miR-1246對(duì)肺癌細(xì)胞放療敏感性的調(diào)控及對(duì)放療所致肺損傷的影響

楚 麗，要雪品，梁 艷，段穎欣，姜 溪，王力軍

(邢臺(tái)醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校第二附屬醫(yī)院放化療科，河北邢臺(tái) 054000)

肺癌是臨床發(fā)病率較高的惡性腫瘤，最新的統(tǒng)計(jì)報(bào)告顯示肺癌占所有腫瘤患者的26%～29%[1]?，F(xiàn)階段治療肺癌的方法包括放療、化療等，但腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是影響治療結(jié)果的重要因素[2]。放療可通過誘導(dǎo)DNA損傷導(dǎo)致突變負(fù)荷增加、染色體畸變和(或)基因組不穩(wěn)定，從而誘導(dǎo)細(xì)胞死亡[3]。但化療也會(huì)引起骨髓抑制、肺放射性損傷等副作用，提高肺癌細(xì)胞對(duì)放療的敏感性具有重要意義[4]。

微小RNA(miR)是一種內(nèi)源性的、僅有22～25個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的一種單鏈RNA，雖然miR不具備編碼蛋白質(zhì)的能力，但其可靶向結(jié)合信使RNA(mRNA)的3′端的非翻譯區(qū)域(3′-UTR)使其降解，從而抑制基因的表達(dá)[5]。miR-1246是一種新發(fā)現(xiàn)的與腫瘤有關(guān)的基因，研究顯示提高miR-1246的表達(dá)可促進(jìn)肺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力[6]。且一項(xiàng)最新研究發(fā)現(xiàn)降低miR-1246的水平可提高放射線對(duì)膀胱癌細(xì)胞的殺傷力[7]。本文主要分析miR-1246對(duì)肺癌細(xì)胞放療敏感性的影響及對(duì)放療所致肺損傷的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1肺癌組織標(biāo)本

選取2018年12月至2019年12月本院70例患者的肺癌組織和癌旁組織標(biāo)本，其中男41例，女29例，年齡39～74歲，中位數(shù)53歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)通過病理確診為肺癌；(2)入組前未接受放療、化療等抗腫瘤治療；(3)患者知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他原發(fā)性惡性腫瘤的患者。

1.1.2細(xì)胞和試劑

人肺癌細(xì)胞A549(CCL-185，美國(guó)ATCC公司)；DMEM培養(yǎng)基血清和抗體(美國(guó)Invitrogen公司)；慢病毒負(fù)載的miR-1246陰性對(duì)照(NC)和抑制劑(中國(guó)GenePharma公司)；LipofectamineTM2000(美國(guó)Invitrogen公司)；TRIzol(美國(guó)Sigma公司)；miScript試劑盒(德國(guó)GmbH公司)；PrimeScript-RT和SYBR Premix Ex Taq試劑盒(日本Takara公司)；抗體和山羊抗兔IgG H&L[辣根過氧化酶(HRP)，美國(guó)Abcam公司]；聚偏氟乙烯(PVDF)膜(美國(guó)Bio-Rad公司)；電化學(xué)發(fā)少(ECL)顯色試劑盒(美國(guó)Thermo Fisher公司)；氧化應(yīng)激試劑盒(中國(guó)三工生物技術(shù)有限公司)；ELISA試劑盒(中國(guó)Beyotime研究所)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞分組和轉(zhuǎn)染

將DMEM培養(yǎng)基中處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞分為NC組和抑制劑組，分別通過Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染50 nmol/L的miR-1246NC和miR-1246抑制劑，轉(zhuǎn)染條件為7 ℃，5% CO2，48 h后收集細(xì)胞。通過逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-qPCR)檢測(cè)miR-1246水平分析轉(zhuǎn)染效率。

1.2.2荷瘤裸鼠模型構(gòu)建和分組

將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞重新配置成濃度為1×107個(gè)細(xì)胞/mL的溶液，然后將0.2 mL的細(xì)胞懸液注射在小鼠右前腋下，若第7天可觸摸瘤體生成則提示建模成功。分別選擇20只轉(zhuǎn)染miR-1246NC建模成功的小鼠和20只轉(zhuǎn)染miR-1246抑制劑建模成功的小鼠，各分為2組，共得到4組：NC組、放療組、抑制劑組和抑制劑+放療組(n=10)。為持續(xù)抑制腫瘤組織和肺組織miR-1246表達(dá)，在建模后第14、21天，通過尾靜脈注射miR-1246抑制劑(4×107TU，300 μL)[8]。同時(shí)，在建模后第14天，小鼠接受腫瘤組織局部放療[9]，放射源為鈷-60，波長(zhǎng)為80 cm，照射劑量為7 Gy/f，劑量率為0.5 Gy/min，每天1次，連續(xù)2周。

1.2.3檢測(cè)指標(biāo)

1.2.3.1腫瘤組織體積、質(zhì)量

在建模后第14、28天用卡尺測(cè)量各組小鼠皮下腫瘤組織體積，使用下式計(jì)算：體積=[(長(zhǎng)度×寬度)/2]3×0.523 6。在建模后第28天脫頸處死小鼠，取出腫瘤組織，檢測(cè)質(zhì)量。

1.2.3.2逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-qPCR)檢測(cè)miR-1246

通過TRIzol獲得組織中總RNA，對(duì)于miR-1246，通過miScript試劑盒合成互補(bǔ)DNA(7 ℃，60 min，95 ℃，5 min，4 ℃下保存)，利用SYBR-Green PCR試劑盒檢測(cè)互補(bǔ)DNA(95 ℃，10 s，55 ℃，30 s，72 ℃，30 s，40個(gè)循環(huán))。U6用作miR-1246的內(nèi)源參照。對(duì)于mRNA，分別通過PrimeScript-RT和SYBR Premix Ex Taq試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄(37 ℃，15 min，85 ℃，5 s)和PCR(95 ℃，5 min，95 ℃，30 s，40個(gè)循環(huán)，65 ℃，45 s)。GAPDH用作內(nèi)源參照。通過比較循環(huán)閾值評(píng)估m(xù)iR-1246相對(duì)于U6和GAPDH的表達(dá)水平。

1.2.3.3Western blot檢測(cè)蛋白

將組織研磨萃取總蛋白，蛋白濃度通過BCA試劑盒測(cè)量。進(jìn)行10%聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE，80～120 V，90 min)分離40 μg的總蛋白。在100 mV的恒定電壓下與PVDF膜進(jìn)行濕轉(zhuǎn)移。在5%牛血清清蛋白中于室溫孵育1 h，然后將1∶500稀釋的抗Cyclin D1、抗Ki-67、抗Bcl-2、抗Bax和抗β-catenin添加到PVDF膜中，并在4 ℃下孵育8 h。洗滌后在室溫下添加二抗孵育2 h，然后加入化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行顯影，GAPDH用作內(nèi)參，用Image J軟件分析目標(biāo)條帶的灰度值。

1.2.3.4蘇木素-伊紅(HE)染色檢測(cè)肺損傷

小鼠處死后立即取出肺組織，用4%的多聚甲醛固定并用梯度醇脫水，包埋在石蠟中，制成厚度為4 μm的切片制作玻片標(biāo)本。加入蘇木素在室溫下賦孵育10 min，然后加入0.5%伊紅溶液室溫下孵育3 min，顯微鏡下觀察。

1.2.3.5丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)水平檢測(cè)

將肺組織制作成組織勻漿，以3 000 r/min的速度離心25 min，根據(jù)氧化應(yīng)激試劑盒檢測(cè)MDA和SOD水平。

1.2.3.6ELISA檢測(cè)炎性指標(biāo)

將肺組織勻漿、離心(2 000 r/min，20 min)并收集上清液，再根據(jù)試劑盒說明書加入抗體和顯色劑，通過酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處吸光度，然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-6和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 肺癌組織及癌旁組織miR-1246表達(dá)情況

肺癌組織miR-1246相對(duì)表達(dá)水平高于癌旁組織[(3.47±0.64)vs.(1.42±0.31)]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 各組小鼠腫瘤組織體積、質(zhì)量比較

建模第14天，各組小鼠腫瘤組織體積比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。建模第28天，放療組和抑制劑組腫瘤組織體積、質(zhì)量均低于NC組，抑制劑+放療組腫瘤組織體積、質(zhì)量均低于放療組和抑制劑組(P<0.05)，見表1。

2.3 各組小鼠腫瘤組織miR-1246相對(duì)表達(dá)水平比較

各組小鼠腫瘤組織miR-1246相對(duì)表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。放療組和抑制劑組腫瘤組織miR-1246相對(duì)表達(dá)水平低于NC組，抑制劑+放療組腫瘤組織miR-1246相對(duì)表達(dá)水平低于放療組和抑制劑組(P<0.05)，見表2。

2.4 各組小鼠腫瘤組織Cyclin D1和Ki-67蛋白表達(dá)情況比較

各組小鼠腫瘤組織Cyclin D1和Ki-67蛋白水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。放療組和抑制劑組腫瘤組織Cyclin D1和Ki-67蛋白水平低于NC組，抑制劑+放療組腫瘤組織Cyclin D1和Ki-67蛋白水平低于放療組和抑制劑組(P<0.05)，見圖1、表3。

表1 各組小鼠腫瘤組織體積、質(zhì)量比較

表2 各組小鼠腫瘤組織miR-1246相對(duì)表達(dá)水平比較

圖1 Western blot檢測(cè)各組小鼠腫瘤組織Cyclin D1和Ki-67蛋白表達(dá)情況

2.5 各組小鼠腫瘤組織Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)情況比較

各組小鼠腫瘤組織Bcl-2和Bax蛋白水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。放療組和抑制劑組腫瘤組織Bcl-2蛋白水平低于NC組，而Bax蛋白水平高于NC組，抑制劑+放療組腫瘤組織Bcl-2蛋白水平低于放療組和抑制劑組，而Bax蛋白水平高于放療組和抑制劑組(P<0.05)，見圖2、表4。

表3 各組小鼠腫瘤組織Cyclin D1和Ki-67蛋白水平比較

圖2 Western blot檢測(cè)各組小鼠腫瘤組織Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)情況

表4 各組小鼠腫瘤組織Bcl-2和Bax蛋白水平比較

2.6 各組小鼠腫瘤組織β-catenin蛋白表達(dá)情況比較

各組小鼠腫瘤組織β-catenin蛋白水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。放療組和抑制劑組腫瘤組織β-catenin蛋白水平低于NC組，抑制劑+放療組β-catenin蛋白水平低于放療組和抑制劑組(P<0.05)，見圖3、表5。

圖3 Western blot檢測(cè)各組小鼠腫瘤組織β-catenin蛋白表達(dá)情況

表5 各組小鼠腫瘤組織β-catenin蛋白水平比較

2.7 各組小鼠肺組織病理變化

NC組和抑制劑組小鼠肺組織一切正常。放療組肺組織出現(xiàn)廣泛的肺部損傷，支氣管上皮細(xì)胞脫落，并可明顯地觀察到出血和炎性浸潤(rùn)，肺泡結(jié)構(gòu)基本喪失。與放療組比較，抑制劑+放療組炎性反應(yīng)情況明顯緩解，可觀察到基本的肺泡結(jié)構(gòu)，見圖4。

圖4 各組小鼠肺組織病理變化(HE，×200)

2.8 各組小鼠肺組織MDA和SOD水平比較

各組小鼠肺組織MDA、SOD水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。放療組肺組織MDA水平高于NC組和抑制劑組，而SOD水平明顯低于NC組和抑制劑組(P<0.05)，抑制劑+放療組肺組織MDA水平低于放療組，而SOD水平高于放療組(P<0.05)，見表6。

2.9 各組小鼠肺組織炎性指標(biāo)比較

各組小鼠肺組織炎性指標(biāo)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。放療組肺組織IL-1β、IL-6和TNF-α水平高于NC組和抑制劑組，抑制劑+放療組肺組織IL-1β、IL-6和TNF-α水平低于放療組(P<0.05)，見表7。

表6 各組小鼠肺組織MDA和SOD水平比較

表7 各組小鼠肺組織炎性指標(biāo)水平比較(n=10,

表7 各組小鼠肺組織炎性指標(biāo)水平比較(n=10,

組別IL-1βIL-6TNF-αNC組39.18±4.9841.29±4.6753.54±5.84放療組78.31±9.75ac86.28±9.35ac114.73±13.24ac抑制劑組37.58±5.3442.73±6.0151.84±6.81抑制劑+放療組58.64±8.20abc66.50±8.92abc89.61±10.34abcF24.18727.92328.075P<0.001<0.001<0.001

a：P<0.05，與NC組比較；b：P<0.05，與放療組比較；c：P<0.05，與抑制劑組比較。

2.10各組小鼠肺組織miR-1246相對(duì)表達(dá)水平比較

抑制劑組肺組織miR-1246相對(duì)表達(dá)水平低于NC組，放療組肺組織miR-1246相對(duì)表達(dá)水平高于NC組，抑制劑+放療組肺組織miR-1246相對(duì)表達(dá)水平低于放療組(P<0.05)，見表8。

表8 各組小鼠肺組織miR-1246相對(duì)表達(dá)水平比較

3 討 論

一項(xiàng)全球性調(diào)查統(tǒng)計(jì)研究顯示，2018年新發(fā)肺癌患者共2 093 876例，占所有腫瘤的11.6%，死亡1 761 007例，占所有腫瘤死亡患者的18.4%，肺癌的發(fā)病率和病死率均排名第一[10]。吸煙、輻射、煙塵、毒性物質(zhì)(如石棉、鎳、鉻和砷等)均是肺癌的誘發(fā)因素，但目前關(guān)于肺癌發(fā)病和進(jìn)展的機(jī)制尚不完全明確。放療是治療肺癌的最主要方法之一，但放療的實(shí)際應(yīng)用中有兩個(gè)主要局限，一方面由于肺癌細(xì)胞可能產(chǎn)生對(duì)放射線的抗性，另一方面放射線也會(huì)對(duì)周圍正常肺組織造成損傷，提高肺癌對(duì)放療的敏感性和減輕對(duì)正常肺組織的損傷具有重要的臨床意義[11]。

miR可通過堿基配對(duì)的方式與mRNA的3′UTR區(qū)域結(jié)合，從而調(diào)節(jié)基因的表達(dá)水平，miR的這種在轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)控的方式可影響基因的表達(dá)，從而參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[12]。miR-1246是一種新發(fā)現(xiàn)的與腫瘤有關(guān)的miR，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在宮頸癌、胰腺癌等腫瘤中發(fā)揮抑癌作用[13-14]。研究認(rèn)為miR-1246是肺癌起始和癌癥進(jìn)展的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)器，循環(huán)中miR-1246可用作跟蹤肺癌進(jìn)展的生物標(biāo)記物和治療靶標(biāo)[15]。KIM等[16]研究發(fā)現(xiàn)，miR-1246可提高肺癌細(xì)胞的侵襲能力。但miR-1246能否提高肺癌細(xì)胞對(duì)放療的敏感性仍不清楚。本研究結(jié)果顯示降低肺癌細(xì)胞中miR-1246不僅能抑制肺癌荷瘤裸鼠模型的腫瘤生長(zhǎng)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，還可提高肺癌對(duì)放療的敏感性，提高放射線的殺傷力。放射線誘導(dǎo)DNA的斷裂是治療腫瘤的關(guān)鍵機(jī)制，DNA的損傷修復(fù)是腫瘤細(xì)胞具有對(duì)放射線抗性的關(guān)鍵，研究顯示miR-1246可通過調(diào)控DNA連接酶4的表達(dá)參與DNA損傷修復(fù)[17]。β-catenin是Wnt通路中的關(guān)鍵蛋白，參與放射線引起的腫瘤細(xì)胞凋亡，有研究發(fā)現(xiàn)抑制β-catenin可促進(jìn)干細(xì)胞對(duì)放射線的敏感性[18]。體內(nèi)外研究結(jié)果已經(jīng)顯示了抑制β-catenin的表達(dá)可消除直腸癌細(xì)胞對(duì)放射線的抗性，提高放療的殺傷力[19]。而大量的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)了miR-1246對(duì)β-catenin的抑制作用[20]。本研究證實(shí)了在體內(nèi)抑制miR-1246進(jìn)而抑制肺癌生長(zhǎng)的現(xiàn)象，且抑制miR-1246的表達(dá)可能通過調(diào)控DNA損傷修復(fù)相關(guān)蛋白的表達(dá)降低肺癌細(xì)胞對(duì)放射性的抗性，和可能通過抑制β-catenin相關(guān)通路提高放射線對(duì)腫瘤的殺傷力，從而提高放療效果。

放療的實(shí)際應(yīng)用過程中不但會(huì)造成腫瘤細(xì)胞的DNA損傷，也會(huì)引起正常肺組織的損傷?？赡褪軇┝康姆暖煵坏赡軐?dǎo)致生活質(zhì)量下降，還可能誘發(fā)肺炎和纖維化。近年來，已經(jīng)證明細(xì)胞氧化應(yīng)激在放射致肺損傷中起著重要作用，且將氧化應(yīng)激作為肺損傷發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后的監(jiān)測(cè)指標(biāo)[21]?；钚匝醯拇嬖跁?huì)引起DNA損傷和隨后的細(xì)胞凋亡，且會(huì)誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子的分泌。本研究中，為持續(xù)降低miR-1246的水平，通過靜脈注射miR-1246慢性毒的方式抑制miR-1246的水平。結(jié)果顯示放療會(huì)引起肺癌裸鼠模型肺組織氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎性因子的釋放，造成明顯肺損傷，而抑制miR-1246可有效地緩解肺損傷。在脂多糖誘導(dǎo)的軟骨ADDC5細(xì)胞的炎性損傷模型中，miR-1246的抑制通過上調(diào)肝細(xì)胞核因子4α的表達(dá)調(diào)控炎性通路，從而緩解細(xì)胞的炎性損傷[22]。一項(xiàng)最新研究顯示，在NaIO3誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激細(xì)胞模型中，抑制miR-1246會(huì)降低活性氧水平，提高視網(wǎng)膜色素上皮的抗凋亡能力并緩解損傷[23]。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也顯示了miR-1246的耗竭減弱了脂多糖誘導(dǎo)的小鼠肺部炎癥，并緩解中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和血管通透性[24]。且本研究也顯示抑制劑+放療組肺組織的miR-1246水平明顯低于放療組，這提示抑制miR-1246的表達(dá)可能通過緩解氧化應(yīng)激反應(yīng)抑制炎性反應(yīng)，從而緩解由放療引起的肺損傷。

綜上所述，miR-1246可能通過抑制β-catenin的表達(dá)提高肺癌對(duì)放療的敏感性，且降低miR-1246的水平可緩解有放射線誘導(dǎo)的正常肺組織的損傷。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)了miR-1246在肺癌荷瘤裸鼠腫瘤組織和肺組織不同的作用，在肺癌組織中miR-1246起到誘導(dǎo)凋亡的作用，而在正常肺組織中，miR-1246起到緩解氧化應(yīng)激和肺組織保護(hù)作用。而對(duì)于接受放療的肺癌患者來說，miR-1246的作用均是有益的，關(guān)于miR-1246在肺癌患者中的意義和與放療的關(guān)系仍需要進(jìn)一步研究。