基于DNA檢測的硅藻量化實(shí)驗(yàn)

劉泉，柯技，王樹法

（湖北警官學(xué)院，湖北 武漢 430034）

0 引言

水中尸體的檢驗(yàn)是法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中的重要工作內(nèi)容，一般是根據(jù)水性肺氣腫、蕈樣泡沫等特征性的溺死尸體現(xiàn)象來診斷溺死。但在實(shí)際檢案中，水中的尸體被發(fā)現(xiàn)時(shí)往往已腐敗，這些特征性的尸體現(xiàn)象也因腐敗而消失，因此，生前溺死與死后拋尸的診斷常被認(rèn)為是法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中的難點(diǎn)[1]。

硅藻在腐敗的尸體中也能長期存在，因此硅藻檢驗(yàn)被認(rèn)為是生前溺死診斷的重要依據(jù)。一般同時(shí)在肺、肝、腎等器官中發(fā)現(xiàn)與現(xiàn)場水樣中形態(tài)一致的硅藻，即可診斷為溺死。但部分研究顯示，有時(shí)在非溺死者體內(nèi)也能檢出硅藻，在溺死者體內(nèi)卻檢不出硅藻[2-3]。因此，如何正確認(rèn)識硅藻檢驗(yàn)結(jié)果，從技術(shù)上減少硅藻檢驗(yàn)的假陽性和假陰性結(jié)果，是目前法醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。

有學(xué)者發(fā)現(xiàn)在硅藻檢驗(yàn)中，對肺組織中的硅藻進(jìn)行計(jì)數(shù)，能在一定程度上減少假陽性結(jié)果對溺死診斷的影響，而且還在死亡地點(diǎn)推斷等方面具有良好的應(yīng)用前景[4-5]。不僅如此，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，已有不少研究者將DNA檢測應(yīng)用到溺死診斷領(lǐng)域中，如通過檢測水中存在的藻類細(xì)菌等與溺死相關(guān)的浮游微生物的基因來診斷溺死。普遍觀點(diǎn)認(rèn)為DNA檢測技術(shù)與傳統(tǒng)硅藻檢驗(yàn)方法相比具有安全性高、主觀因素影響小的優(yōu)點(diǎn)，有很好的應(yīng)用前景[6-8]。

目前，有關(guān)硅藻DNA特異性片段檢測的研究僅限于硅藻的定性研究，未見定量研究。本研究目的是擬通過定量檢測硅藻的DNA特異性片段，探索將DNA檢測技術(shù)與硅藻檢驗(yàn)量化體系進(jìn)行結(jié)合，為進(jìn)一步開展溺死診斷的硅藻量化檢驗(yàn)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試劑、耗材與儀器

蛋白酶K、DTT、Qubit? dsDNA HS Assay Kit DNA定量試劑盒（Thermo fisher Scientific），純水；剪刀、鉗子、EP管、無菌封口袋、記號筆、燒杯、洗瓶、小型解剖臺；高速冷凍離心機(jī)（Sigma）、Vortex振蕩儀、恒溫混勻儀（Eppendorf）、純水系統(tǒng)（Millipore）、高壓蒸汽滅菌鍋（Hirayama）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（Thermo）。

1.2 樣本準(zhǔn)備

1.2.1 硅藻源與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

標(biāo)準(zhǔn)濃度的梅尼小環(huán)藻（中科院水生生物研究所提供）；34只雄性實(shí)驗(yàn)室SD大鼠，體重300～400 g（華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷闹苽?/p>

水樣模型的制備：將500 mL標(biāo)準(zhǔn)水樣的梅尼小環(huán)藻液體倒入7500 mL，配成第一組水樣模型；將250 mL標(biāo)準(zhǔn)水樣的梅尼小環(huán)藻液體倒入7750 mL，配成第二組水樣模型；將125 mL標(biāo)準(zhǔn)水樣的梅尼小環(huán)藻液體倒入7875 mL，配成第三組水樣模型；將62.5 mL標(biāo)準(zhǔn)水樣的梅尼小環(huán)藻液體倒入7937.5 mL，配成第四組水樣模型。

動(dòng)物模型的制備：34只SD大鼠，被隨機(jī)分成10組：4個(gè)生前溺死組、4個(gè)死后拋尸組、1個(gè)空白生前溺死組、1個(gè)空白死后拋尸組。

生前溺死組：將SD大鼠稱重記錄，然后放入金屬捕鼠籠里，靜置30 s，然后連同籠子一起，分別浸入前面制備的水樣中1 min，然后提出水面，靜置30 s后再沉入水面。按此循環(huán)至少5次，直致大鼠死亡，死后的大鼠在溺液中浸泡30 min。

死后拋尸組：將SD大鼠斷頸處死，稱重記錄，拋入溺液中浸泡30 min。

空白生前溺死組：將SD大鼠以同生前溺死組的方式，放入不含有硅藻的純凈水中。

1.3 檢材的提取

1.3.1 內(nèi)臟器官的提取

將處死的SD大鼠，用雙蒸水反復(fù)沖洗體表，然后用干凈的剪刀剪開皮膚，更換干凈無硅藻污染的工具，切開肌肉和內(nèi)臟包膜，更換干凈無硅藻污染的工具，取出肝臟，放置干凈的器皿中，稱重并記錄。更換干凈的工具，采取同樣的方法取出腎臟和兩邊的肺組織，分別稱重并記錄。

1.3.2 臟器硅藻DNA提取

取適量稱重記錄后，放入干凈無DNA、RNA污染的50 mL離心管中，加蛋白酶消化過夜；離心，將上清轉(zhuǎn)移到另一干凈無DNA、RNA污染的50 mL離心管中，將沉淀轉(zhuǎn)移到2 mL離心管中，向50 mL離心管中加入5 mL NaCl，加95%乙醇至20 mL，向2 mL離心管中加入3% CTAB，離心，棄上清。再向50 mL離心管內(nèi)加入超純水；將50 mL離心管內(nèi)沉淀洗脫，將沉淀轉(zhuǎn)移至2 mL的離心管。重復(fù)洗脫步驟一次。將兩部分沉淀合并，然后50 ℃放置3 h，向2 mL的離心管中按照一定比例加入氯仿和異戊醇。將上清轉(zhuǎn)移到新的離心管，加入異丙醇，混勻，-20 ℃過夜。離心，上清轉(zhuǎn)移到新的離心管，再加入5 mL NaCl、無水乙醇，混勻，離心，棄上清，將沉淀溶于蒸餾水中，用槍頭懸浮溶液，再離心，將上清轉(zhuǎn)移到新編號的離心管，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 硅藻標(biāo)準(zhǔn)樣DNA提取

將取自500 mL標(biāo)準(zhǔn)水樣中的20份1 mL硅藻液體離心，棄上清，45 ℃真空干燥，然后加入少量石英砂，研磨充分，使用CTAB法提取DNA。

1.4 單拷貝標(biāo)記開發(fā)

通過目前已經(jīng)測得的硅藻基因組數(shù)據(jù)通過Ortho Finder 2軟件篩選合適的備選目的片段，并利用Sanger測序驗(yàn)證目的片段擴(kuò)增長度和準(zhǔn)確性。

1.5 DNA擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)

1.5.1 熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)

每個(gè)樣品分別做不稀釋、稀釋10倍、稀釋100倍、稀釋1000倍4個(gè)濃度梯度，每個(gè)梯度含3個(gè)重復(fù)。期間，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的PCR程序操作，最后通過熒光定量中的溶解曲線，同一樣品中不同梯度重復(fù)間的差異，擴(kuò)增曲線的變化來判斷測試樣本的絕對量。

1.5.2 單拷貝常規(guī)PCR擴(kuò)增

利用高通量測序技術(shù)，通過對單拷貝片段的擴(kuò)增，比較測試樣本與標(biāo)準(zhǔn)品高通量測序情況來判定每個(gè)測試樣品的絕對量。設(shè)計(jì)了標(biāo)簽引物對每個(gè)樣品進(jìn)行特異性標(biāo)記，選擇了30個(gè)循環(huán)和40個(gè)循環(huán)兩個(gè)PCR反應(yīng)程序，獲取高通量測序的產(chǎn)物。

每個(gè)樣品分別做不稀釋、稀釋2倍、稀釋4倍、稀釋8倍、稀釋16倍、稀釋32倍、稀釋64倍、稀釋128倍8個(gè)濃度梯度，進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增。

1.5.3 單拷貝兩輪PCR擴(kuò)增

第一輪PCR先將引物和引導(dǎo)序列引入，第二輪PCR利用引導(dǎo)序列與第二輪引物序列的重疊區(qū)將一輪PCR產(chǎn)物富集。每個(gè)樣品分別做不稀釋、稀釋2倍、稀釋4倍3個(gè)濃度梯度，然后進(jìn)行PCR反應(yīng)。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 單拷貝基因片段開發(fā)結(jié)果

利用軟件對現(xiàn)有硅藻基因組進(jìn)行注釋，通過篩選，篩選出單拷貝的18個(gè)片段作為候選并設(shè)計(jì)了引物。后續(xù)通過測序進(jìn)行序列驗(yàn)證，結(jié)果顯示片段OG0011727獲得的目的片段條帶短，進(jìn)一步鑒定結(jié)果為梅尼小環(huán)藻，為其中比較適合硅藻拷貝數(shù)定量的片段，見圖1。

圖1 單拷貝基因片段電泳結(jié)果

2.2 小鼠組織硅藻DNA提取情況

通過DNA提取實(shí)驗(yàn)，獲得了98份含硅藻的小鼠組織DNA的凝膠電泳圖。從圖2中可以看出，這些DNA的降解較為嚴(yán)重，片段長度較短。其中，大鼠腎臟和心臟組織中獲得的DNA較少，其次為肺臟和脾臟，肝臟中獲得的DNA最多。

圖2 大鼠組織硅藻DNA提取情況（P：脾臟；S：腎；F：肺；X：心；G：肝）

2.3 標(biāo)準(zhǔn)樣DNA提取情況

通過對20個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣進(jìn)行DNA提取，發(fā)現(xiàn)：20份標(biāo)準(zhǔn)樣僅一個(gè)（B01）未發(fā)現(xiàn)明顯的主帶；兩個(gè)樣品（B12、B16）含主帶但DNA濃度低于其他樣品；其余樣品均主帶明顯，見圖3。

圖3 標(biāo)準(zhǔn)樣DNA提取情況

2.4 熒光定量PCR結(jié)果

對樣本進(jìn)行熒光定量PCR，發(fā)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線良好，可重復(fù)性好，其余樣本樣品進(jìn)行45個(gè)循環(huán)后仍示未達(dá)到平臺期，見圖4、圖5。

圖4 標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線

圖5 臟器樣本擴(kuò)增曲線

2.5 單拷貝常規(guī)PCR結(jié)果

2.5.1 30個(gè)循環(huán)的PCR程序結(jié)果

所有樣品均未見目的片段擴(kuò)增陽性帶，見圖6。

圖6 30個(gè)循環(huán)單拷貝常規(guī)PCR結(jié)果

2.5.2 40個(gè)循環(huán)的PCR程序結(jié)果

僅標(biāo)準(zhǔn)樣擴(kuò)增情況較好，臟器樣本僅在P32的1/64梯度成功擴(kuò)增目的片段。此后我們嘗試過向PCR體系中加入各種輔助試劑（BSA、DMSO等），PCR成功率仍未改觀，見圖7。

圖7 40個(gè)循環(huán)單拷貝常規(guī)PCR結(jié)果

2.6 單拷貝兩輪PCR結(jié)果

硅藻單拷貝專一引物兩輪PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，標(biāo)準(zhǔn)樣在內(nèi)的所有樣本均沒有相應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物擴(kuò)增成功，見圖8。

圖8 單拷貝兩輪PCR結(jié)果

3 討論

在溺水過程中，當(dāng)溺水介質(zhì)流入氣道時(shí)，天然水中的硅藻會(huì)滲透到肺泡系統(tǒng)。硅藻隨后廣泛分布于周圍器官[9]。肺、肝和腎中同時(shí)檢出硅藻，一般可用于診斷溺死。從筆者以往的實(shí)驗(yàn)顯示[10]，硅藻實(shí)驗(yàn)中能被觀察的硅藻的數(shù)量與取材量有關(guān)，即取材量越大，硅藻數(shù)量就越多，硅藻的檢測效果也就越好，同時(shí)硅藻數(shù)量與溺液中硅藻的數(shù)量有一定的關(guān)系。傳統(tǒng)光鏡下檢驗(yàn)硅藻存在檢材消耗量大，實(shí)驗(yàn)過程安全性不高，實(shí)驗(yàn)過程損耗高，污染系數(shù)高等問題，常被法醫(yī)工作者詬病。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，基因檢測技術(shù)相較于光鏡下檢驗(yàn)硅藻有取材用量少、一次性檢驗(yàn)樣本多、易于浮游生物種屬分類、實(shí)驗(yàn)過程安全等優(yōu)勢，為輔助溺死診斷提供了新的研究方法。本課題嘗試使用DNA技術(shù)對硅藻進(jìn)行定量分析，以期探索更多的硅藻定量檢驗(yàn)的方式。

近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，已有不少研究者將DNA檢測應(yīng)用到溺死診斷領(lǐng)域中，但主要集中在核糖體DNA的檢測上，如Jian Tie 等[11]對溺死者組織進(jìn)行PCR后檢測，發(fā)現(xiàn)藍(lán)藻的16S rDNA片段用于溺死診斷的靈敏度明顯優(yōu)于傳統(tǒng)的硅藻檢驗(yàn)法，為除硅藻外的其他藻類輔助診斷溺死提供了依據(jù)。何方剛等[12-13]研究表明使用PCR技術(shù)擴(kuò)增浮游生物16SrDNA第三、第四可變區(qū)可用于溺死的定性診斷，使用PCR-DGGE法擴(kuò)增檢測相應(yīng)基因片段還可用于溺死地點(diǎn)的推斷等。核糖體DNA主要是轉(zhuǎn)錄過程中的產(chǎn)生的基因片段，拷貝倍數(shù)沒有定論，因此不適宜用作硅藻DNA絕對定量分析。本課題組為解決這個(gè)問題，嘗試開發(fā)單拷貝位點(diǎn)，該單拷貝位點(diǎn)必須具備兩個(gè)條件：一是較為容易擴(kuò)增且片段較短，這是由于較長的擴(kuò)增片段會(huì)隨著熒光定量PCR體系中酶活力的下降增加實(shí)驗(yàn)中的變數(shù)，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)偏差；二是所用目的片段應(yīng)為單拷貝或固定拷貝，這是因?yàn)楣潭截惖钠尾湃菀淄ㄟ^比對，從而較為精確開展定量計(jì)算。滿足以上條件后，當(dāng)片段在硅藻中為固定拷貝時(shí)，測試樣品通過與標(biāo)準(zhǔn)樣進(jìn)行比較即可得到該測試樣本的絕對定量，無需進(jìn)行其他復(fù)雜換算。為完成這項(xiàng)工作，課題組決定從單拷貝的細(xì)胞核基因入手，通過篩選目前已經(jīng)測得的硅藻基因組數(shù)據(jù)，得到備選目的片段，然后利用Sanger測序驗(yàn)證目的片段擴(kuò)增長度和準(zhǔn)確性。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，本課題開發(fā)的梅尼小環(huán)藻的單拷貝目的基因滿足以上條件。

在PCR實(shí)驗(yàn)中，未檢測出目的片段的原因首先是樣品中的硅藻拷貝數(shù)過低，其次是標(biāo)準(zhǔn)樣和測試樣品擴(kuò)增的目的片段不一致，再次是操作失誤。盡管本實(shí)驗(yàn)中梅尼小環(huán)藻的單拷貝目的基因開發(fā)順利，但是從后續(xù)實(shí)驗(yàn)來看，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物樣本均未檢測出目的片段。為了探尋原因，課題組每類實(shí)驗(yàn)均重復(fù)了至少2次，并且還使用了不同循環(huán)次數(shù)的PCR，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，重復(fù)較多的DNA檢測結(jié)果顯示有少量目的片段，因此，基本排除標(biāo)準(zhǔn)樣和測試樣品擴(kuò)增的目的片段不一致或操作失誤的兩種可能。

綜合以上因素，本課題組認(rèn)為，硅藻DNA檢測開展定量檢測目前條件還不成熟，主要原因推測有兩點(diǎn)：一是單拷貝硅藻DNA的含量過低，不如多拷貝的核糖體DNA檢測成功率高，不利于DNA 的檢出；二是從大鼠組織硅藻DNA提取情況來看，大鼠組織和硅藻混合性DNA盡管降解嚴(yán)重，但總含量還是比較高，說明大鼠DNA在提取出的DNA混合物中占絕對主導(dǎo)，影響了硅藻DNA的檢出。盡管本實(shí)驗(yàn)未檢出單拷貝硅藻基因，但硅藻的定量檢測和DNA檢測在溺死診斷中有很好的應(yīng)用前景，課題組認(rèn)為下一步如能開發(fā)出靈敏度高的固定多拷貝基因片段，將有利于將DNA檢測技術(shù)運(yùn)用于硅藻的定量檢測中，為溺死的診斷、溺死地點(diǎn)的推斷等提供更多的信息。