果糖對γ射線照射V79細(xì)胞的輻射保護(hù)作用

胡 靜，鄭 越

(解放軍總醫(yī)院醫(yī)療保障中心藥劑科，北京 100853)

電離輻射是一種電磁波或粒子，當(dāng)它通過物質(zhì)時，能夠產(chǎn)生離子，并立即引起生物組織的化學(xué)變化。一定時間后這些改變可能導(dǎo)致細(xì)胞損傷，最終也可能導(dǎo)致細(xì)胞或生物體死亡[1]。 這些細(xì)胞損傷對可能遭受軍事、太空旅行的電離輻射暴露人群，以及接受放療的癌癥患者和核電行業(yè)的工作人員至關(guān)重要[2]。 有報道認(rèn)為，活性氧(ROS)是電離輻射引起的細(xì)胞損傷的介質(zhì)，因此，調(diào)節(jié)這些物質(zhì)的化合物在保護(hù)細(xì)胞免受輻射損傷方面可能具有重要意義。近年，研究人員已經(jīng)投入了大量精力開發(fā)具有抗氧化作用的化學(xué)輻射保護(hù)劑，這些保護(hù)劑可以在進(jìn)入放射性污染場所之前服用[3-5]。 然而，現(xiàn)有的輻射保護(hù)劑的輻射防護(hù)作用不夠持久，毒性與其在細(xì)胞保護(hù)劑量下的使用有關(guān)，且在暴露于輻射前使用最有效[2]。雖然適用于部分臨床情況，例如放療患者，但仍然無法應(yīng)用于各種緊急情況。目前，阿米福汀是被美國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的放射性保護(hù)藥物[6]，仍需要開發(fā)更多的保護(hù)劑。果糖是傳統(tǒng)中藥方劑四物湯中的主要活性成分，已被證實能保護(hù)小鼠免受γ射線輻射[7]。果糖通過阻止參與氧化還原循環(huán)的谷胱甘肽二硫化物外流，有效地防止呋喃妥因誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激而不產(chǎn)生細(xì)胞毒性[8]，通過抑制鐵氧化來保護(hù)氧化劑誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷，對氰化物、寡霉素、過氧化叔丁醇、甲萘醌和胱胺的毒性具有良好的防護(hù)作用，而果糖也是臨床常用的化學(xué)放射保護(hù)劑的重要成分之一[9]。所有這些都表明果糖可能是一種潛在的輻射防護(hù)劑，本文將初步探討果糖的輻射防護(hù)作用，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1試劑

DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基和新生牛血清(NBS)購自新西蘭Invitrogen公司。胰蛋白酶購自美國Amresco公司。果糖(純度大于99.5%)購自中國藥品生物制品檢定所(北京)。二乙酸二氯熒光素(DCFH-DA)購自瑞士Fluka公司。

1.1.2細(xì)胞

實驗使用中國倉鼠肺成纖維細(xì)胞(V79細(xì)胞)，將細(xì)胞培養(yǎng)于25 cm2培養(yǎng)瓶中，加入含10% NBS的DMEM，青霉素100 U/mL，鏈霉素100 μg/mL，置于5% CO2、溫度37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)實驗方法分為對照組、輻射組和果糖組，對照組不做特殊處理，輻射組使用輻射處理，果糖組則在輻射組基礎(chǔ)上使用果糖處理。

1.2 方法

1.2.1輻射

輻照前12 h以適當(dāng)?shù)臄?shù)量接種細(xì)胞，使細(xì)胞貼壁，室溫下，以鈷-60源照射，劑量率0.216 Gy/min。輻照后立即更換培養(yǎng)基。

1.2.2克隆形成率實驗

采用V79細(xì)胞單層培養(yǎng)法測定果糖的抑制細(xì)胞毒性和放射保護(hù)作用。選擇每個培養(yǎng)皿細(xì)胞的數(shù)量，使50～100個菌落在特定處理后能夠存活。 將固定數(shù)量的細(xì)胞置于含有2 mL培養(yǎng)基的35 mm培養(yǎng)皿中，在添加不同濃度的果糖之前，讓細(xì)胞貼壁12～16 h。 用預(yù)熱的新鮮培養(yǎng)基(對照培養(yǎng)皿)或含藥物培養(yǎng)基代替原培養(yǎng)基，再過24 h后，輻射培養(yǎng)皿，再用熱的磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗1次，然后將細(xì)胞培養(yǎng)在37 ℃，5% CO2溫育3 d。所得的菌落用無水甲醇固定，吉姆薩染色，只計數(shù)超過50個細(xì)胞的菌落，細(xì)胞存活率用溶媒處理(培養(yǎng)基)對照的百分比表示。

1.2.3實驗細(xì)胞的活力測定(MTS)分析

細(xì)胞在96孔板上以3×103個細(xì)胞/孔的密度生長。培養(yǎng)12 h后，向細(xì)胞加入不同濃度(0、10、50、250、500 μg/mL)的果糖，并在37 ℃下將細(xì)胞再培養(yǎng)24 h。孵育后，對細(xì)胞進(jìn)行輻射，然后在照射細(xì)胞48 h后，加入20 μL MTS溶液，在37 ℃下再孵育4 h。使用VictorTM1420酶標(biāo)儀(芬蘭Wallac公司)讀取490 nm處吸光度。同理，相同方法測定了用果糖預(yù)處理12 h及后處理48 h的細(xì)胞暴露于輻射后活力變化。

1.2.4臺盼藍(lán)排除法

將細(xì)胞培養(yǎng)在25 cm2的培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)12 h后，將不同濃度的果糖加入細(xì)胞中，細(xì)胞在37 ℃再孵育24 h。培養(yǎng)后，對細(xì)胞進(jìn)行照射。照射48 h后，臺盼藍(lán)染色后進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。將細(xì)胞懸浮液與相當(dāng)體積的0.4%臺盼藍(lán)溶液混合，隨后在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行檢測。細(xì)胞活力用存活細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的百分比來表示。同理，相同方法測定了用果糖預(yù)處理12 h及后處理48 h的細(xì)胞暴露于輻射后活力變化。

1.2.5超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)活性的測定

測量CAT活性的方法按照文獻(xiàn)[10-11]描述。將細(xì)胞提取物添加到3 mL含10 mmol/L H2O2的50 mmol/L磷酸緩沖液中(pH 7.8)，并立即在240 nm下測量。CAT活性以每克蛋白質(zhì)單位(U/mg)表示。

1.2.6ROS測定

用二乙酸二氯熒光素(DCFH-DA)檢測ROS。直接向培養(yǎng)基中加入DCFH-DA工作液10 μmol/L，37 ℃孵育15 min。然后用胰蛋白酶/乙二胺四乙酸(EDTA)去除細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀測量熒光增強(qiáng)的細(xì)胞數(shù)量。在測定果糖對ROS水平的影響時，細(xì)胞在照射前24 h暴露于果糖中，48 h后用DCFH-DA染色。在488 nm和525 nm處讀取吸光度(Ex 485 nm和Em 535 nm)。比較3組2′,7′-二氯熒光素(DCF)水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 V79細(xì)胞的輻射敏感性

存活分?jǐn)?shù)與輻射劑量的函數(shù)關(guān)系表明細(xì)胞對γ射線敏感，克隆形成率實驗允許SF2的特性(2 Gy存活分?jǐn)?shù))為(0.58±0.03)Gy，見圖1。

圖1 不同劑量γ射線照射后V79細(xì)胞的存活率

2.2 果糖對細(xì)胞存活的保護(hù)作用

在果糖存在的情況下，測量2 Gy照射后細(xì)胞克隆形成存活率，結(jié)果顯示即使在1 250 μg/mL的高濃度下，果糖也沒有表現(xiàn)出細(xì)胞毒性。在輻射前用不同濃度的果糖處理細(xì)胞24 h，并測定不同果糖處理濃度的存活率，結(jié)果顯示果糖的保護(hù)作用不同程度地依賴于果糖濃度。在10 μg/mL的低濃度下，與對照組比較，果糖組細(xì)胞存活率提高。果糖濃度從50 μg/mL提升至500 μg/mL時，細(xì)胞存活率也逐漸提高，在500 μg/mL時達(dá)到穩(wěn)定，見圖2、3。

與輻射組比較，果糖組存活細(xì)胞均增多，且這種保護(hù)作用與暴露于輻射前后的果糖添加時間無關(guān)。MTS法和臺盼藍(lán)排除法也證實了果糖對電離輻射的防護(hù)作用。用MTS法和臺盼藍(lán)排除法測定輻射后48 h細(xì)胞存活率，結(jié)果表明果糖組V79細(xì)胞存活率較對照組提高，見圖4～6。

圖2 不同濃度果糖對V79細(xì)胞毒性的影響

a：P<0.05，與輻射組比較。

a：P<0.05，與輻射組比較。

a：P<0.05，與輻射組比較。

a：P<0.05，與輻射組比較。

2.3 果糖對SOD和CAT活性的影響

輻射組在輻射24、48 h的SOD活性均低于對照組，果糖組SOD活性在輻射24 h明顯降低，而在輻射48 h明顯增加。24、48 h后，對照組和果糖組CAT活性有明顯差異，而輻射組和果糖組CAT活性基本一致，見圖7、8。

a：P<0.05，與對照組比較。

2.4 果糖對DCF熒光的影響

與對照組比較，輻射組DCF熒光增強(qiáng)，果糖組DCF熒光強(qiáng)度較輻射組降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖9。

a：P<0.05，與對照組比較。

3 討 論

四物湯是由地黃、當(dāng)歸、川芎、芍藥組成的傳統(tǒng)經(jīng)典名方，在我國已有一千多年的應(yīng)用歷史[12]，其具有造血、增強(qiáng)細(xì)胞免疫和放射防護(hù)等作用[13]。果糖是四物湯的主要成分，已證實其在部分壞死和凋亡的細(xì)胞模型中具有細(xì)胞保護(hù)作用[14]。然而，果糖是否具備保護(hù)細(xì)胞免受放射性損傷的能力還不得而知。本文報道了在γ射線照射下果糖對V79細(xì)胞具有輻射防護(hù)作用，并采用了3種方法檢驗，取得了一致性結(jié)果。

對于細(xì)胞保護(hù)機(jī)制，首先考慮通過增加糖酵解活性和產(chǎn)生三磷酸腺苷來介導(dǎo)[15]，筆者認(rèn)為果糖也可以通過作用于其他部位來提供保護(hù)。眾所周知，ROS在輻射損傷過程中損害了細(xì)胞關(guān)鍵成分，如DNA、蛋白質(zhì)和脂類，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡，并最終導(dǎo)致組織的物理和化學(xué)損傷。針對活性氧的保護(hù)路徑，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種抗氧化防御機(jī)制。這些抗氧化防御系統(tǒng)包括：(1)金屬螯合物，如銅藍(lán)蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白，能夠通過抑制Fenton或其他金屬催化反應(yīng)來防止ROS的形成；(2)低分子量抗氧化劑，如抗壞血酸，谷胱甘肽和生育酚；(3)ROS相互作用的酶，如SOD、CAT和谷胱甘肽過氧化物酶[16]。因此，本實驗通過測定分析SOD、CAT活性及ROS水平，闡釋了果糖對細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制可能是通過刺激抗氧化酶來發(fā)揮其有效的抗氧化劑作用。

綜上所述，果糖通過刺激SOD活性和降低ROS水平對V79細(xì)胞產(chǎn)生一定的抗輻射保護(hù)作用，其確切機(jī)制及電離輻射導(dǎo)致細(xì)胞死亡的機(jī)制尚有待深入研究，以期為開發(fā)新的輻射保護(hù)劑提供數(shù)據(jù)支撐。