(tǒng)計。抑制率=(對照組個數(shù)-藥物處理組個數(shù))/對照組中個數(shù)×100%，以此來計算蟲體抑制率。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

用GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。同一藥物同一時間不同濃度的數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析。P<0.01表示差異極顯著，0.010.05表示差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 藥物對Vero細(xì)胞的毒性試驗

在24和48 h時不同藥物不同濃度對Vero細(xì)胞的毒性結(jié)果見表1。由表1可見，2個時間細(xì)胞增殖率均在90%以上所對應(yīng)的質(zhì)量濃度分別為雙氫青蒿素20 mg/L、青蒿素25 mg/L、樺褐孔菌多糖40 mg/L、黃芩苷20 mg/L及乙胺嘧啶2 mg/L，按照此濃度為試驗安全濃度進(jìn)行試驗。

表1 藥物對Vero細(xì)胞的毒性試驗結(jié)果(n=3)

2.2 藥物體外抗新孢子蟲與弓形蟲速殖子增殖試驗

新孢子蟲給藥12 h后在熒光顯微鏡下觀察,各藥物高質(zhì)量濃度組下細(xì)胞形態(tài)均保持正常。給藥24 h后雙氫青蒿素高質(zhì)量濃度組中細(xì)胞形態(tài)正常，納蟲泡體積最小，青蒿素細(xì)胞形態(tài)正常，納蟲泡體積正常，青蒿素、樺褐孔菌多糖、黃芩苷和乙胺嘧啶各高質(zhì)量濃度組中細(xì)胞體積稍變大，納蟲泡形態(tài)較大。36 h后雙氫青蒿素少部分細(xì)胞體積變大，納蟲泡未發(fā)生變化；青蒿素部分細(xì)胞體積發(fā)生變化，納蟲泡無明顯變化；樺褐孔菌多糖、黃芩苷和乙胺嘧啶各高質(zhì)量濃度組中細(xì)胞體積增大，納蟲泡體積增大。48 h后雙氫青蒿素高質(zhì)量濃度組中細(xì)胞體積略有變大，納蟲泡體積未發(fā)生變化；青蒿素細(xì)胞體積略有變大，納蟲泡未發(fā)生明顯變化；樺褐孔菌多糖、黃芩苷和乙胺嘧啶各高質(zhì)量濃度組中細(xì)胞體積增大，少部分細(xì)胞裂解且納蟲泡體積增大，胞外見少量速殖子。60 h后雙氫青蒿素高質(zhì)量濃度組觀察，大部分細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，細(xì)胞間聚集生長，可見零星納蟲空泡；青蒿素高質(zhì)量濃度組觀察，個別細(xì)胞裂解，大部分細(xì)胞形態(tài)發(fā)生不規(guī)則變化，可見量納蟲空泡；樺褐孔菌多糖高質(zhì)量濃度觀察細(xì)胞聚集生長，納蟲泡變大，部分細(xì)胞發(fā)生崩解。觀察黃芩苷和乙胺嘧啶各高質(zhì)量濃度組，部分細(xì)胞邊緣裂解，胞外可見少量速殖子；對照組細(xì)胞全部邊緣裂解，形態(tài)模糊，大部分細(xì)胞完全破裂，可見大量速殖子。60 h后高質(zhì)量濃度藥物組體外抑制新孢子蟲結(jié)果見圖1。

弓形蟲給藥12 h后熒光顯微鏡下觀察，各藥物高質(zhì)量濃度組細(xì)胞形態(tài)均保持正常。給藥24 h后雙氫青蒿素高質(zhì)量濃度組中大部分細(xì)胞形態(tài)正常；青蒿素大部分細(xì)胞形態(tài)基本正常，納蟲泡體積正常；樺褐孔菌多糖、黃芩苷和乙胺嘧啶各高質(zhì)量濃度組中細(xì)胞體積略微變大，納蟲泡形態(tài)較大。36 h后雙氫青蒿素高質(zhì)量濃度中細(xì)胞體積略微變大，納蟲泡形態(tài)無明顯變化；青蒿素高質(zhì)量濃度組細(xì)胞體積略變大，納蟲泡體積略微變大；樺褐孔菌多糖、黃芩苷和乙胺嘧啶各高質(zhì)量濃度組中細(xì)胞體積增大，部分納蟲泡體積明顯增大。48 h后雙氫青蒿素高質(zhì)量濃度組中細(xì)胞體積略變大，納蟲泡體積略微變大；青蒿素細(xì)胞體積略有變大，納蟲泡略微變大；樺褐孔菌多糖、黃芩苷和乙胺嘧啶各高質(zhì)量濃度組中細(xì)胞體積增大，部分細(xì)胞裂解且納蟲泡體積增大，胞外見少量速殖子。60 h后雙氫青蒿素高質(zhì)量濃度組觀察，胞外可見零星的速殖子和納蟲泡；青蒿素、樺褐孔菌多糖及黃芩苷高質(zhì)量濃度組觀察，胞外見少量成片狀速殖子；乙胺嘧啶各高質(zhì)量濃度組觀察，可見少量速殖子和單個納蟲泡。對照組細(xì)胞形態(tài)模糊，胞外可見大量速殖子和充滿速殖子的納蟲泡。60 h后高質(zhì)量濃度藥物組體外抑制弓形蟲結(jié)果見圖2。

2.3 藥物體外對新孢子蟲與弓形蟲速殖子的抑制效果

給藥60 h后，在倒置熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，不同藥物的抑新孢子蟲效果不同，同一藥物不同濃度的抑蟲效果也不同。雙氫青蒿素高質(zhì)量濃度(20 mg/L)抑制率為97.69%，高質(zhì)量濃度組中抑蟲率相近(表2)；青蒿素高質(zhì)量濃度(25 mg/L)抑制率為95.36%(表3)，與雙氫青蒿素抑蟲率相近；樺褐孔菌多糖高質(zhì)量濃度(40 mg/L)的抑制率為70.44%(表4)，黃芩苷高質(zhì)量濃度(20 mg/L)的抑制率為66.53%(表5)，乙胺嘧啶高質(zhì)量濃度(2 mg/L)的抑制率為67.29%(表6)。

表2 60 h雙氫青蒿素不同質(zhì)量濃度中抑蟲率的比較Table 2 Comparison of inhibition rate in different concentrations of dihydroartemisinin at 60 h

表3 60 h青蒿素不同質(zhì)量濃度中抑蟲率的比較

表4 60 h樺褐多糖孔菌不同質(zhì)量濃度中抑蟲率的比較

表5 60 h黃芩苷不同質(zhì)量濃度中抑蟲率的比較

表6 60 h乙胺嘧啶不同質(zhì)量濃度中抑蟲率的比較

給藥60 h后，在倒置熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，不同藥物的抑弓形蟲效果不同，同一藥物不同濃度的抑蟲效果也不同。雙氫青蒿素高質(zhì)量濃度(20 mg/L)抑制率為86.56%(表2)；青蒿素高質(zhì)量濃度(25 mg/L)抑制率為82.81%(表3)；樺褐孔菌多糖高質(zhì)量濃度(40 mg/L)的抑制率為63.48%(表4)；黃芩苷高質(zhì)量濃度(20 mg/L)的抑制率為72.21%(表5)；乙胺嘧啶高質(zhì)量濃度濃度(2 mg/L)的抑制率為81.84%(表6)。

由表2可知，在雙氫青蒿素藥物組中，同一時間高質(zhì)量濃度組間抑制新孢子蟲的效果無顯著差異(P>0.05),低質(zhì)量濃度組間差異顯著(0.010.05)，低質(zhì)量濃度組間差異極顯著(P<0.01)。由表4可見，在樺褐孔菌多糖藥物組中，同一時間高質(zhì)量濃度組間抑制新孢子蟲效果無顯著差異(P>0.05)，高濃度和低質(zhì)量濃度組間差異顯著(P<0.05)。由表5可見，在黃芩苷藥物組中，同一時間高質(zhì)量濃度組間抑制新孢子蟲效果均無顯著差異(P>0.05)，在低濃度間差異極顯著(P<0.01)。由表6可見，在乙胺嘧啶藥物組中，同一時間各質(zhì)量濃度組間抑制新孢子蟲效果均差異極顯著(P<0.01)。

由表2可知，在雙氫青蒿素藥物組中，同一時間各質(zhì)量濃度組間抑制弓形蟲的效果均差異極顯著(P<0.01)。由表3可知，在青蒿素藥物組中，同一時間各質(zhì)量濃度組間抑蟲效果差異極顯著(P<0.01)。由表4可見，在樺褐孔菌多糖藥物組中，同一時間各質(zhì)量濃度組間抑制弓形蟲效果均差異極顯著(P<0.01)。由表5可見,在黃芩苷藥物組中，同一時間高濃度質(zhì)量濃度組間抑制弓形蟲效果差異顯著(P>0.05)，低質(zhì)量濃度組間差異極顯著(P<0.01)。由表6可見,在乙胺嘧啶藥物組中，同一時間高質(zhì)量濃度組間抑制新孢子蟲效果無顯著差異(P>0.05)，低質(zhì)量濃度組間差異極顯著(P<0.01)。

3 討論與結(jié)論

目前，針對新孢子蟲病和弓形蟲病已經(jīng)進(jìn)行了一定的研究。但在新孢子蟲病和弓形蟲病防治方面仍無有效方法，因此體外篩選出安全有效的抗新孢子蟲與弓形蟲藥物至關(guān)重要。青蒿素及其衍生物雙氫青蒿素具有抗瘧疾、抗腫瘤作用[11]；樺褐孔菌多糖具有降血糖、抗菌、抗病毒的作用；黃芩苷作為一種黃酮類化合物具有抑菌、抗癌抗、病毒的作用；乙胺嘧啶可抑制二氫葉酸還原酶，因而干擾瘧原蟲的葉酸正常代射，對瘧原蟲紅細(xì)胞有一定效果，可作為預(yù)防用藥[12]。由此，該試驗應(yīng)用雙氫青蒿素、青蒿素、樺褐孔菌多糖、黃芩苷、乙胺嘧啶等進(jìn)行了體外抑制新孢子蟲與弓形蟲研究，以此確定各種藥物的體外抗蟲作用。

該試驗基于謝素珠[10]等抗新孢子蟲試驗基礎(chǔ)上進(jìn)行改良，藥物的試驗濃度進(jìn)行了小幅度變化，并且在體外的抑蟲試驗觀察間隔縮短為12 h，而且為配合總體試驗時間將總時間縮短12 h。觀察時間間隔的縮短可以使對于各藥物不同時間段對于蟲體的作用情況清晰明確，便于對于各時間段蟲體的觀察與比對。但與之對應(yīng)的缺點是過于頻繁的將蟲體從細(xì)胞培養(yǎng)箱取出至室外觀察且每次觀察時間較長，雖在總時間上進(jìn)行了微調(diào)整，但對于細(xì)胞及蟲體生長狀況可能有一定影響，引起部分試驗結(jié)果偏差。

謝素珠[10]等應(yīng)用青蒿素、樺褐孔菌多糖、黃芩苷、乙胺嘧啶等藥物對體外培養(yǎng)的新孢子蟲進(jìn)行了抑制作用研究，該試驗在此基礎(chǔ)上應(yīng)用雙氫青蒿素、青蒿素、樺褐孔菌多糖、黃芩苷、乙胺嘧啶等進(jìn)行了體外抑制新孢子蟲與弓形蟲研究，目的是確定雙氫青蒿素在抗新孢子蟲和弓形蟲方面的作用。5種藥物作用效果均與藥物濃度顯現(xiàn)正相關(guān)，即在安全范圍內(nèi)濃度越高，抑蟲效果越好。表明雙氫青蒿素、青蒿素、樺褐孔菌多糖、黃芩苷、乙胺嘧啶均可作為抗新孢子蟲與弓形蟲潛在藥物，該試驗證實，雙氫青蒿素在質(zhì)量濃度為20 mg/L時抑制新孢子蟲效率最高為97.69%，抑制弓形蟲效果最好為86.56%。為體內(nèi)藥物試驗奠定了基礎(chǔ)。