DJ-1和TET1在宮頸癌的表達及臨床意義

朱小雨，譚玉潔

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)檢驗學(xué)院，貴陽 550004；2.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院臨床檢驗中心，貴陽 550004)

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，嚴重威脅女性生命健康。隨著篩查技術(shù)的不斷提升，其發(fā)病率和病死率已經(jīng)明顯下降，但在發(fā)展中國家仍然是女性死亡的重要原因[1]。因此，探究宮頸癌發(fā)生、發(fā)展的影響因素，發(fā)現(xiàn)有效的早期診斷標志物和治療靶點尤為重要。帕金森病相關(guān)蛋白7(parkinson protein 7,PARK7/DJ-1)是一種高度保守的蛋白，以同源二聚體的形式廣泛表達于機體各組織細胞，參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細胞增殖等生理病理活動[2-4]。它以二聚體的形式參與多種病理生理過程的調(diào)控，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)DJ-1與肝癌細胞增殖相關(guān)[5]，此外，DJ-1在膽管癌中表達上調(diào)且與其預(yù)后相關(guān)[6]。甲基胞嘧啶雙加氧酶(ten eleven translocation 1，TET1)是TET蛋白家族的主要成員之一，是新近發(fā)現(xiàn)的一種基因甲基化調(diào)節(jié)酶，其主要功能是通過將5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine,5-mC)轉(zhuǎn)化為5-羥甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine,5-hmC)，從而發(fā)揮DNA去甲基化的作用[7]。DNA甲基化作為表觀遺傳學(xué)的重要部分，與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。有研究報道，在肝癌[8]、乳腺癌[9]、卵巢癌[10]組織中TET1表達明顯下調(diào)。此外，TET1還參與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展[11]。目前，DJ-1和TET1在宮頸癌中的作用還尚未明確。因此，本研究探討宮頸癌患者DJ-1和TET1的表達水平與宮頸癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系，為進一步尋找宮頸癌早期診斷的生物標志物和治療相關(guān)靶點提供依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年1-9月貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院婦科診治的40例宮頸疾病患者為研究對象。納入標準：(1)子宮肌瘤經(jīng)婦科和B超確診[12]，宮頸癌及宮頸上皮內(nèi)瘤變(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)參照《中國子宮頸癌篩查及異常管理相關(guān)問題專家共識》[13]標準并結(jié)合病史、細胞學(xué)檢查、病理活檢結(jié)果確診；(2)患者入院前未接受化療、放療及激素治療，同時也未服用過其他類型的藥物。排除標準:(1)合并傳染性疾??；(2)合并自身免疫性疾病；(3)繼發(fā)性盆腔癌，或合并乳腺、 肝、腎、肺等其他臟器惡性腫瘤；(4)入院前半年接受免疫抑制劑治療。40例患者按照檢查結(jié)果分為宮頸癌Ⅰ組、CINⅢ級組和子宮肌瘤組。其中宮頸癌Ⅰ組15例，年齡38～70歲，平均(50.60±3.49)歲；CINⅢ級組15例，年齡28～59歲，平均(42.80±9.45)歲；子宮肌瘤組10例，年齡43～54歲，平均(47.10±2.92)歲。3組年齡比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。另選取2020年6-8月行婦科手術(shù)切除的10例宮頸癌患者作為宮頸癌Ⅱ組，并以其癌旁組織作為癌旁對照組，患者年齡38～62歲，平均(47.00±8.15)歲。本研究所有研究對象知情同意，且經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(倫理批件號：2018倫審第075號)。

1.2 方法

1.2.1免疫組織化學(xué)

宮頸癌Ⅰ組、CINⅢ級組、子宮肌瘤組組織用10%甲醛固定，石蠟包埋，切片，烤片，脫蠟，水化，檸檬酸鈉抗原修復(fù)液修復(fù)3 min，3%過氧化氫30 min；磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗5 min，山羊血清封閉30 min，滴加DJ-1抗體(1∶1 000)，濕盒4 ℃過夜，次日取出，平衡至室溫30 min，棄去一抗，PBS洗3次，每次10 min，滴加酶標山羊抗兔IgG聚合物，室溫放置2 h；棄掉二抗，PBS洗3次，每次10 min；DAB顯色，顯色時間為3～5 min，蘇木素復(fù)染，鹽酸乙醇分化，返藍，脫水透明，封片。用已知宮頸癌的陽性切片作為陽性對照，用PBS代替一抗作為陰性對照。根據(jù)組織切片著色的陽性細胞數(shù)和著色面積進行評分，挑選5個高倍鏡視野(×400)觀察，采用二級計分法進行結(jié)果判斷，染色強度評分標準為：未著色，陰性，0分；著色呈淺黃色，弱陽性，1分；著色呈黃色或深黃色，中度陽性，2分；著色較強呈黃褐色，強陽性，3分。染色面積評分標準為：無陽性細胞，0分；陽性細胞計數(shù)小于25%，1分；陽性細胞計數(shù)占25%～50%，2分；陽性細胞計數(shù)大于50%，3分。免疫組織化學(xué)著色評分=染色強度評分×染色面積評分，0分記為“-”，表示陰性；1～2分記為“+”，表示弱陽性；3～4分記為“++”，表示中陽性；≥5分記為“+++”，表示強陽性。為方便統(tǒng)計，本研究將“-”“+”定為陰性,“++”“+++”定為陽性[14]。

1.2.2細胞培養(yǎng)

人正常子宮頸上皮細胞HcerEpic(北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院)、宮頸癌細胞SiHa和HeLa(南京科佰生物科技有限公司)均用含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃，CO2體積分數(shù)為5%，濕度為97%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3天更換1次新鮮培養(yǎng)基，待細胞融合度達80%～90%時，用0.25%胰蛋白酶消化，傳代培養(yǎng)。

1.2.3Western blot

稱取宮頸癌Ⅱ組和癌旁對照組組織各50～80 mg，剪碎，在液氮中充分研磨，或?qū)?shù)生長期的HcerEpic、SiHa和HeLa細胞以每孔1×105個接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h后，收集細胞，加入約100 μL RIPA蛋白裂解液，冰上裂解30 min，4 ℃下12 000 r/min離心10 min后取上清液,測定蛋白濃度。配制5%濃縮膠和12%或8%的分離膠,每泳道加總蛋白量25 μg進行電泳分離；恒壓80 V，30 min，后轉(zhuǎn)120 V至當樣品中的溴酚藍移動至膠底邊上時，即可結(jié)束電泳。將蛋白轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜,在含5%脫脂奶粉溶液中常溫封閉2 h，分別加入兔抗人DJ-1單克隆抗體(1∶10 000)、兔抗人TET1多克隆抗體(1∶1 500)，4 ℃孵育過夜。TBST洗膜，每次10 min，共3次，后加入辣根過氧化酶(HRP)標記的山羊抗兔二抗(1∶5 000)，室溫孵育2 h，TBST洗膜，每次10 min，共3次。電化學(xué)發(fā)光(ECL)進行顯影，GAPDH作為內(nèi)參，采用Image J圖像分析軟件,分別用DJ-1和TET1與GAPDH灰度比值表示DJ-1和TET1蛋白相對表達水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 不同宮頸組織DJ-1表達情況比較

DJ-1主要在細胞質(zhì)表達，部分細胞核也有表達，呈棕色。DJ-1在子宮肌瘤組[2/10(20%)]、CINⅢ級組[9/15(60%)]和宮頸癌Ⅰ組[12/15(80%)]陽性表達率逐漸升高，3組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=8.091，P=0.004)，見圖1。

A：子宮肌瘤組；B：CINⅢ級組；C：宮頸癌Ⅰ組。

2.2 宮頸癌及癌旁正常組織DJ-1和TET1表達情況

Western blot結(jié)果顯示，與癌旁對照組比較，宮頸癌Ⅱ組DJ-1表達水平升高，TET1表達水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖2、3。

圖2 宮頸癌及癌旁正常組織DJ-1和TET1表達情況

2.3 不同宮頸細胞DJ-1和TET1表達情況

Western blot結(jié)果顯示，與人正常子宮頸上皮細胞HcerEpic比較，宮頸癌細胞SiHa和HeLa的DJ-1表達水平升高，TET1表達水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖4、5。

a：P<0.05，與癌旁對照組比較。

a：P<0.05，與HcerEpic比較。

3 討 論

宮頸癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，其治療手段有限，手術(shù)、放化療等對早期的宮頸癌來說還尚有效，但對于晚期宮頸癌來說，療效及預(yù)后較差。對此，尋找更為有效的、針對性的早期診斷與治療靶點就顯得尤為重要。

DJ-1主要存在于細胞質(zhì)，也可存在于細胞核，與線粒體功能密切相關(guān)[15]。目前發(fā)現(xiàn)體內(nèi)野生型DJ-1以二聚體形式參與人體中多種病理生理過程的調(diào)控，其中包括細胞轉(zhuǎn)化、抗凋亡、抗氧化應(yīng)激、分子伴侶活性及負性調(diào)節(jié)等，這些調(diào)控功能均可能在促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中具有重要意義[16]。在原發(fā)性非小細胞肺癌組織中，DJ-1的表達高于正常細胞，并發(fā)現(xiàn)DJ-1高表達與患者預(yù)后和復(fù)發(fā)風(fēng)險相關(guān)[17]。多項研究表明DJ-1與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，可通過多種途徑調(diào)節(jié)腫瘤生長、侵襲、促進細胞存活及增殖等[18-20]。

本研究采用免疫組織化學(xué)法檢測宮頸癌Ⅰ組、CINⅢ級組和子宮肌瘤組DJ-1的表達情況，結(jié)果表明，DJ-1陽性表達率隨著宮頸病變嚴重程度的增加而逐漸升高，提示DJ-1與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。為了進一步了解DJ-1在宮頸癌組織中的表達水平，本研究采用Western blot檢測DJ-1在宮頸癌細胞SiHa、HeLa及宮頸癌Ⅱ組的表達水平，結(jié)果顯示DJ-1在宮頸癌組織中的表達水平升高，這與WANG等[21]研究結(jié)果一致。

表觀遺傳學(xué)是指在不改變核苷酸序列的前提下染色體所發(fā)生的、可以遺傳給后代的變化。而DNA甲基化是迄今為止哺乳動物研究最多的表觀遺傳修飾之一，它的異常表現(xiàn)與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。TET1是TET蛋白家族的主要成員之一，是新發(fā)現(xiàn)的一種基因甲基化調(diào)節(jié)酶。文獻報道在許多實體瘤的研究中，發(fā)現(xiàn)與癌旁組織比較，腫瘤組織中TET1的表達水平明顯減少，且還伴隨著5-hmC的表達降低及異常DNA甲基化積累，表明在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中，TET1具有重要作用。研究報道在卵巢癌組織中，TET1的表達與臨床分期呈負相關(guān)關(guān)系[22]。此外，文獻報道TET1可因自身被甲基化而表達沉默，促進腫瘤的發(fā)展，表明TET1自身也具有抑癌基因的作用[23]。還有研究發(fā)現(xiàn)，TET1可抑制乳腺癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力[24]，但在宮頸癌研究中少有報道。本研究用Western blot檢測宮頸癌細胞SiHa、HeLa及宮頸癌Ⅱ組TET1的表達情況，發(fā)現(xiàn)TET1在宮頸癌中的相對表達水平降低，提示TET1可能與宮頸癌的發(fā)生有關(guān)。

綜上所述，DJ-1和TET1在宮頸癌的異常表達可能與其發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，但由于本研究樣本量較小，未對腫瘤患者臨床病理特征做相關(guān)性分析，需加大樣本量進一步證實。此外，DJ-1和TET1之間是否存在相互作用的途徑，下調(diào)DJ-1或上調(diào)TET1表達在宮頸癌發(fā)生、發(fā)展過程中的影響還有待進一步研究，而這一機制的闡明可為宮頸癌的早期診斷、干預(yù)和靶向治療提供試驗依據(jù)。