蘭州百合不同外植體植物組織培養(yǎng)

樊敏唐亞玲王莉馬倩呂小旭徐向恩

(1.甘肅醫(yī)學(xué)院，甘肅 平?jīng)?744000；2.平?jīng)鍪兴幤窓z驗檢測中心，甘肅 平?jīng)?744000)

蘭州百合(Lilium davidii var.willmottiae(E.H.Wilson)Raffill)屬于百合科百合屬單子葉多年生草本植物。蘭州百合是甘肅省蘭州市特產(chǎn)的地理性標(biāo)志產(chǎn)物，其色澤潔白如玉，纖維含量較少，味道甜美，具有很高的營養(yǎng)價值和經(jīng)濟(jì)價值[1-3]。蘭州百合是百合中的上乘之品，是全國唯一的食用甜百合[4]。蘭州百合已經(jīng)成為蘭州周邊地區(qū)帶動經(jīng)濟(jì)發(fā)展的主要支持產(chǎn)業(yè)。

現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，百合中含有甾體皂苷、生物堿、黃酮類成分、苯丙素和多糖類成分[5-10]。百合在治療疾病方面運(yùn)用較廣泛，如安神助眠、止咳化痰、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、抗氧化、抗腫瘤、抗炎、抗菌，同時還可以降低血糖濃度[10-14]。與此同時，百合還是一個藥食兩用品。而近年來，市場需求不斷增加，種植面積不斷增大，但是目前食用百合中存在種源退化嚴(yán)重、連作障礙、病害流行嚴(yán)重、育種工作落后等問題[15]，并已成為將蘭州百合推向市場走向世界的阻礙。

近年來，植物組織培養(yǎng)技術(shù)已日趨成熟[16-18]，通過對植物進(jìn)行組織培養(yǎng)，篩選出最佳培養(yǎng)基，促進(jìn)該植物規(guī)模化生產(chǎn)。因此，本研究通過對蘭州百合進(jìn)行植物組織培養(yǎng)，篩選其最佳培養(yǎng)基、最佳消毒時間以及接種方式建立其快速繁殖體系，擴(kuò)大其生產(chǎn)量，為蘭州百合規(guī)?；a(chǎn)提供理論基礎(chǔ)及技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

蘭州百合新鮮鱗莖、莖、葉。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基

以MS為基本培養(yǎng)基，設(shè)置2種不同激素濃度的培養(yǎng)基。

1.2.1.1 誘導(dǎo)愈傷組織及叢生芽培養(yǎng)基

MS培養(yǎng)基加6-BA 1.0mg·L-1加2,4-D 3.0mg·L-1加蔗糖30g·L-1加瓊脂8g·L-1；MS培養(yǎng)基加6-BA 1.0mg·L-1加2,4-D 0.5mg·L-1加蔗糖30g·L-1加瓊脂8g·L-1。

1.2.1.2 生根培養(yǎng)基

MS加蔗糖30g·L-1加瓊脂6g·L-1加NAA 0.1mg·L-1。

1.2.2 外植體處理

1.2.2.1 外植體消毒

用毛刷輕輕刷去百合鱗莖、莖、葉上的泥垢后，流水沖洗30min，分別用以下2種方法進(jìn)行消毒，做好標(biāo)記。

75%的酒精消毒30s后用0.1%的升汞浸泡12min，中間換1次升汞溶液，最后在無菌室中用無菌水沖洗5～8次；漂白粉過飽和溶液上清液浸泡15min，無菌水沖洗1～2次，75%酒精浸泡1～2s，無菌水沖洗2～3次，0.1%點升汞浸泡8～10min，無菌水沖洗5～8次。

1.2.2.2 外植體接種

將上述消毒好的鱗莖縱切成0.5～1cm2小塊，近軸面分別向上、向下放置。莖橫切成段平放在培養(yǎng)基表面。葉切為1～2cm2小片放置在培養(yǎng)基上。

1.2.2.3 培養(yǎng)條件

溫度25±2℃，光照強(qiáng)度3000lx，光照周期12h/24h。

1.2.3 生根培養(yǎng)

待叢生芽長至3～5cm長時，將已形成的叢生芽轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基中，進(jìn)行生根培養(yǎng)。培養(yǎng)條件，溫度27±1℃，光照強(qiáng)度2100～2500lx，光照周期12h/24h。約30d后統(tǒng)計生根率。

1.2.4 煉苗和移栽

生根培養(yǎng)40d左右，待幼根在培養(yǎng)基上長到2～3cm時，進(jìn)行煉苗。先去掉瓶蓋，煉苗2～3d后用鑷子取出并用水洗凈根部的瓊脂，栽入腐殖土∶珍珠巖=1∶1的營養(yǎng)基質(zhì)中，30d后調(diào)查成活率。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同激素濃度對愈傷組織及叢生芽誘導(dǎo)的影響

表1 不同激素濃度對愈傷組織及叢生芽誘導(dǎo)的影響

在探究激素濃度對愈傷組織及叢生芽誘導(dǎo)的影響時，2,4-D含量過少，誘導(dǎo)的愈傷組織也越少，且愈傷組織生長緩慢。而使用MS加6-BA 1.0mg·L-1加2,4-D 3.0mg·L-1加蔗糖30g·L-1加瓊脂8g·L-1時，愈傷組織生長較快，且長出的愈傷組織呈瘤狀突起，愈傷組織約在30～40d后分化為叢生芽。

2.2 不同消毒方法對百合誘導(dǎo)愈傷組織及叢生芽的影響

從表2可以看出，外植體通過漂白粉過飽和溶液上清液處理15min，75%酒精處理2s，0.1%升汞處理9min后，污染率高達(dá)73.34%，說明消毒效果不佳，容易被污染。由此可見，最佳消毒方法為75%酒精30s加0.1%升汞10min(中間更換1次升汞溶液)。

表2 不同消毒方法對愈傷組織及叢生芽誘導(dǎo)的影響

2.3 不同外植體對百合愈傷組織及叢生芽誘導(dǎo)的影響

表3 不同外植體對愈傷組織及叢生芽誘導(dǎo)的影響

通過對蘭州百合不同部位進(jìn)行植物組織培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)愈傷組織誘導(dǎo)率順序大小為鱗莖>莖>葉片，且愈傷組織分化為叢生芽的時間也是如此，見圖1～4。在以鱗莖為外植體時，放置方式對誘導(dǎo)速度也有影響，近軸面向上放置能更快出現(xiàn)愈傷組織并分化成叢生芽。

2.4 生根培養(yǎng)

由于莖與葉前期愈傷組織誘導(dǎo)效果不佳，因此在轉(zhuǎn)接生根時將鱗莖的叢生芽轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基中，生根培養(yǎng)基為MS加蔗糖30g·L-1加瓊脂6g·L-1加NAA 0.1mg·L-1。

表4 叢生芽轉(zhuǎn)接生根表

2.5 煉苗與移栽

幼根在培養(yǎng)基長至2～3cm長時進(jìn)行煉苗并移栽，移栽入腐殖土∶珍珠巖=1∶1的營養(yǎng)基質(zhì)中時，需加入百菌清1000倍液以及吡蟲啉1000倍液以防生蟲、生菌。移栽入營養(yǎng)基質(zhì)中30d統(tǒng)計成活率時，發(fā)現(xiàn)移栽的幼根發(fā)育為1～2cm的小鱗莖。將已生根的131株全部移栽，成活數(shù)為106，成活率為80.92%。

3 討論

不同激素濃度對于愈傷組織的誘導(dǎo)具有重要影響，濃度過低誘導(dǎo)率低且叢生芽生長緩慢。誘導(dǎo)愈傷組織及叢生芽的最佳培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基加6-BA 1.0mg·L-1加2,4-D 3.0mg·L-1加蔗糖30g·L-1加瓊脂8g·L-1。蘭州百合在接種時不同的消毒方式對愈傷組織及叢生芽的誘導(dǎo)影響顯著，通過對比，最佳消毒方式為75%酒精30s加0.1%升汞12min(中間換1次升汞溶液)加無菌水沖洗5～8次。不同外植體的誘導(dǎo)率不同，誘導(dǎo)率為鱗莖>莖>葉。除此之外，外植體放置時近軸面向上放置時形成愈傷組織更快。

本試驗分別以蘭州百合鱗莖、莖、葉為外植體，進(jìn)行愈傷組織及叢生芽誘導(dǎo)、生根培養(yǎng)、煉苗移栽，建立蘭州百合快速繁殖體系，以期增加產(chǎn)量，為規(guī)?；a(chǎn)奠定理論基礎(chǔ)。