關(guān)節(jié)康治療骨性關(guān)節(jié)炎的網(wǎng)絡藥理學機制

彭鑫玉， 張海濤， 葛穎杰， 蔡淼鑫， 辛鵬飛， 王睿，李林鵬， 賴斌， 樊粵光， 龐智暉

（1.廣州中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院，廣東廣州 510405；2.廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院全國中醫(yī)髖關(guān)節(jié)病重點?？疲瑥V東廣州 510405；3.樊粵光廣東省名中醫(yī)傳承工作室，廣東廣州 510405）

骨性關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis）是一種常見的老年退行性關(guān)節(jié)病，又稱增生性關(guān)節(jié)炎、退行性關(guān)節(jié)炎或骨關(guān)節(jié)病。該病好發(fā)于髖、膝、踝等下肢負重關(guān)節(jié)，病變常常累及關(guān)節(jié)軟骨、軟骨下骨、滑膜等組織，最終導致患病關(guān)節(jié)疼痛、畸形和運動功能障礙，大大降低了患者的生活質(zhì)量[1-2]。骨性關(guān)節(jié)炎屬于中醫(yī)學“骨痹”的范疇?！稘健吩疲骸帮L寒濕三氣雜至，合而為痹，皆因體虛，腠理空虛，受風寒濕氣而痹也。”痹證的形成內(nèi)因是正氣不足，外因是風、寒、濕邪的侵入，內(nèi)虛外感而成痹。關(guān)節(jié)康為廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院的院內(nèi)制劑，是樊粵光教授以補腎活血法為組方依據(jù)，集臨床近20年的經(jīng)驗研制而成，治療骨性關(guān)節(jié)炎療效確切[3]。關(guān)節(jié)康由熟地黃、補骨脂、杜仲、枸杞、丹參、川芎、紅花、木香、牛膝、木瓜等10味中藥組成，具有補腎壯骨、活血化瘀之功效。既往研究表明，關(guān)節(jié)康通過促進軟骨基質(zhì)的合成，抑制軟骨基質(zhì)的分解進程，可達到促進病變關(guān)節(jié)軟骨修復的目的[4-5]。本研究基于網(wǎng)絡藥理學構(gòu)建復方-中藥有效成分-靶點基因-骨性關(guān)節(jié)炎疾病共表達網(wǎng)絡，并對交集基因進行富集分析，進一步探討關(guān)節(jié)康治療骨性關(guān)節(jié)炎的作用機制，以期為其臨床應用及后期試驗奠定理論基礎(chǔ)?，F(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1.1 關(guān)節(jié)康活性化合物及其作用靶點預測在中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫（TCMSP）中，分別檢索關(guān)節(jié)康中熟地黃、杜仲、枸杞、丹參、川芎、紅花、木香、牛膝、木瓜9味中藥。再依據(jù)毒藥物動力學參數(shù)（ADME），以生物利用度（OB）＞30%、類藥性（DL）＞0.18為限定條件，篩選9味中藥的有效成分及其作用靶點。因在TCMSP中未能檢索出補骨脂，故應用中藥分子機制的生物信息學分析工具（BATMAN-TCM，http://bionet.ncpsb.org/batmantcm）來預測補骨脂的作用靶點，其通過“藥物相似性分數(shù)”的原理進行靶點預測，藥物相似性分數(shù)指利用解剖-治療-化學的藥物分類系統(tǒng)（ATC）、藥物的副作用，化合物相互作用計分的相似度，蛋白相互作用網(wǎng)絡中心趨向性，功能富集相似度等計算得出各類相似分數(shù)，并通過LODO（leave-one-drug-out）法對預測結(jié)果進行驗證，確保預測更為精確。即：將關(guān)節(jié)康中藥的大寫拼音分別輸入至TCMSP或BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫中，并將預測靶點基因的條件設置為默認值，得出10味中藥的化合物成分及其預測的靶標基因。

1.2 骨性關(guān)節(jié)炎疾病靶點檢索以“osteoarthritis”為檢索詞，在GeneCards（https://www.genecards.org/）、在線人類孟德爾遺傳（OMIM）（https://omim.org/）2個在線數(shù)據(jù)庫中檢索骨性關(guān)節(jié)炎已知相關(guān)疾病靶點，將2個數(shù)據(jù)庫檢索出的疾病靶點匯總?cè)ブ睾蟮玫焦切躁P(guān)節(jié)炎疾病靶點。

1.3 關(guān)節(jié)康-骨性關(guān)節(jié)炎疾病交集靶點基因相互作用網(wǎng)絡的構(gòu)建及核心基因篩選獲取關(guān)節(jié)康相關(guān)預測作用靶點和骨性關(guān)節(jié)炎已知疾病靶點后，用R語言運行腳本取兩者靶點基因重疊交集，將交集基因?qū)隨TRING在線數(shù)據(jù)庫（http://stringdb.org/）進行蛋白相互作用網(wǎng)絡的構(gòu)建。通過R語言運行腳本分析計算每個靶點基因的鄰接基因數(shù)目（即靶點基因之間相互作用的連線數(shù)目），并采用Excel作條狀圖以直觀顯示。

1.4 關(guān)節(jié)康-靶點-骨性關(guān)節(jié)炎疾病調(diào)控網(wǎng)絡構(gòu)建為了進一步了解關(guān)節(jié)康治療骨性關(guān)節(jié)炎的作用機制，將上述3步得到的“關(guān)節(jié)康-靶點-骨性關(guān)節(jié)炎”靶點導入Cytoscape 3.7.2軟件（http://www.cytoscape.org）進行關(guān)節(jié)康治療骨性關(guān)節(jié)炎疾病可視化調(diào)控網(wǎng)絡模型的構(gòu)建，其結(jié)構(gòu)關(guān)系為“關(guān)節(jié)康-10味中藥-有效化合物-靶點-骨性關(guān)節(jié)炎”。

1.5 基因本體論（GO）分析GO分析是一個在生物信息學領(lǐng)域中廣泛運用的系統(tǒng)，它包括生物學的3個方面：細胞組分、分子功能、生物過程。DAVID數(shù)據(jù)庫是一個集生物功能注釋、網(wǎng)絡可視化和集成發(fā)現(xiàn)于一身的多功能生物信息數(shù)據(jù)庫。本研究應用DAVID分析工具（https://david.ncifcrf.gov/）對關(guān)節(jié)康-骨性關(guān)節(jié)炎疾病交集靶點基因進行GO富集分析，根據(jù)統(tǒng)計學超幾何分布定量（P值）評價存在于各GO注釋中的蛋白質(zhì)群，以P值反映蛋白質(zhì)生物學功能的顯著性。將物種與背景設置為“Homo sapiens”（人類），設定P＜0.01，得到關(guān)節(jié)康治療骨性關(guān)節(jié)炎的生物過程、分子功能、細胞組分結(jié)果。采用ImageGP在線作圖工具（http://www.ehbio.com/ImageGP/）制作GO分析結(jié)果氣泡圖。

1.6 京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析算法原理與GO富集分析相同。應用DAVID工具對關(guān)節(jié)康-骨性關(guān)節(jié)炎疾病交集靶點基因進行KEGG通路分析（設定P<0.01），將物種與背景設置為“Homo sapiens”（人類），得到關(guān)節(jié)康治療骨性關(guān)節(jié)炎的主要作用通路，并對其通路進行分析，采用ImageGP在線作圖工具制作KEGG通路氣泡圖。

2 結(jié)果

2.1 關(guān)節(jié)康有效化合物、作用靶點及骨性關(guān)節(jié)炎疾病靶點的預測結(jié)果通過TCMSP和BATMANTCM平臺檢索總共預測到關(guān)節(jié)康的有效化合物95個，其中，熟地黃1個，木香3個，木瓜2個，紅花14個，枸杞子9個，杜仲20個，丹參52個，川芎4個，川牛膝3個，補骨脂4個，中藥之間存在17個共同有效化合物。隨后，獲得其作用靶點共257個。通過GeneCards和OMIM數(shù)據(jù)庫共篩選獲得骨性關(guān)節(jié)炎疾病靶點共2 868個。取兩者靶點的交集，最終獲得關(guān)節(jié)康-骨性關(guān)節(jié)炎疾病交集靶點共109個。見圖1。

圖1 關(guān)節(jié)康和骨性關(guān)節(jié)炎疾病的交集靶點基因圖Figure 1 Venny diagram of intersection targets of Guanjie Kang and osteoarthritis

2.2 關(guān)節(jié)康-骨性關(guān)節(jié)炎疾病交集靶點基因相互作用可視化網(wǎng)絡及關(guān)鍵基因篩選結(jié)果利用STRING在線數(shù)據(jù)庫構(gòu)建了交集靶點基因蛋白相互作用網(wǎng)絡，見圖2。蛋白相互作用網(wǎng)絡包含38個蛋白質(zhì)節(jié)點，659條相互作用關(guān)系，即節(jié)點間的連接線。然后從STRING輸出string_interactions.tsv，并將其輸入Cytoscape 3.7.2軟件中，使用“CytoNCA”插件對該蛋白相互作用網(wǎng)絡模型做關(guān)鍵靶點篩選，以該網(wǎng)絡中的節(jié)點度值（Degree）大于平均值，獲得關(guān)鍵靶點基因38個。

圖2 關(guān)節(jié)康-骨性關(guān)節(jié)炎交集基因的蛋白相互作用網(wǎng)絡圖Figure 2 Protein-protein interaction network of Guanjie Kang-osteoarthritis intersection targets

2.3 關(guān)節(jié)康-靶點-骨性關(guān)節(jié)炎疾病可視化調(diào)控網(wǎng)絡采用Cytoscape 3.7.2軟件將關(guān)節(jié)康-靶點-骨性關(guān)節(jié)炎疾病繪制可視化調(diào)控網(wǎng)絡圖（見圖3），圖中清晰可見關(guān)節(jié)康中10味中藥與有效化合物、有效化合物與關(guān)鍵靶點基因、關(guān)鍵靶點基因與骨性關(guān)節(jié)炎疾病之間分別的對應關(guān)系。關(guān)鍵靶點基因所連接的有效化合物越多，表明度值越大，該靶點則更重要。網(wǎng)絡中，右邊V字四邊形38個節(jié)點為關(guān)鍵靶點基因，左邊三角形95個節(jié)點為有效化合物。錯綜復雜的“邊”（連線），代表了關(guān)節(jié)康中10味中藥所含的多種有效化合物通過多條途徑作用于靶點基因。

圖3 關(guān)節(jié)康-靶點-骨性關(guān)節(jié)炎疾病可視化調(diào)控網(wǎng)絡Figure 3 Visual controlling network of Guanjie Kangtarget-osteoarthritis

2.4 交集基因的GO富集分析結(jié)果應用DAVID在線分析工具對關(guān)鍵靶點基因進行分析，將P值設定為（P≤0.01）并按照P值升序排列獲得49個功能富集，其中，包括生物過程29個，分子功能10個，細胞組分10個。選取排名前10位的生物過程、分子功能、細胞組分繪成氣泡圖（見圖4），圖中氣泡顏色越深，氣泡越大，則表示功能富集的基因數(shù)目越多，該功能富集更為重要。GO富集分析結(jié)果顯示，關(guān)節(jié)康-骨性關(guān)節(jié)炎疾病交集關(guān)鍵基因的生物過程主要是RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控和DNA模板、藥物反應、一氧化氮（NO）生物合成過程的正調(diào)控、細胞對脂多糖的反應、凋亡過程負調(diào)控、血管生成、基因表達的正調(diào)控、序列特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性的正調(diào)控、細胞增殖的正調(diào)控等；分子功能為轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、蛋白磷酸酶結(jié)合、相同的蛋白結(jié)合、酶結(jié)合、生長因子活性、細胞因子活性、蛋白結(jié)合、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)DNA結(jié)合、轉(zhuǎn)錄激活活性-RNA聚合酶Ⅱ核心啟動子近端區(qū)序列特異性結(jié)合、蛋白質(zhì)異二聚活性等；細胞組分為細胞外空間、細胞外區(qū)域、胞質(zhì)、血小板-阿爾法顆粒管腔、轉(zhuǎn)錄因子復合物、細胞核、質(zhì)膜外側(cè)面、質(zhì)膜穴樣內(nèi)陷、核漿、受體復合體等。

圖4 關(guān)節(jié)康-骨性關(guān)節(jié)炎疾病交集基因的GO富集分析結(jié)果Figure 4 Go enrichment analysis results of Guanjie Kang-osteoarthritis intersection targets

2.5 關(guān)鍵基因的KEGG富集分析結(jié)果關(guān)節(jié)康-骨性關(guān)節(jié)炎疾病交集的關(guān)鍵靶基因的KEGG富集分析結(jié)果主要涉及癌癥通路、南美錐蟲病（美洲錐蟲?。?、TNF信號通路、缺氧誘導因子1（HIF-1）信號通路、膀胱癌、百日咳、乙型肝炎、利什曼病、沙門氏菌感染、癌癥中的蛋白多糖等信號通路。見圖5。

圖5 關(guān)節(jié)康-骨性關(guān)節(jié)炎疾病交集的關(guān)鍵靶基因的KEGG富集分析結(jié)果Figure 5 KEGG enrichment analysis results of key Guanjie Kang-osteoarthritis intersection targets

3 討論

本研究借助網(wǎng)絡藥理學手段，初步挖掘、分析關(guān)節(jié)康治療骨性關(guān)節(jié)炎的可能作用機制，并針對目前相關(guān)性較強且文獻研究較充足的通路進行分析討論。通過GO富集分析顯示，關(guān)節(jié)康主要通過RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、NO生物合成過程的正調(diào)控、細胞對脂多糖的反應、血管生成等作用于骨性關(guān)節(jié)炎疾病。生物過程中RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控的顯著性居于首位。目前研究發(fā)現(xiàn)在骨性關(guān)節(jié)炎患者的關(guān)節(jié)液和組織中觀察到炎癥反應，并且炎癥機制被認為是促進骨性關(guān)節(jié)炎進展的危險因素[6]，而RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控與炎癥機制密切相關(guān)。脂多糖又稱內(nèi)毒素，通過激活Toll樣受體4，引發(fā)一系列信號級聯(lián)反應，進而激活NF-κB，從而啟動一系列免疫相關(guān)基因[7-8]，導致炎性細胞浸潤，誘發(fā)或加重炎癥反應[9]。故推測關(guān)節(jié)康可能通過RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控和細胞對脂多糖的反應來控制炎癥進而達到治療骨性關(guān)節(jié)炎的目的。

骨性關(guān)節(jié)炎的主要病理改變?yōu)殛P(guān)節(jié)軟骨的進行性丟失和破壞[10-11]，軟骨損傷時會分泌蛋白來修復受損的細胞外基質(zhì)，該過程可導致軟骨的內(nèi)環(huán)境平衡改變，促進細胞因子分泌，影響凋亡通路，引起軟骨細胞凋亡發(fā)生[12]。受損的軟骨細胞產(chǎn)生一種介導軟骨細胞雙重作用的多功能分子一氧化氮（NO）[13]，NO可以保護培養(yǎng)的軟骨細胞免受氧化應激損傷，但NO升高可以抑制軟骨細胞中白細胞介素1受體拮抗劑（IL-1RA）的合成，而軟骨細胞產(chǎn)生的IL-1RA可有效抑制軟骨的損傷與破壞，故NO升高異常是骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)生的危險因素之一[14]。骨性關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)的血管生成與炎性反應相互影響[15]。骨性關(guān)節(jié)炎伴有滑膜炎癥，且病理特征為巨噬細胞浸潤，該細胞可分泌血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）[16]，VEGF可促進血管生成，有研究發(fā)現(xiàn)小鼠關(guān)節(jié)腔注射VEGF可誘發(fā)骨性關(guān)節(jié)炎[17]。軟骨細胞肥大（軟骨細胞表型發(fā)生改變）和軟骨內(nèi)血管生成存在相互依存關(guān)系[18]，骨性關(guān)節(jié)炎患者軟骨內(nèi)血管生成可能誘發(fā)軟骨內(nèi)成骨，進而引起關(guān)節(jié)軟骨細胞外基質(zhì)礦化[19]。因此，關(guān)節(jié)康可能通過作用于NO生物合成過程的正調(diào)控和血管生產(chǎn)等來調(diào)控關(guān)節(jié)軟骨生產(chǎn)、凋亡、鈣化等而達到治療骨性關(guān)節(jié)炎的目的，具體機制還需進一步研究。

通過KEGG富集分析，關(guān)節(jié)康主要通過癌癥通路、南美錐蟲病（美洲錐蟲?。NF信號通路、HIF-1信號通路、膀胱癌、百日咳、乙型肝炎、利什曼病、沙門氏菌感染、癌癥中的蛋白多糖等作用于骨性關(guān)節(jié)炎疾病。其中腫瘤通路的顯著性最高，目前有研究顯示，在骨性關(guān)節(jié)炎患者滑膜組織中發(fā)現(xiàn)了腫瘤信號通路的高調(diào)控，說明骨性關(guān)節(jié)炎滑膜組織具有腫瘤樣特性，因此腫瘤通路可能為骨性關(guān)節(jié)炎治療和診斷的潛在靶點基因[20]。本研究結(jié)果顯示，膀胱癌和癌癥中的蛋白多糖與骨性關(guān)節(jié)炎密切相關(guān)，則是對上述觀點的再次驗證。目前發(fā)現(xiàn)，TNF-α在骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)生、發(fā)展中起重要作用[21]，TNF-α在骨性關(guān)節(jié)炎患者血漿及關(guān)節(jié)液中的含量明顯高于正常人，并且TNF-α在關(guān)節(jié)內(nèi)的含量與骨性關(guān)節(jié)炎病變程度密切相關(guān)[22]。TNF-α在骨性關(guān)節(jié)炎中過度表達可導致滑膜增生肥厚，并引起關(guān)節(jié)軟骨的內(nèi)環(huán)境改變，加重骨性關(guān)節(jié)炎退化。因此，抑制TNF-α在滑膜中的表達，有利于降低骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率，減輕病變程度[23]。因關(guān)節(jié)軟骨中無血管，這限制了氧從滑液和軟骨下骨到軟骨細胞的擴散[24]。HIF-1由2個不同的亞基HIF-1α和HIF-1β組成，HIF-1α對軟骨細胞的存活具有重要作用[25]，HIF-2α是自噬通量的有效負調(diào)節(jié)因子[26]，對骨性關(guān)節(jié)炎起著整體有害作用，HIF-2α介導軟骨破壞以及軟骨細胞死亡，均促進骨性關(guān)節(jié)炎病程的發(fā)展[27]。目前，尚未發(fā)現(xiàn)骨性關(guān)節(jié)炎與南美錐蟲病（美洲錐蟲?。?、百日咳、乙型肝炎、利什曼病、沙門氏菌感染等感染性疾病有直接聯(lián)系。因此，推測關(guān)節(jié)康可能通過調(diào)控TNF和HIF-1來達到治療骨性關(guān)節(jié)炎的目的。

綜上所述，本研究基于網(wǎng)絡藥理學分析關(guān)節(jié)康治療骨性關(guān)節(jié)炎的作用機制，發(fā)現(xiàn)關(guān)節(jié)康可能是通過癌癥通路、TNF、HIF-1、NO生物合成過程的正調(diào)控、血管生成、RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控和細胞對脂多糖的反應等來治療骨性關(guān)節(jié)炎，但還需要進一步的實驗研究加以驗證。關(guān)節(jié)康治療骨性關(guān)節(jié)炎是多靶點、多通路、多選擇的復雜機制過程，是中醫(yī)藥防治疾病的整體觀念和辨證論治指導思想的有效印證，為進一步理解關(guān)節(jié)康治療骨性關(guān)節(jié)炎的作用機制提供了重要的線索，更為中醫(yī)藥治療骨性關(guān)節(jié)炎提供了新的研究思路。本研究的局限性在于僅對關(guān)節(jié)康治療骨性關(guān)節(jié)炎的作用機制進行了預測，具體機制尚待進一步研究證實。