加味六味地黃湯對大鼠腎間質(zhì)纖維化的干預(yù)機(jī)制

黃仁發(fā)， 梁群卿， 李賀生， 楊義龍， 黃家晟， 陳鵬輝， 楊朔， 吳金玉

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)深圳醫(yī)院（福田）腎病科，廣東深圳 518034；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院健康體檢中心，廣西南寧 530011；3.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，廣西南寧 530023）

我們的前期臨床研究表明，加味六味地黃湯（又名怡腎湯）能減少慢性腎衰竭患者蛋白尿，改善腎功能，調(diào)節(jié)免疫功能[1]；腎纖維化是慢性腎臟病進(jìn)展到終末期腎衰竭的共同路徑，動物實(shí)驗(yàn)研究表明，該方能改善單側(cè)輸尿管梗阻（unilateral ureteral obstruction）大鼠腎間質(zhì)纖維化（renal interstitial fibrosis），保護(hù)腎功能，其機(jī)制可能與阻斷Wnt4/β-連環(huán)蛋白（β-catenin）信號通路的活化，下調(diào)纖維生長因子23（FGF-23）的表達(dá)有關(guān)[2]。Wnt/β-catenin是進(jìn)化上高度保守的信號通路，其生物學(xué)作用廣泛，參與細(xì)胞增生、分化、凋亡、三維組織器官的形成、生長發(fā)育等過程[3]。經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號通路主要由細(xì)胞外因子Wnt蛋白、β-catenin、糖原合成激酶3β（GSK-3β）、結(jié)腸腺瘤性息肉蛋白（APC）、核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子T細(xì)胞因子/淋巴增強(qiáng)因子（TCF/LEF）等信號分子組成[4]。其中，Wnt4蛋白主要表達(dá)于泌尿生殖系統(tǒng)，對泌尿生殖系統(tǒng)發(fā)育至關(guān)重要[5]。近年來的研究表明，纖維連接蛋白（Fn）、原癌基因c-myc不僅參與了細(xì)胞外基質(zhì)的積聚形成，而且還是Wnt4/β-catenin信號通路靶基因，Wnt4/β-catenin信號通路活化后可通過調(diào)控Fn和c-myc表達(dá)增多參與腎間質(zhì)纖維化過程[6]。本研究中，我們進(jìn)一步觀察單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎組織Wnt4/β-catenin信號分子磷酸化GSK-3β（p-GSK-3β）、磷酸化LEF/TCF（p-LEF/TCF）以及Fn和c-myc的表達(dá)變化以及加味六味地黃湯的干預(yù)作用，以明確加味六味地黃湯抗腎間質(zhì)纖維化新的作用機(jī)制和靶點(diǎn)，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物120只清潔級健康10~12周齡雄性SD（Sprasue-Dawley）大鼠，體質(zhì)量（210±34）g，購自上海斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司，動物質(zhì)量合格證號：SCXK（湘）2013-0004。在廣西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物學(xué)部按標(biāo)準(zhǔn)條件飼養(yǎng)，室內(nèi)溫度為18~22℃，每天保證12 h照明，并每日定時清洗籠舍，保證實(shí)驗(yàn)大鼠能自由攝食、飲水。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物及制備加味六味地黃湯由熟地黃10 g、山茱萸10 g、干山藥15 g、澤瀉10 g、茯苓12 g、丹皮10 g、黃芪30 g、桂枝10 g、大黃10 g、丹參15 g組成。以上中藥材均購自廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院藥劑科。將以上中藥材浸泡2 h后，急火煮沸，再微火煎煮至少30 min。每劑藥煎熬2次，置于容器，混勻濃縮為含生藥1 g/mL的藥液，-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試劑小鼠源性Wnt4多克隆抗體、小鼠源性β-catenin多克隆抗體（美國Santa Cruz公司）；小鼠源性p-GSK-3β多克隆抗體（美國Abcam公司）；小鼠源性p-TCF/LEF多克隆抗體、小鼠源性Fn多克隆抗體、小鼠源性c-myc多克隆抗體（北京博奧森生物公司）；SP免疫組織化學(xué)試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；蛋白提取試劑盒（上海申能博彩生物技術(shù)公司）；二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒、苯甲基磺酰氟（PMSF）（江蘇碧云天生物技術(shù)公司）；聚偏氟乙烯（PVDF）膜（蘇州廣惠科技有限公司）。

1.4 儀器生物光學(xué)顯微鏡、RM2125型石蠟切片機(jī)、UCT型超薄切片機(jī)、H1650R型臺式高速冷凍離心機(jī)、SPECTRA max Plus 384酶標(biāo)儀（美國Molecular Devices公司）；ChemiDoc XRS+System凝膠成像儀（美國Bio-Rad公司）。

1.5 分組、造模與給藥將120只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、中藥組、纈沙坦組等4組，每組30只，然后各組組內(nèi)再分成7、14、28 d等3個時間點(diǎn)，每個時間點(diǎn)10只大鼠。除假手術(shù)組，其他組別大鼠均構(gòu)建單側(cè)輸尿管梗阻模型。單側(cè)輸尿管梗阻大鼠模型是經(jīng)典的腎間質(zhì)纖維化模型，造模方法按照本課題組前期研究[6]報道的步驟進(jìn)行。步驟簡述如下：用100 g/L的水合氯醛（3 mL/kg）腹腔注射麻醉大鼠后，從左肋下鈍性分離暴露左腎，左側(cè)輸尿管上段行雙線（4號絲線）結(jié)扎并在兩結(jié)扎點(diǎn)間剪斷輸尿管。假手術(shù)組除不結(jié)扎輸尿管外其他手術(shù)步驟均與上述造模方法相同。術(shù)后24 h，中藥組即開始給予加味六味地黃湯2.376 g·kg-1·d-1（2 mL/d）灌胃，纈沙坦組給予纈沙坦30 mg·kg-1·d-1（2 mL/d）灌胃，同時，假手術(shù)組和模型組均給予生理鹽水2 mL/d灌胃，每日1次，直至相應(yīng)實(shí)驗(yàn)時間點(diǎn)處死。

1.6 觀察指標(biāo)與方法

1.6.1 蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測大鼠腎組織Wnt4、β-catenin、p-GSK-3β、p-TCF/LEF蛋白的表達(dá)取備檢的大鼠腎組織剪成碎片，加入蛋白裂解液提取總蛋白，用BCA定量試劑盒檢測蛋白濃度。電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，Wnt4多克隆抗體（1∶100稀釋）孵育，二抗孵育。用IPP圖像分析軟件測量蛋白條帶的光密度（OD）值，以β-actin蛋白為內(nèi)參照，計(jì)算OD目的蛋白/ODβ-actin比值作為目的蛋白的表達(dá)量。β-catenin多克隆抗體（1∶200稀釋）、p-GSK-3β多克隆抗體（1∶200稀釋）、p-TCF/LEF多克隆抗體（1∶200稀釋）、β-actin多克隆抗體（1∶3 000稀釋）的檢測步驟同前。

1.6.2 免疫組織化學(xué)法檢測大鼠腎組織c-myc、Fn蛋白的表達(dá)將腎組織切片常規(guī)脫蠟至水，用體積分?jǐn)?shù)3%H2O2阻斷滅活內(nèi)源性過氧化物酶，0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液煮沸修復(fù)抗原，羊血清工作液封閉，滴加c-myc多克隆抗體（1∶150稀釋），4℃過夜，滴加二抗37℃孵育30 min，二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色5～20 min。顯微鏡（200~400倍）下觀察大鼠腎組織蛋白表達(dá)的量及部位，腎小管上皮細(xì)胞胞漿有棕黃色顆粒為陽性，不著色者為陰性，測量陽性表達(dá)蛋白的OD值。Fn多克隆抗體（1∶150稀釋）的檢測步驟同前。

1.7 統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。若方差齊性，多組比較采用單因素方差分析，組間比較用LSD法進(jìn)行多重比較；如方差不齊，則用非參數(shù)檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠腎組織Wnt4、β-catenin、p-GSK-3β、p-TCF/LEF表達(dá)比較圖1和表1結(jié)果顯示：假手術(shù)組大鼠腎組織可見少量Wnt4、β-catenin、p-GSK-3β、p-LEF/TCF蛋白表達(dá)，模型組大鼠第7天腎組織即可見明顯的Wnt4、β-catenin、p-GSK-3β、p-LEF/TCF表達(dá)，至14 d達(dá)高峰。與假手術(shù)組相同時間點(diǎn)比較，模型組大鼠腎組織Wnt4、β-catenin、p-GSK-3β、p-LEF/TCF表達(dá)量明顯上調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與模型組相同時間點(diǎn)比較，中藥組和纈沙坦組大鼠腎組織Wnt4、β-catenin、p-GSK-3β、p-TCF/LEF蛋白表達(dá)量明顯下調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01），且中藥組與纈沙坦組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

表1 各組大鼠腎組織Wnt4、β-catenin、p-GSK-3β、p-TCF/LEF蛋白相對表達(dá)量比較Table 1 Comparison of the relative protein expression levels of Wnt4，β-catenin，p-GSK-3β，p-TCF/LEF in kidney tissue of various groups （±s）

表1 各組大鼠腎組織Wnt4、β-catenin、p-GSK-3β、p-TCF/LEF蛋白相對表達(dá)量比較Table 1 Comparison of the relative protein expression levels of Wnt4，β-catenin，p-GSK-3β，p-TCF/LEF in kidney tissue of various groups （±s）

①P<0.01，與假手術(shù)組相同時間點(diǎn)比較；②P<0.05，③P<0.01，與模型組相同時間點(diǎn)比較

組別假手術(shù)組模型組中藥組纈沙坦組p-TCF/LEF蛋白相對表達(dá)量0.06±0.02 0.18±0.12①0.72±0.22①0.32±0.13①0.08±0.04③0.43±0.12③0.18±0.09②0.09±0.05③0.41±0.13③0.22±0.11②時間點(diǎn)（d）14 7 14 28 7 14 28 7 14 28鼠數(shù)（只）10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 Wnt4蛋白相對表達(dá)量0.25±0.11 0.52±0.12①1.36±0.38①1.07±0.24①0.26±0.10③1.03±0.22②0.78±0.12②0.21±0.09③0.94±0.25②0.69±0.16③β-catenin蛋白相對表達(dá)量0.22±0.09 0.52±0.12①1.18±0.41①0.65±0.14①0.24±0.08③0.85±0.18③0.67±0.35 0.18±0.10 0.83±0.31③0.16±0.05③p-GSK-3β蛋白相對表達(dá)量0.07±0.03 0.18±0.06①1.14±0.36①0.31±0.02①0.08±0.02③0.32±0.11③0.15±0.08③0.07±0.01③0.25±0.12③0.09±0.03③

2.2 各組大鼠腎組織c-myc、Fn蛋白表達(dá)比較圖2、圖3和表2結(jié)果顯示：假手術(shù)組大鼠腎組織可見少量c-myc、Fn蛋白分布；模型組大鼠第7天腎小管間質(zhì)胞漿即可見明顯的c-myc、Fn蛋白分布，表達(dá)水平高于假手術(shù)組（P<0.05或P<0.01），至14 d達(dá)高峰；中藥組和纈沙坦組腎小管間質(zhì)c-myc、Fn蛋白分布面積減少，表達(dá)水平低于模型組（P<0.05或P<0.01）。

圖2 各組大鼠腎組織c-myc蛋白表達(dá)分布比較（免疫組織化學(xué)法，×200）Figure 2 Comparison of distribution of c-myc expression in kidney tissue of various groups（by immunohistochemical method，×200）

表2 各組大鼠腎組織c-myc、Fn蛋白表達(dá)水平比較Table 2 Comparison of the protein expression levels of c-myc and Fn in kidney tissue of various groups（±s）

表2 各組大鼠腎組織c-myc、Fn蛋白表達(dá)水平比較Table 2 Comparison of the protein expression levels of c-myc and Fn in kidney tissue of various groups（±s）

①P<0.01，與假手術(shù)組相同時間點(diǎn)比較；②P<0.05，③P<0.01，與模型組相同時間點(diǎn)比較

Fn OD值0.11±0.04 0.12±0.05 0.13±0.03 0.26±0.13①0.64±0.21①0.53±0.14①0.16±0.04③0.50±0.13②0.39±0.11②0.15±0.07②0.47±0.12②0.36±0.09②組別假手術(shù)組模型組中藥組纈沙坦組時間點(diǎn)（d）7 14 28 7 14 28 7 14 28 7 14 28鼠數(shù)（只）10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 c-myc OD值0.12±0.03 0.13±0.04 0.15±0.05 0.29±0.11①0.76±0.23①0.54±0.17①0.17±0.08③0.55±0.16②0.42±0.14②0.19±0.10②0.48±0.13②0.38±0.11②

圖3 各組大鼠腎組織Fn表達(dá)分布比較（免疫組織化學(xué)法，×200）Figure 3 Comparison of distribution of Fn expression in kidney tissue of various groups（by immunohistochemical method，×200）

3 討論

Wnt/β-catenin是一重要的高度保守細(xì)胞信號通路，其生理作用廣泛，涉及細(xì)胞的增生、分化、細(xì)胞命運(yùn)的決定、組織器官的生長發(fā)育等。Wnt和β-catenin是該信號通路的核心分子，無Wnt信號刺激時，β-catenin可與軸蛋白（axin）/APC/GSK-3β形成β-catenin降解復(fù)合體，結(jié)合游離的β-catenin并使其泛素化，使得胞漿內(nèi)的β-catenin維持在比較低的水平。一旦有Wnt與細(xì)胞膜上受體Frizzled及輔助受體與輔助受體-低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋5/6（LRP5/6）結(jié)合，GSK-3β磷酸化，將信號從胞外傳至胞漿內(nèi)，使β-catenin降解復(fù)合體解離，游離的β-catenin增多，并轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核與LEF/TCF相互作用，TCF/LEF發(fā)生磷酸化，促進(jìn)下游靶基因Fn、c-myc的轉(zhuǎn)錄增多，參與一系列生理病理反應(yīng)[7-8]。最近的研究表明，Wnt/β-catenin信號通路參與了腎纖維化過程。有研究[9]發(fā)現(xiàn)，高糖可誘導(dǎo)人類腎小管上皮細(xì)胞（HK2）的Wnt/β-catenin信號通路活化，同時平滑肌動蛋白（β-smooth muscle actin，α-SMA）表達(dá)增多，E鈣黏素表達(dá)減少，而Wnt/β-catenin信號通路抑制劑DKK-1可以逆轉(zhuǎn)這種改變，提示W(wǎng)nt/β-catenin信號通路活化參與了糖尿病腎病腎小管上皮-肌成纖維轉(zhuǎn)分化（epithelial-to-mesenchymal transition，EMT）過程。而研究[10]發(fā)現(xiàn)，單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎間質(zhì)的Wnt/β-catenin信號通路活化，可通過促使巨噬細(xì)胞M2型極化參與腎間質(zhì)纖維化過程。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，假手術(shù)組大鼠腎組織僅存在少量的Wnt4、β-catenin、p-GSK-3β、p-LEF/TCF表達(dá)，而單側(cè)輸尿管梗阻大鼠第7天即開始出現(xiàn)腎組織Wnt4、β-catenin、p-GSK-3β、p-LEF/TCF明顯的表達(dá)上調(diào)，第14天達(dá)到高峰，表明單側(cè)輸尿管梗阻可誘導(dǎo)大鼠腎間質(zhì)經(jīng)典Wnt4/β-catenin信號途徑活化，促使其下游的信號分子GSK-3β和LEF/TCF磷酸化增強(qiáng)，參與了促腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生和發(fā)展，這與Abbas和Sun等學(xué)者的研究[11-12]一致。前已述及，F(xiàn)n、c-myc是Wnt4/β-catenin信號途徑下游的靶基因。Fn是細(xì)胞外基質(zhì)（extra cellular matrix，ECM）的重要組成部分，它們的過度沉積是腎間質(zhì)纖維化形成的最基本病理改變[13]。而c-myc是原癌基因，主要功能為促進(jìn)細(xì)胞的增殖，在正常腎組織僅有低表達(dá)，單側(cè)輸尿管梗阻大鼠模型腎組織可見c-myc明顯增加，參與腎纖維化的形成和發(fā)展[14]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，假手術(shù)組大鼠腎組織僅存在少量Fn、c-myc表達(dá)，而單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎組織Fn、c-myc的表達(dá)明顯上調(diào)，并且其高峰時間與Wnt4/β-catenin信號通路活化一致，均為14 d，提示W(wǎng)nt4/β-catenin信號通路活化導(dǎo)致下游的致纖維化因子Fn、c-myc轉(zhuǎn)錄增多，參與了腎間質(zhì)纖維化的過程。

目前中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，腎間質(zhì)纖維化的病因病機(jī)為本虛標(biāo)實(shí)，本虛為脾腎兩虛，標(biāo)實(shí)為水濕瘀毒，病理改變具有“虛、瘀、濕、毒”的特點(diǎn)。我們根據(jù)單味藥研究的結(jié)果，在六味地黃湯的基礎(chǔ)上加入桂枝、大黃、黃芪、丹參，取桂枝通陽利水濕、大黃通便以排毒、黃芪益氣健脾利水、丹參活血化瘀，取名加味六味地黃湯，全方共奏補(bǔ)腎、利水活血、排毒的功能[6]。既往我們的研究[6]結(jié)果已證實(shí)，加味六味地黃湯能夠降低單側(cè)輸尿管梗阻大鼠尿N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（NAG）酶、尿素氮（BUN）和血清肌酐（SCr）水平，改善腎纖維化，加味六味地黃湯具有較強(qiáng)的抗腎間質(zhì)纖維化的作用。本研究中，我們進(jìn)一步探討了加味六味地黃湯對腎間質(zhì)纖維化Wnt4/β-catenin信號分子（磷酸化GSK-3β、LEF/TCF）以及Fn和c-myc表達(dá)的影響。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，加味六味地黃湯干預(yù)后，單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎組織Wnt4、β-catenin、p-GSK-3β、p-TCF/LEF、Fn和c-myc蛋白的表達(dá)水平均顯著下調(diào)，表明加味六味地黃湯可阻斷大鼠腎間質(zhì)纖維化Wnt/β-catenin信號的活化，抑制下游信號分子GSK-3β和TCF/LEF的磷酸化，繼而減少了下游靶基因Fn和c-myc的轉(zhuǎn)錄，提示這可能是加味六味地黃湯新的抗腎間質(zhì)纖維化機(jī)制。

綜上所述，加味六味地黃湯可能通過阻斷Wnt4/β-catenin信號通路的活化，下調(diào)Fn和c-myc蛋白的表達(dá)，發(fā)揮抗腎間質(zhì)纖維化的作用。