不同血酮水平下產(chǎn)后奶牛生理機能變化規(guī)律研究

郭啟勇，吳心華，張瑞雪，任 曼，唐玉林，郭延生*

（1.寧夏大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750021；2.甘肅省隴南市動物衛(wèi)生監(jiān)督所，甘肅 隴南 746000）

【研究意義】奶牛在圍產(chǎn)期物質(zhì)代謝和內(nèi)分泌系統(tǒng)中都發(fā)生著巨大的變化，在圍產(chǎn)期內(nèi)普遍存在能量負平衡（negative energy balance，NEB）[1]，較長一段時間碳水化合物攝入不足和泌乳消耗大量的糖，導(dǎo)致血糖降低，機體為滿足能量的需要而動用大量體脂，使得血中非脂化脂肪酸濃度升高，血液中非酯化脂肪酸（NEFA）和β-羥基丁酸（BHBA）濃度升高[2]。研究表明奶牛酮病不但影響奶牛的產(chǎn)奶量和牛奶質(zhì)量，還會繼發(fā)其他疾病。【前人研究進展】引起奶牛酮病的主要原因是碳水化合物和脂肪代謝紊亂；其次，真胃變位、前胃遲緩、產(chǎn)后癱瘓、乳房炎、瘤胃臌氣、創(chuàng)傷性網(wǎng)胃炎、鈣、磷等礦物質(zhì)的缺乏和內(nèi)分泌紊亂也可以引發(fā)酮病。在圍產(chǎn)后期，分娩應(yīng)激會導(dǎo)致奶牛采食量降低，而體內(nèi)脂肪動員容易產(chǎn)生大量的非酯化脂肪酸和酮體，引起酮病。酮病根據(jù)發(fā)病原因，分為原發(fā)性和繼發(fā)性；根據(jù)臨床癥狀的不同，分為神經(jīng)型、癱瘓型和消化型，其中以消化型最為常見[3]。酮病可導(dǎo)致每頭牛在整個泌乳期產(chǎn)奶量損失200～230 kg[4]。

【本研究切入點】我國規(guī)模化牧場的酮病發(fā)病率在15%～30%，并且逐年遞增[5]，酮病根據(jù)病程分為臨床型酮病和亞臨床型酮病，血液中的酮體是血液中丙酮、乙酰乙酸和β羥丁酸的總和，臨床上通過BHBA預(yù)測奶牛健康和生產(chǎn)狀況，1.5～2.9 mmol/L 定為亞臨床型酮病，3 mmol/L 以上定為臨床型酮病[6]。亞臨床酮病在過渡期奶牛中流行，典型的牛群發(fā)病率在40%～60%[7-8]。BHBA 濃度增加會抑制糖異生，減少DMI和造成免疫抑制，BHBA 的檢測作為現(xiàn)代規(guī)?；翀霁F醫(yī)臨床常用的監(jiān)測手段，通過測定BHBA 的大小來制定奶牛產(chǎn)后的保健方案[9]。BHBA 已經(jīng)用來定義牧場產(chǎn)后奶牛是否患有臨床型酮病或亞臨床型酮病，BHBA 與奶牛的健康和生產(chǎn)性能有直接關(guān)系[10-11]。目前關(guān)于產(chǎn)后奶牛不同酮體值下生理機能變化的研究較少，【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究通過對奶牛產(chǎn)后不同酮體值的生理指標進行測定和分析，旨在揭示產(chǎn)后奶牛在不同BHBA下生理機能的變化規(guī)律。

1 試驗材料

1.1 試驗動物及樣品采集

試驗動物均為中國荷斯坦奶牛，樣品采集均于2019年9月至11月在寧夏某規(guī)?；膛ｐB(yǎng)殖場進行。選取2～3 胎次的荷斯坦奶牛20 頭。奶牛場每天擠奶3 次，采用全混合日糧（TMR）飼喂，自由飲水，圍產(chǎn)期按照圍產(chǎn)期奶牛飼料配方飼喂。產(chǎn)后1 h 內(nèi)將益康XP 250 g、丙酸鈣450 g、硫酸鎂100 g、鹽50 g、丙二醇200 mL 和溫水20 L 混合經(jīng)瘤胃導(dǎo)管灌服。采集產(chǎn)后0，7，14，21，28 d等時間段的血液樣品，肝素抗凝分離血漿，-196 ℃液氮保存。

1.2 主要儀器及樣品檢測

超低溫冰箱（Thermo，美國）；Varioskan Flas F 全波長多功能酶標儀（Thermo，美國）;邁瑞獸用全自動生化分析儀（深圳邁瑞，中國），血酮檢測儀（Abbott Diabetes，墨西哥）；LD4-2A 低速離心機（北京離心機廠，中國）等。

極低密度脂蛋白（VLDL）酶聯(lián)免疫分析法，非酯化脂肪酸（NEFA）、總膽固醇（TCH）、甘油三酯（TG）酶比色法，谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）速率法，堿性磷酸酶（ALP）酶動力學(xué)法，谷氨酰轉(zhuǎn)移酶（GGT）γ-谷氨酰-3-羧基-4-硝基苯胺法，總蛋白（TP）雙縮脲法，白蛋白（ALB）溴甲酚綠法，低密度脂蛋白（LDL-C）選擇性清除法，高密度脂蛋白（HDL-C）選擇性抑制法，載脂蛋白A（APoA1）、載脂蛋白B（APoB）免疫濁度法。

1.3 統(tǒng)計方法

采用SPASS 25.0 進行單因素方差分析，結(jié)果用平均值±標準誤（X—±SD）表示，P＜0.05 為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果分析

2.1 不同BHBA下肝功能相關(guān)生化指標測定

血漿中AST、GLB、TP 的濃度臨床型組極顯著高于其他組（P＜0.01）；血漿中ALP 的濃度正常組極顯著低于其他各組（P＜0.01）；血漿中GGT亞臨床組顯著高于其他組（P＜0.05）；血漿中ALB的濃度各組之間差異不顯著（P＞0.05）；血漿中ALT 的濃度臨床型組極顯著低于其他各組（P＜0.01）；血漿中GLB 的濃度臨床型組顯著高于其他各組（P＜0.05）。詳細見表1和圖1。

圖1 不同BHBA奶牛肝功相關(guān)生化指標變化規(guī)律Fig.1 Changes in liver function-related biochemical indicators of cows with different BHBA

表1 不同BHBA奶牛肝功相關(guān)生化指標測定Tab.1 Determination of liver function-related biochemical indicators of cows with different BHBA （n=10，X—±SD）

2.2 不同酮體值下奶牛脂代謝相關(guān)生化指標檢測

血漿中BHBA 的濃度臨床組極顯著高于其他各組（P＜0.01）；血漿中LDL-C、HDL-C 的濃度臨床組顯著高于其他各組（P＜0.05），且隨著酮體值的升高呈現(xiàn)升高趨勢；血漿ApoA1、ApoB 濃度在NEB 組顯著高于其他各組（P＜0.05）；血漿中NEFA、TCH、TG 濃度臨床組極顯著高于其他各組（P＜0.01），且隨著酮體值的升高呈現(xiàn)升高趨勢，詳見表2和圖2。

圖2 不同BHBA奶牛脂質(zhì)代謝相關(guān)生化指標變化規(guī)律Fig.2 Changes in lipid metabolism-related biochemical indicators of dairy cows with different BHBA

表2 不同BHBA奶牛脂質(zhì)代謝相關(guān)生化指標變化規(guī)律Tab.2 Biochemical indexes related to lipid metabolism of different BHBA dairy cows（n=9，X—±SD）

3 討論與結(jié)論

3.1 酮體值對肝功能的影響

肝臟是能量代謝和轉(zhuǎn)化的主要場所，對奶牛的正常生產(chǎn)具有重要意義。AST 存在于組織的細胞質(zhì)或線粒體中，特別是在肝臟、心臟和骨骼肌中[12]。因此，這些組織中AST 活性最高。當(dāng)脂肪肝發(fā)生時，細胞膜通透性增加，酶釋放到血液中，血液中酶的活性增加，AST 還可以作為脂肪肝診斷中肝脂沉積的標志物[13]。在本研究中，臨床型組BHBA 的濃度極顯著于其他組，BHBA 大于2.3 mmol/L 時，血漿中AST 的濃度最高，AST 升高說明奶牛存在不同程度的肝臟損傷[14]。本研究中臨床型酮病組奶牛血漿中AST 的濃度顯著高于其他各組，說明酮體值的升高與肝臟的破壞呈現(xiàn)正相關(guān)。也有資料表示當(dāng)奶牛血漿中AST＞100 U/L，奶牛就存在脂肪肝風(fēng)險[15]。GGT 主要存在于家畜的腎臟，在奶牛乳腺中，GGT 存在于腺體上皮，活性可能與氨基酸代謝強度有關(guān)[16]，本研究中亞臨床型組顯著高于其他組，這可能與奶牛在亞臨床酮病時期的泌乳有關(guān)，也有研究表明肝臟的代謝紊亂也會加劇血液中GGT 濃度的升高[17]。

TP具有維持血液正常膠體滲透壓和pH，調(diào)節(jié)被運輸物質(zhì)的生理作用和營養(yǎng)作用等功能。血清總蛋白不僅可用于機體營養(yǎng)狀態(tài)的監(jiān)測，還可用于疾病的診斷及鑒別診斷[18-19]。隨著BHBA 的升高，臨床型組顯著高于其他各組，說明酮體除了影響奶牛的DMI、氧化應(yīng)激和肝細胞凋亡，還導(dǎo)致肝臟TP 的可用性和蛋白質(zhì)生物合成的降低。血漿中ALP 的含量在NEB 組和亞臨床型組明顯高于其他兩組，說明當(dāng)BHBA 達到1.4 以上時，肝臟已經(jīng)開始受到損傷。ALP 存在于機體肝臟的組織中，當(dāng)肝臟發(fā)生疾病時，血漿中ALP 增多。ALB 在各組之間沒有表現(xiàn)差異性，ALB 用于維持身體滲透壓和酸堿平衡[20]，說明酮體值的變化沒有影響奶牛的體液平衡。當(dāng)機體遭遇到外來侵害時，免疫系統(tǒng)會刺激淋巴細胞產(chǎn)生更多的GLB，直到入侵物被球蛋白消滅為止[21-22]，本研究中臨床型組血漿中GLB 的濃度顯著高于其他各組，說明酮體值升高導(dǎo)致免疫能力下降，容易受到病原微生物的侵襲。

3.2 酮體值對脂代謝的影響

脂質(zhì)不溶于血漿，無法直接運輸?shù)侥I上腺，性腺等組織，轉(zhuǎn)運過程中必須將其包裝成脂蛋白[23]。HDL-C除了抑制脂質(zhì)氧化、抗炎和抗細胞凋亡的作用之外，還具有促進膽固醇的逆向轉(zhuǎn)運。將外周血液和組織中的膽固醇運送到肝臟，合成脂蛋白、維生素和激素[24]。在本研究中發(fā)現(xiàn)，隨著BHBA 的升高，血漿中HDL-C 的濃度也在升高，而且臨床型組極顯著高于其他組。說明肝臟代謝的異常會促進脂質(zhì)氧化分解。LDL-C 是富含膽固醇的脂蛋白，運載膽固醇進入外周組織細胞的脂蛋白顆粒，其余的則由VLDL攜帶[25]。LDL-C 在臨床上通常用來監(jiān)測心血管疾病，通過調(diào)節(jié)LDL-C 來治療心血管疾病[26]。有研究表明血漿中LDL-C 升高，血脂代謝就會發(fā)生異常[27]，本研究中臨床組顯著高于其他各組，說明BHBA 的升高能夠影響血脂代謝，促使產(chǎn)后奶牛脂質(zhì)代謝異常。

ApoA1 是ApoA 族最多的一種組分，是HDL 中的主要載脂蛋白[28]，可以調(diào)節(jié)血漿和細胞內(nèi)的脂質(zhì)代謝，通過直接受受體介導(dǎo)的機制促進兒茶酚胺誘導(dǎo)的脂肪分解[29]。在本研究中，NEB 組顯著高于其他3 組，但ApoA1的變化并不具備規(guī)律性，ApoA1的組內(nèi)差異較大，關(guān)于BHBA 是否是影響ApoA1變化的因素還需要做進一步研究。ApoB 由肝臟合成，是LDL-CHOL 的主要結(jié)構(gòu)蛋白，主要功能是運輸脂類物質(zhì)和充當(dāng)LDL 受體用來介導(dǎo)清除配體[30]。研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)BHBA 升高之后，開始呈現(xiàn)顯著上升趨勢，說明BHBA升高之后ApoB會相應(yīng)的升高。

血漿中NEFA 的濃度直接反映脂肪組織的破壞程度。NEFA 濃度過高會導(dǎo)致肝臟脂肪浸潤，這與圍產(chǎn)期代謝性疾病的發(fā)病率較高有關(guān)[31]。NEFA還可以作為肝臟功能代謝的評價指標[32]。臨床型組顯著高于其他各組，這與前人研究一致[33]。說明NEFA進入肝臟生成酮體越高。NEFA具有肝毒性，可以增強細胞因子如腫瘤壞死因子的毒性，增加線粒體腫脹和滲透性、肝細胞變性、壞死或凋亡[34]。關(guān)于NEFA與酮病的關(guān)系，與之前的研究結(jié)果一致[35]。

TG 和TCH 是衡量血脂的重要指標，在動物體內(nèi)不能直接溶于血漿，在體內(nèi)的運輸需要包裝成脂蛋白顆粒，主要分為乳糜微粒、VLDL、LDL 和HDL[36]。本次研究中TG 隨著BHBA 的顯著升高，臨床組顯著高于其他各組，說明酮體會導(dǎo)致TG 代謝障礙。反芻動物利用TG 有兩種方式，一種是經(jīng)過水解生成脂肪酸，另一種是以VLDL 運出體外。由于反芻動物缺乏脂蛋白酶，所以水解TG 的能力就會下降，主要以VLDL 的形式排出體外[37]。TCH 是構(gòu)成生物膜和血漿脂蛋白的可氧化脂質(zhì)[38]，本研究中TCH 隨著BHBA的升高呈現(xiàn)顯著性升高趨勢，說明生成酮體需要消耗的大量TCH。

酮體值可以作為肝臟代謝和脂質(zhì)代謝的預(yù)警。