雙葉細(xì)辛甲醇提取物對12種農(nóng)業(yè)病原真菌抑菌活性研究

夏玉蓮，曹 云，伍顯鋒，曹鳳勤，侯宗敏，董存柱

（海南大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院/熱帶農(nóng)林生物災(zāi)害綠色防控教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 海口 570228）

【研究意義】細(xì)辛屬植物作為中藥材，主要有止咳平喘、消炎鎮(zhèn)痛、抗菌抗病毒、抗癌細(xì)胞、抗氧化抗衰老、免疫調(diào)節(jié)（免疫活化或免疫抑制）以及對心血管和神經(jīng)系統(tǒng)的影響等[1－2]。其中眾多細(xì)辛屬植物中，作為中藥細(xì)辛應(yīng)用的主要是遼細(xì)辛（Asarum heterotropoidesFr.Schmidt var.mandshuricum（Maxim.）Kitag）和華細(xì)辛（Asarum sieboldiiMiq.）的干燥全草。雖然遼細(xì)辛和華細(xì)辛在醫(yī)藥方面以及農(nóng)業(yè)方面具有很好的效果，但是遼細(xì)辛和華細(xì)辛生長緩慢，炮制工藝復(fù)雜，價(jià)格偏貴，因此其他多種地產(chǎn)細(xì)辛亦可入藥，這類細(xì)辛統(tǒng)稱為土細(xì)辛，雙葉細(xì)辛是土細(xì)辛的一種[3－4]。雙葉細(xì)辛（Asarum caulescensMaxim.）為馬兜鈴科（Aristolochiaceae）細(xì)辛屬（Asarum）植物，別名：土細(xì)辛、烏金草，主要分布于我國陜西、甘肅、湖北、四川、貴州。民間手抄本記載雙葉細(xì)辛具有行氣鎮(zhèn)痛之功效，鄂西北山區(qū)民間常用于治療胃痛、腹痛、胸疼痛等痙攣性疼痛病癥[5]。由于合成農(nóng)藥潛在的健康和環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)，再加上其非選擇性和抗蟲性，人們對更安全和可生物降解的蟲害防治替代品的需求越來越大。植物源農(nóng)藥因其非持久性、高選擇性和低哺乳動(dòng)物毒性而成為一種很有前途的替代品。目前國際上都在號(hào)召應(yīng)用綠色農(nóng)藥替代傳統(tǒng)農(nóng)藥，生產(chǎn)出活性高、成本便宜、對環(huán)境影響較小、對人類無害的新型農(nóng)藥已成為農(nóng)藥研究的主要內(nèi)容，而植物源農(nóng)藥因其本身具有的大量優(yōu)點(diǎn)使其成為新型綠色農(nóng)藥的研究熱點(diǎn)[6-7]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】雙葉細(xì)辛通常被應(yīng)用在醫(yī)藥方面，有民間手抄本記載雙葉細(xì)辛具有行氣鎮(zhèn)痛之功效，鄂西北山區(qū)民間常用于治療胃痛、腹痛、胸疼痛等痙攣性疼痛病癥[8]。有研究[9-10]報(bào)道遼細(xì)辛的乙醇提取物具有較好體外抗炎活性。朱順英[3]運(yùn)用GC/MS測定了雙葉細(xì)辛揮發(fā)油的成分，并發(fā)現(xiàn)了雙葉細(xì)辛揮發(fā)油對革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌、3種酵母菌等具有良好抑制活性，可以應(yīng)用臨床藥學(xué)研究中。在農(nóng)業(yè)防治上，劉南南等[11]發(fā)現(xiàn)遼細(xì)辛精油對瓜類果斑病菌具有一定的抑菌效果。劉海燕等[12]發(fā)現(xiàn)細(xì)辛揮發(fā)油對對白菜葉斑病菌（Alternaria brassicae）、葡萄孢霉（Botrytis cinerea）、茄立枯病菌（Rhizoctonia solani）表現(xiàn)完全抑制作用，對人參疫霉菌（Phytophthora cactorum）、綠色木霉菌（Trichoderma viride）、煙草赤星病菌（Alternaria alternata）、燕麥鐮孢（Fusarium avenaceum）抑制作用相對較強(qiáng)。楊銀書等[13]發(fā)現(xiàn)華細(xì)辛揮發(fā)油對媒介硬蜱的若蟲和成蟲、黃胸散白蟻、南方根結(jié)線蟲2齡幼蟲等都有一定的抑制和毒殺效果?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前關(guān)于雙葉細(xì)辛的研究主要集中在藥用價(jià)值以及醫(yī)學(xué)研究方面，而在農(nóng)業(yè)方面的研究應(yīng)用報(bào)道較少[3]。從植物中分離純化具有農(nóng)用活性的天然化合物，以此先導(dǎo)化合物為結(jié)構(gòu)模板，進(jìn)行結(jié)修飾、優(yōu)化、合成，從而研發(fā)出高效低毒的新型農(nóng)藥是植物農(nóng)藥的研究重點(diǎn)[14]?！緮M解決的關(guān)鍵問題】雙葉細(xì)辛由于分布廣泛，價(jià)格相較華細(xì)辛和遼細(xì)辛便宜，因此通過對雙葉細(xì)辛甲醇提取物對12種熱帶常見農(nóng)業(yè)病原真菌展開抑菌活性研究，以期為熱帶農(nóng)業(yè)植物病原菌防治提供理論基礎(chǔ)及技術(shù)支撐。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 雙葉細(xì)辛 雙葉細(xì)辛中藥材購自安徽毫州皖北趙氏藥業(yè)，由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)李秉濤教授鑒定，標(biāo)本保存在海南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，編號(hào)20200525。

1.1.2 供試菌種 蘋果輪紋病菌（Botryosphaeria dothidea）、香蕉炭疽病菌（Colletotrichum musae）、番茄早疫病菌（Alternaria solani）、芒果蒂腐病菌（Botryodiplodia theobromae）、芒果炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioidesPenz.）、芒果炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）、火龍果黑斑病菌（Bipolaris cactivora（Petrak）Alcorn）、水稻稻瘟菌（Pyricularia oryaeCavara）、小麥赤霉病菌（Fusarium graminearumSchwabe）、橡膠炭疽病菌（Colletotrichum siamense）、香蕉枯萎病菌4 號(hào)生理小種（Fusarium oxysporumf.sp.cubenseRace 4）、椰子可可毛色二孢菌（Lasiodiplodia theobromae）。以上菌種均由海南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院提供，菌種保存于4 ℃冰箱，活化后備用。

1.2 方法

1.2.1 雙葉細(xì)辛粗提物的制備 采用冷浸提法[15]，將采購于安徽毫州皖北趙氏藥業(yè)的1 kg雙葉細(xì)辛置于電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中，控溫（50±2）℃烘干后，經(jīng)粉碎機(jī)粉碎，將粉碎后粉末置于甲醇中浸泡，溶劑∶干粉=5∶1（體積/質(zhì)量），3 d后抽濾，濾液在60 ℃減壓蒸餾濃縮，即得到甲醇粗提取浸膏，殘?jiān)偌尤胪康募状祭^續(xù)浸泡，反復(fù)3次，合并3次浸提膏，得到雙葉細(xì)辛甲醇粗提取浸膏。將甲醇浸膏加適量的超純水溶解，分別用石油醚、氯仿、乙酸乙酯進(jìn)行萃取，將各相旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至膏狀即得到石油醚相、氯仿相以及乙酸乙酯相，剩下即為水相，置于冰箱4 ℃保存，備用。

1.2.2 雙葉細(xì)辛各相萃取物對植物病原真菌菌絲生長抑制活性測定 采用生長速率法[16-17]，測定雙葉細(xì)辛提取物對供試病原真菌的抑菌活性。稱取2 g 的雙葉細(xì)辛各相萃取物分別溶解于4 mL N，N-二甲基甲酰胺中，然后在超凈工作臺(tái)中各取400 μL 溶解后分別融于199.6 mL 已冷卻至50 ℃的PDA 培養(yǎng)基中，配置終質(zhì)量濃度為1 mg/mL 的帶藥培養(yǎng)基，倒入直徑9 cm 的培養(yǎng)皿中冷卻凝固，以僅加入等量N，N-二甲基甲酰胺的PDA 培養(yǎng)基作為空白對照。取在PDA 培養(yǎng)基上預(yù)先培養(yǎng)好的病原菌，在菌落邊緣用直徑5 mm 的打孔器切取生長一致的菌餅，移植到培養(yǎng)皿的中心。每組處理重復(fù)3 次，并放置于28 ℃室內(nèi)倒置培養(yǎng)，待菌落直徑長至培養(yǎng)皿直徑的2/3 后，用十字交叉法測量并記錄菌落直徑[18]，以下公式計(jì)算抑菌率：

1.2.3 雙葉細(xì)辛各相萃取物對植物病原真菌菌絲生長的EC50測定 選取抑制率在70%以上的供試病原菌測定EC50。用一定量N，N-二甲基甲酰胺溶解各相待測萃取物，并用0.5%吐溫-80 水溶液稀釋成1 000，500，250，125，62.5 mg/mL系列質(zhì)量濃度梯度的母液，將配置好的母液用0.22 μm針頭過濾器過濾，然后在超凈工作臺(tái)中各取0.1 mL 母液加入49.9 mL 已冷卻至50 ℃的PDA 培養(yǎng)基中，配成最終質(zhì)量濃度為2，1，0.5，0.25，0.125 mg/mL的帶藥培養(yǎng)基，接種方法同1.2.2。

1.2.4 雙葉細(xì)辛甲醇提取物和各相萃取物對香蕉炭疽病菌分生孢子萌發(fā)相對抑制率測定 采用瓊脂平板表面萌發(fā)法，取長勢良好的香蕉炭疽病菌，用無菌水配制成1×107cfu/mL 的孢子懸浮液。用一定量的N，N-二甲基甲酰胺溶解各萃取相，并用0.22 μm 針頭過濾器過濾，然后用0.5%吐溫-80 水溶液稀釋，配置成終質(zhì)量濃度分別為8，4，2，1，0.5，0.25 mg/mL 的藥液。用無菌打孔器打取水瓊脂塊置于載玻片上，待凝固后，將配制好的各質(zhì)量濃度藥液分取20 μL 均勻涂布于水瓊脂塊上，而后再取20 μL孢子懸浮液滴于培養(yǎng)基表面，用涂布棒涂勻，涂布完成后，將載玻片放置于底部鋪有潤濕濾紙片的培養(yǎng)皿內(nèi)，密封放置于微生物培養(yǎng)箱中，28 ℃黑暗條件下培養(yǎng)6 h，含有相同量的N，N-二甲基甲酰胺和0.5%吐溫-80 的無菌水作為空白對照，每個(gè)處理設(shè)3 個(gè)重復(fù)，待對照分生孢子萌發(fā)80%以上時(shí)，按下述公式計(jì)算孢子萌發(fā)率。

1.2.5 離體法測定雙葉細(xì)辛甲醇提取物和各相萃取物對香蕉果實(shí)炭疽病的防治效果 將雙葉細(xì)辛各相萃取物溶于一定量的N，N-二甲基甲酰胺中，用0.5%吐溫-80水溶液稀釋成10 mg/mL的溶液。挑選成熟且形狀、大小比較一致、沒有破損和病斑的香蕉，清洗表面，晾干備用。用噴壺將各相藥液噴施到香蕉表面，每個(gè)香蕉噴施10 mL，用0.2 mg/mL 的多菌靈作為陽性對照，含有相同量的N，N-二甲基甲酰胺和0.5%吐溫-80 的無菌水作為空白對照。24 h后，在香蕉表面噴灑等體積的1×107cfu/mL 香蕉炭疽病菌分生孢子懸浮液，將處理后的香蕉放入塑料盒中，用保鮮膜封好，28 ℃培養(yǎng)。7 d后，觀察發(fā)病情況并分級，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次，每次實(shí)驗(yàn)3個(gè)重復(fù)。

按照以下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分級，即0 級：無??；1 級：病斑面積占果實(shí)面積的5%以下；3 級：病斑面積占果實(shí)面積的6%～10%；5 級：病斑面積占果實(shí)面積的11%～25%；7 級：病斑面積占果實(shí)面積的26%～50%；9 級：病斑面積占果實(shí)面積在50%以上。計(jì)算公式如下：

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 25、Excel 2019軟件分析處理數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析、計(jì)算毒力回歸方程及EC50。

2 結(jié)果與分析

2.1 雙葉細(xì)辛各相提取物抑菌活性粗篩

通過甲醇浸泡得到甲醇粗提物125.64 g，分別用石油醚、乙酸乙酯萃取后得到石油醚相32.39 g、乙酸乙酯相16.53 g、水相79.44 g。從圖1和表1可以看出雙葉細(xì)辛各相萃取物在1 mg/mL 的質(zhì)量濃度下對供試病原菌均具有一定抑菌活性。雙葉細(xì)辛甲醇粗提物對各種病原真菌的抑菌率由高到低依次為火龍果黑斑病菌100%、小麥赤霉病菌99.75%、芒果蒂腐病菌99.72%、番茄早疫病菌95.17%、香蕉炭疽病菌93.13%、蘋果輪紋病菌92.20%、水稻稻瘟病菌89.31%、芒果炭疽病菌83.99%、芒果炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioidesPenz.）83.46%、可可毛色二孢菌75.17%、橡膠炭疽病菌72.73%和香蕉枯萎病菌59.10%。雙葉細(xì)辛石油醚相對各種病原真菌的抑菌率由高到低依次為香蕉炭疽病菌99.51%、芒果蒂腐病菌97.84%、小麥赤霉病菌92.37%、水稻稻瘟病菌91.23%、芒果炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioidesPenz.）85.35%、芒果炭疽病菌85.26%、火龍果黑斑病菌81.16%、橡膠炭疽病菌80.68%、蘋果輪紋病菌79.73%、番茄早疫病菌78.68%、可可毛色二孢菌74.29%和香蕉枯萎病菌55.77%。雙葉細(xì)辛乙酸乙酯相抑菌活性在70%以上的由高到低依次是香蕉炭疽病菌99.95%、橡膠炭疽病菌97.09%、蘋果輪紋病菌81.46%和番茄早疫病菌76.90%，對芒果蒂腐病菌抑制效果最弱，抑菌率為0.39%。可以看出雙葉細(xì)辛甲醇粗提物以及石油醚相對各植物病原菌具有較好抑制活性，特別是對香蕉炭疽病菌、芒果蒂腐病菌、小麥赤霉病菌的抑制活性最好，甲醇粗提物和石油醚相的抑制率都在90%以上，乙酸乙酯相對香蕉炭疽病菌、橡膠炭疽病菌抑制活性最好，均在90%以上。

圖1 雙葉細(xì)辛各相萃取物對12種植物病原菌的抑制效果Fig.1 Inhibitory effect of extracts of Asarum caulescens Maxim.on 12 plant pathogens

表1 雙葉細(xì)辛各相萃取物對12種植物病原菌的抑菌活性Tab.1 Antimicrobial activity of different solvent extracts of Asarum caulescens Maxim.gainst 12 plant pathogenic fungi

2.2 雙葉細(xì)辛各相提取物對11種病原真菌的EC50測定

通過SPSS 25 計(jì)算出雙葉細(xì)辛提取物對11 種病原真菌的EC50值[19]，結(jié)果如表2 所示。雙葉細(xì)辛甲醇粗提物對11 種病原菌的EC50由小到大依次為：番茄早疫病菌0.096 mg/mL、橡膠炭疽病菌0.121 mg/mL、芒果炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioidesPenz.）0.122 mg/mL、小麥赤霉病菌0.129 mg/mL、香蕉炭疽病菌0.143 mg/mL、芒果炭疽病菌0.158 mg/mL、芒果蒂腐病菌0.166 mg/mL、水稻稻瘟病菌0.184 mg/mL、火龍果黑斑病菌0.188 mg/mL、蘋果輪紋病菌0.199 mg/mL和可可毛色二孢菌0.437 mg/mL，可以看出雙葉細(xì)辛甲醇粗提物對番茄早疫病菌的抑制效果最好。雙葉細(xì)辛石油醚相對11種病原菌的EC50由小到大依次為：火龍果黑斑病菌0.117 mg/mL、芒果蒂腐病菌0.138 mg/mL、小麥赤霉病菌0.157 mg/mL、蘋果輪紋病菌0.177 mg/mL、橡膠炭疽病菌0.177 mg/mL、番茄早疫病菌0.193 mg/mL、香蕉炭疽病菌0.202 mg/mL、芒果炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioidesPenz.）0.217 mg/mL、水稻稻瘟病菌0.247 mg/mL、可可毛色二孢菌0.299 mg/mL和芒果炭疽病菌0.318 mg/mL，可以看出雙葉細(xì)辛石油醚相對火龍果黑斑病菌的抑制效果最好。雙葉細(xì)辛乙酸乙酯相對5種病原菌的EC50由小到大依次為：香蕉炭疽病菌0.099 mg/mL、橡膠炭疽病菌0.199 mg/mL、火龍果黑斑病菌0.252 mg/mL、蘋果輪紋病菌0.447 mg/mL 和番茄早疫病菌0.789 mg/mL，可以看出雙葉細(xì)辛乙酸乙酯相對香蕉炭疽病菌抑制效果最好。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，雙葉細(xì)辛各相提取物對11種病原菌的菌絲生長均具有一定抑制效果，且不同萃取相對同一病原菌的抑菌效果不一樣，甲醇粗提物和石油醚相抑菌活性較好，因此推測殺菌活性成分主要集中在甲醇粗提物及石油醚相中。

表2 雙葉細(xì)辛各相提取物對11種植物病原菌的EC50值Tab.2 EC50 values of different solvent extracts of Asarum caulescens Maxim.gainst 11 plant pathogenic fungi

2.3 雙葉細(xì)辛甲醇提取物和各相萃取物對香蕉炭疽病菌分生孢子萌發(fā)相對抑制率測定

由于雙葉細(xì)辛甲醇提取物各萃取相對香蕉炭疽病菌的抑制效果明顯，于是進(jìn)行了雙葉細(xì)辛甲醇提取物和各相萃取物對香蕉炭疽病菌分生孢子萌發(fā)相對抑制率的測定，結(jié)果如圖2所示。由圖2A可知，雙葉細(xì)辛甲醇提取物對香蕉炭疽菌分生孢子萌發(fā)具有一定的抑制活性。隨著提取物質(zhì)量濃度的增加，其對香蕉炭疽病菌分生孢子萌發(fā)的抑制作用顯著增強(qiáng)。質(zhì)量濃度在2，4，8 mg/mL時(shí)，孢子萌發(fā)相對抑制率均在60%以上，分別為65.31%、81.04%和93.28%，質(zhì)量濃度為1 mg/mL 時(shí)，對孢子萌發(fā)的抑制活性明顯下降，孢子萌發(fā)相對抑制率為30.48%，質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL 和0.25 mg/mL 時(shí)，基本無抑制效果，孢子萌發(fā)相對抑制率僅為5.27%和3.47%。由圖2B 可知，雙葉細(xì)辛石油醚萃取相對香蕉炭疽菌分生孢子萌發(fā)也具有一定的抑制活性，隨著石油醚萃取相物質(zhì)量濃度的增加，其對香蕉炭疽病菌分生孢子萌發(fā)的抑制作用明顯增強(qiáng)，質(zhì)量濃度在2，4，8 mg/mL時(shí)，孢子萌發(fā)相對抑制率均在60%以上，分別為65.16%、73.11%和98.07%，質(zhì)量濃度為1，0.5，0.25 mg/mL 時(shí)，對孢子萌發(fā)的抑制活性明顯下降，孢子萌發(fā)相對抑制率分別為12.09%、7.16%和5.42%。由圖2C可知，雙葉細(xì)辛乙酸乙酯萃取相對香蕉炭疽菌分生孢子萌發(fā)具有一定的抑制活性，質(zhì)量濃度在2，4，8 mg/mL 時(shí)，孢子萌發(fā)相對抑制率均在90%以上，分別為97.44%、97.81%和99.18%，其抑制效果優(yōu)于同質(zhì)量濃度下的甲醇提取物和石油醚萃取相，且與1，0.5，0.25 mg/mL質(zhì)量濃度下的抑制效果差異達(dá)到顯著性水平。

圖2 雙葉細(xì)辛各相萃取物對香蕉炭疽病菌分生孢子萌發(fā)的抑制效果Fig.2 Relative inhibitory rates of the Asarum caulescens Maxim.on spore germination to Colletotrichum musa

2.4 離體法測定雙葉細(xì)辛甲醇提取物和各相萃取物對香蕉果實(shí)炭疽病的防治效果

經(jīng)過雙葉細(xì)辛石油醚萃取物和乙酸乙酯萃取物處理過的香蕉，1 周后仍處于輕微的發(fā)病狀態(tài)，只觀察到少量星狀病斑，發(fā)病程度明顯低于經(jīng)過甲醇處理過的香蕉，而空白對照組的香蕉已經(jīng)出現(xiàn)大量病斑，開始變黑，甚至腐爛（圖3）。離體法測定雙葉細(xì)辛甲醇提取物和各相萃取物對香蕉果實(shí)炭疽病的防治效果如表3所示，經(jīng)過10 mg/mL的雙葉細(xì)辛甲醇提取物、石油醚萃取物和乙酸乙酯萃取物處理過的香蕉的病情指數(shù)分別為75.66、54.07和51.11，而空白對照處理組的香蕉的病情指數(shù)為93.65，在10 mg/mL質(zhì)量濃度下的雙葉細(xì)辛石油醚萃取物和乙酸乙酯萃取物對香蕉炭疽病的防治效果分別為42.27%和45.42%，其防治效果優(yōu)于0.2 mg/mL的多菌靈。

表3 離體法測定雙葉細(xì)辛各相萃取物對香蕉果實(shí)炭疽病的防治效果Tab.3 Control effects of each extract of the Asarum caulescens Maxim.against Colletotrichum musae by in vitro method

圖3 離體法測定雙葉細(xì)辛各相萃取物對香蕉果實(shí)炭疽病的防治效果Fig.3 Control effects of each extract of the Asarum caulescens Maxim.against Colletotrichum musae by in vitro method

3 結(jié)論與討論

國內(nèi)外科研者關(guān)于中藥材提取物的殺菌活性已經(jīng)開展了大量的研究，從具有醫(yī)藥效果的中藥材出發(fā)尋找具有農(nóng)用活性的有效成分是植物源農(nóng)藥研究的一個(gè)創(chuàng)新方向。我國中草藥資源豐富，可以為科研研究提供多樣原材料，且在植物源農(nóng)藥的研究上也取得了很多的成果，可以作為一個(gè)植物源農(nóng)藥創(chuàng)制的新研究方向。雙葉細(xì)辛作為細(xì)辛屬植物中藥常被用于醫(yī)學(xué)研究，而在農(nóng)用抑菌效果及其抑菌成分的研究鮮見報(bào)道。由致病菌引起的病害會(huì)降低農(nóng)作物的產(chǎn)量和品質(zhì)，對糧食產(chǎn)業(yè)造成一定的影響，因此，本研究以具有醫(yī)用活性的雙葉細(xì)辛為供試材料，結(jié)合當(dāng)?shù)靥攸c(diǎn)，選取熱帶地區(qū)主要病原菌和其他作物主要病原真菌為靶標(biāo)菌，以此開展雙葉細(xì)辛提取物對12 種能夠引起多種植物病害、造成重大農(nóng)業(yè)損失的農(nóng)業(yè)病原真菌抑菌活性研究，因此本試驗(yàn)對熱帶農(nóng)業(yè)常見植物病害防治具有一定意義。

試驗(yàn)過程中采用甲醇浸泡雙葉細(xì)辛，再用石油醚、乙酸乙酯、水萃取雙葉細(xì)辛甲醇提取物，對雙葉細(xì)辛各相萃取物進(jìn)行抑菌活性檢測。研究發(fā)現(xiàn)，雙葉細(xì)辛甲醇提取物對水稻稻瘟菌、火龍果黑斑病菌、香蕉炭疽病菌、芒果炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）、芒果炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioidesPenz.）、小麥赤霉病菌、蘋果輪紋病菌、番茄早疫病菌、芒果蒂腐病菌、橡膠炭疽病菌、香蕉枯萎病菌12種植物病原真菌菌絲生長有明顯的抑制作用。結(jié)果中雙葉細(xì)辛甲醇粗提物對火龍果黑斑病菌的抑制效果高于石油醚相、乙酸乙酯相和水相，可能是由于甲醇粗提物中的活性成分在萃取過程中加熱揮發(fā)導(dǎo)致，可以進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)分離提取活性成分。本試驗(yàn)中雙葉細(xì)辛甲醇提取物對病原真菌的抑制效果具有一定的廣譜性，具有開發(fā)成為植物源殺菌劑的潛力。

另外，本研究發(fā)現(xiàn)，雙葉細(xì)辛甲醇提取物和石油醚萃取相比水相、乙酸乙酯萃取相的抑菌活性好，說明各萃取相的抑菌活性成分不同且主要抑菌活性物質(zhì)在石油醚相中，可用色譜技術(shù)對其做進(jìn)一步的分離，純化出活性單體化合物，為新農(nóng)藥的創(chuàng)制提供結(jié)構(gòu)新穎的先導(dǎo)化合物，豐富植物源天然產(chǎn)物農(nóng)藥的理論基礎(chǔ)。研究還發(fā)現(xiàn)，雙葉細(xì)辛提取物石油醚和乙酸乙酯萃取相1 mg/mL 的質(zhì)量濃度下都對香蕉炭疽病菌表現(xiàn)出最好的抑制效果，抑制率均達(dá)99%以上，優(yōu)于梁財(cái)?shù)萚16]研究報(bào)道的藥用植物山芝麻提取物對香蕉炭疽病菌的抑菌活性報(bào)道效果，推測雙葉細(xì)辛中存在對香蕉炭疽病菌具有較強(qiáng)抑菌活性的物質(zhì)，并通過孢子萌發(fā)實(shí)驗(yàn)和離體實(shí)驗(yàn)表明雙葉細(xì)辛甲醇提取物對香蕉炭疽病有一定防治效果，可以深入研究分離純化出有活性的化合物，這一發(fā)現(xiàn)對將來雙葉細(xì)辛開發(fā)成為防治香蕉炭疽病的植物源殺菌劑提供了一定的理論基礎(chǔ)。本研究只對雙葉細(xì)辛的抑菌活性進(jìn)行了初步研究，關(guān)于雙葉細(xì)辛中的抑菌活性化合物分離鑒定及其抑菌機(jī)理、作用方式等并未深入研究，并且還可以進(jìn)行田間藥效試驗(yàn)測定對農(nóng)作物病害的防治效果，有望開發(fā)出高效、天然、安全的新型植物源殺菌劑。