馬纓丹在鎘、鉛、鋅復合脅迫下的耐性和解毒機制

謝倚慧，張明華，熊 瑞，李 婷，蒲玉琳，徐小遜，李 云，張世熔，賈永霞① (.四川農(nóng)業(yè)大學資源學院，四川 成都 630；.四川農(nóng)業(yè)大學環(huán)境學院，四川 成都 630)

近年來，礦產(chǎn)開采和冶煉導致大量重金屬釋放、遷移進入土壤，造成嚴重的土壤重金屬污染[1-2]。四川鉛鋅礦產(chǎn)資源豐富，是我國5大鉛鋅礦生產(chǎn)基地之一，分布有較多共生或伴生鎘的鉛鋅礦[3]。礦山開采帶來經(jīng)濟效益的同時，也使礦區(qū)及周邊土壤受到不同程度的重金屬污染，其中以鎘、鉛、鋅復合污染最為嚴重[4]。土壤中過量的重金屬易被植物吸收，抑制植物根系生長，影響植物養(yǎng)分吸收；同時，過量的重金屬能破壞植物細胞結構，抑制葉綠素合成和多種生理代謝過程，造成植物黃化、枯萎，甚至死亡[5-6]。

為提高自身對重金屬的適應性，不少植物形成了獨特的解毒機制，主要有外部排斥機制和內(nèi)部耐受機制[7]。前者指植物可通過某些途徑以減少自身對重金屬的吸收，或?qū)⑽盏闹亟饘僭卮蟛糠止潭ㄔ诟抵?，限制其向地上部運輸。如石菖蒲[8]以及木賊和蜈蚣草[9]等可通過減少對鉛、鎘的吸收來提高自身耐性，而覆瓦櫟[10]以及香附子和土荊芥[9]則是通過根系的固持作用來緩解鎘、鉛、鋅對植物地上部的毒害。內(nèi)部耐受機制指重金屬在植物體內(nèi)以不具生物活性的解毒形式存在。區(qū)隔化作用是重要的內(nèi)部耐受機制之一，它主要是將重金屬儲存在液泡或細胞壁，使之與細胞中代謝活躍的器官分隔開，從而降低重金屬對植物細胞的傷害[11-12]。研究發(fā)現(xiàn)，蓖麻可將吸收的鎘、鋅固定在細胞壁上以緩解毒性[13]；而萱草[14]和天藍遏藍菜[15]體內(nèi)的鎘、鉛則主要存在于可溶性組分中，通過液泡區(qū)隔化以降低毒害。植物體內(nèi)的蛋白質(zhì)、果膠酸鹽、草酸鹽等物質(zhì)也可與重金屬結合，改變其存在形態(tài)，影響其毒性和遷移能力[16-17]。鎘在華中蹄蓋蕨[18]和大豆[19]中主要以氯化鈉提取態(tài)和醋酸提取態(tài)等毒性較低的形式存在，而圓葉無心菜[20]和波斯菊[21]體內(nèi)的鉛、鋅則是以毒性更低的醋酸提取態(tài)和鹽酸提取態(tài)存在。以上研究表明不同植物對重金屬的解毒機制不同，研究重金屬在植物各器官中含量、亞細胞分布及化學形態(tài)特征對明確植物解毒機制具有重要意義。

馬纓丹(Lantanacamara)又名五色梅，為馬鞭草科馬纓丹屬常綠小灌木，是一種花、葉兩用的觀賞性植物，廣泛分布于我國四川、云南、浙江等地。馬纓丹生長速度快，生物量大，且生態(tài)適應性強，不僅能在四川省漢源縣富泉鉛鋅礦區(qū)自然生長，而且是該礦區(qū)的一種優(yōu)勢植物，表明馬纓丹對鎘、鉛、鋅復合污染可能具有較高耐性。前期研究[22-23]發(fā)現(xiàn)，馬纓丹在鎘、鉛單一污染條件下可通過減少鎘、鉛向地上部轉(zhuǎn)運和區(qū)隔化作用來緩解重金屬毒害。但馬纓丹在鎘、鉛、鋅復合污染條件下的耐性和解毒機制尚不明確。因此，以漢源縣富泉鉛鋅礦區(qū)馬纓丹為材料，通過盆栽試驗，研究其在鎘、鉛、鋅復合污染條件下，各部位重金屬的含量、亞細胞分布模式和賦存形態(tài)，探討馬纓丹在復合污染條件下耐性和解毒機制，以期為礦區(qū)植被恢復和重金屬污染土壤治理提供一定參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試馬纓丹采自四川省漢源縣富泉鉛鋅礦區(qū)。試驗所用土壤采自四川省成都市溫江區(qū)公平鎮(zhèn)農(nóng)用地。土壤基本理化性質(zhì)：pH值為6.74，有機質(zhì)含量為21.1 mg·kg-1，堿解氮含量為65.4 mg·kg-1，速效鉀含量為212.1 mg·kg-1，速效磷含量為47.5 mg·kg-1，全鎘含量為0.072 mg·kg-1，全鉛含量為68.4 mg·kg-1，全鋅含量為94.8 mg·kg-1，均低于GB 15618—2018《土壤環(huán)境質(zhì)量 農(nóng)用地土壤污染風險篩選標準(試行)》風險篩選值。

1.2 試驗方法

試驗于2017年6—10月在四川農(nóng)業(yè)大學成都校區(qū)塑料大棚內(nèi)進行。試驗所用土壤經(jīng)風干、壓碎、過5 mm孔徑篩后，裝入40 cm×30 cm塑料盆中，每盆裝土8.0 kg。試驗共設置8個重金屬處理含量(表1)，以不添加重金屬為對照，每個處理重復5次。將相應量的CdCl2·2.5H2O(分析純)、ZnSO4·7H2O(分析純)和CuSO4·5H2O(分析純)配制成溶液，與土壤混合均勻，放置4周，使重金屬達到平衡狀態(tài)。

表1 不同Cd、Pb、Zn含量處理Table 1 Different treatments of Cd, Pb, Zn concentration

馬纓丹采用扦插方式育苗。剪取10～15 cm左右當年生馬纓丹枝條作為插穗，待扦插成活長出2～3片新葉后，選取長勢基本一致的幼苗進行移栽，每盆3株。在馬纓丹生長期間，定期澆水、除草，觀察植物生長情況。于90 d后收獲植株，進行各項指標測定。

1.3 測定方法

1.3.1生物量的測定

將采集植物樣品分為地上部和根系2個部分，經(jīng)洗凈、烘干后測定干重。

1.3.2相對電導率的測定

電導率采用DDS-12A型電導率儀測定，相對電導率為煮沸前電導率與煮沸后電導率的比值。

1.3.3重金屬含量的測定

植物樣品中重金屬含量測定參照ZHANG等[24]的濕灰化法：采用V(HNO3)∶V(HClO4)=4∶1的混合液將植物樣品進行消化，采用原子吸收光譜儀(AAS)測定重金屬含量。

1.3.4亞細胞分級

亞細胞組分的分離參照FU等[25]的亞細胞分級方法：采用差速離心法將植物樣品分離為細胞壁、細胞器和可溶性組分3個部分，分離出的各組分采用V(HNO3)∶V(HClO4)=4∶1混合液消化后，采用原子吸收光譜儀(AAS)測定重金屬含量。

1.3.5重金屬形態(tài)測定

重金屬形態(tài)測定參照白雪等[26]的逐步提取法并進行改進：分別采用w為80%乙醇、去離子水、1 mol·L-1氯化鈉溶液、w為2%醋酸、0.6 mol·L-1鹽酸逐級提取植物樣品中重金屬，提取液及殘渣采用V(HNO3)∶V(HClO4)=4∶1混合液進行消化后，采用原子吸收光譜儀(AAS)測定重金屬含量。各提取液對應形態(tài)分別為乙醇提取態(tài)、水提取態(tài)、氯化鈉提取態(tài)、醋酸提取態(tài)和鹽酸提取態(tài)，殘渣經(jīng)消化后為殘渣態(tài)。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel 2010和SPSS 22.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析，采用最小顯著差法(LSD)對差異顯著性(P<0.05)進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 鎘、鉛、鋅復合污染對馬纓丹生物量的影響

不同鎘、鉛、鋅含量處理馬纓丹生物量見表2。

表2 不同Cd、Pb、Zn含量處理馬纓丹各部分生物量和相對電導率的變化Table 2 The dry weight and relative electrical conductivity of Lantana camara under different treatments of heavy metal concentrations

如表2所示，當鎘、鉛、鋅含量從CK增至T2處理時，馬纓丹根系、地上部和全株生物量隨重金屬處理含量增加而增加，且以T2處理為最大，分別為CK的1.76、1.59和1.62倍；當污染含量大于T2處理時，馬纓丹各部位生物量隨重金屬含量增加而呈不斷下降趨勢，T5處理馬纓丹根系生物量較CK顯著降低，T6處理地上部和全株生物量較CK顯著降低。T7處理馬纓丹根系、地上部和全株生物量最小，較對照分別降低32.8%、18.9%和21.4%。在高含量重金屬復合污染條件下，馬纓丹生長才會受到抑制，表明其對鎘、鉛、鋅復合污染具有較好耐性。

2.2 鎘、鉛、鋅復合污染對馬纓丹相對電導率的影響

不同鎘、鉛、鋅復合處理馬纓丹根系和葉片相對電導率變化情況見表2。如表2所示，隨著重金屬處理含量增加，馬纓丹根系和葉片相對電導率呈現(xiàn)逐漸上升趨勢，分別于T3和T4處理時顯著高于CK，且均在T7處理時達到最大，分別為CK的2.08和1.45倍。由此可見，隨著重金屬復合污染程度加重，馬纓丹細胞膜受損害程度不斷加深。

2.3 馬纓丹各部位中鎘、鉛、鋅含量

馬纓丹根系和地上部鎘、鉛、鋅含量見圖1。如圖1所示，隨著鎘、鉛、鋅復合污染程度加重，馬纓丹地上部和根系鎘含量先升高后降低，且在T4處理時達到最大值，分別為CK的8.25和11.07倍。馬纓丹地上部和根系鉛、鋅含量則隨著污染程度加重而逐漸上升，在T7處理時達到最大，分別為CK的10.47、6.15倍和23.35、20.80倍。各處理馬纓丹根系鎘、鋅含量均高于地上部，而地上部鉛含量則高于根系，表明馬纓丹根系對鎘、鋅具有較好的固持能力。

2.4 馬纓丹各器官中鎘、鉛、鋅的亞細胞分布

馬纓丹各器官中鎘、鉛、鋅的亞細胞分布情況見圖2。如圖2所示，在不同含量鎘、鉛、鋅復合污染條件下，馬纓丹根、莖、葉中鎘、鉛主要存在于可溶性組分(45.2%～62.5%和44.2%～66.7%)中，細胞壁(29.7%～44.0%和25.2%～44.1%)次之，細胞器(7.1%～12.2%和6.0%～13.1%)中分布最少。隨著復合處理含量升高，馬纓丹各器官中鎘、鉛在可溶性組分中占比降低，在細胞壁中占比提高，在細胞器中占比變化不明顯。馬纓丹各器官中鋅主要分布于細胞壁和可溶性組分中，且兩者占比相差不大，分別占總量的39.8%～50.4%和39.2%～52.4%，而在細胞器中占比較少，僅占總量的4.8%～11.6%。提高重金屬含量對鋅在馬纓丹各器官中占比的影響不明顯。

2.5 馬纓丹各器官中鎘、鉛、鋅的化學形態(tài)特征

不同形態(tài)鎘、鉛、鋅在馬纓丹各器官中的分配存在差異(圖3)。鎘在馬纓丹根、莖、葉中主要以氯化鈉提取態(tài)和醋酸提取態(tài)(50.7%～73.2%)形式存在，乙醇提取態(tài)和水提取態(tài)(14.2%～20.8%)占比較少。當鎘、鉛、鋅復合含量增加時，馬纓丹根中氯化鈉提取態(tài)鎘占比增加，醋酸提取態(tài)鎘占比降低，而在莖、葉中變化規(guī)律卻相反，其他形態(tài)鎘在根、莖、葉中占比變化不大。鉛在馬纓丹各器官中占比規(guī)律與鎘相似，主要以氯化鈉提取態(tài)和醋酸提取態(tài)為主，占總量的47.9%～58.9%，乙醇提取態(tài)和水提取態(tài)較少，僅占總量的14.6%～28.4%；隨著污染程度加重，馬纓丹葉片中乙醇提取態(tài)鉛占比降低，水提取態(tài)鉛占比上升，而在根、莖中兩者變化不明顯；在各器官中，氯化鈉提取態(tài)鉛占比隨重金屬含量增加而降低，醋酸提取態(tài)、鹽酸提取態(tài)和殘渣態(tài)鉛占比卻隨重金屬含量增加而增加。鋅在馬纓丹各器官中主要以氯化鈉提取態(tài)和醋酸提取態(tài)(46.7%～63.2%)形式存在，乙醇提取態(tài)和水提取態(tài)鋅(19.6～32.2%)次之，殘渣態(tài)和鹽酸提取態(tài)鋅(12.8%～21.1%)占比最?。浑S著重金屬含量增加，馬纓丹根部乙醇提取態(tài)鋅占比增加，醋酸提取態(tài)鋅占比降低，而在莖、葉中，前者變化不明顯，后者則有所上升；在各器官中，氯化鈉提取態(tài)鋅占比隨重金屬含量增加而降低，鹽酸提取態(tài)、殘渣態(tài)鋅則相反，而水提取態(tài)鋅占比變化不明顯。

3 討論

鎘、鉛、鋅等重金屬易被植物吸收并積累，積累超過一定程度時，會對植物產(chǎn)生毒害作用，使植物表現(xiàn)出葉片失綠、生長遲緩、植株矮小等癥狀；然而，少量重金屬卻對植物生長有一定促進作用[16,27]。研究[28]表明，低水平重金屬復合污染可刺激玉米幼苗生長，高水平污染才會對玉米幼苗生長表現(xiàn)出抑制作用，且隨著脅迫水平增加，抑制作用逐漸增強。筆者試驗發(fā)現(xiàn)，低含量鎘、鉛、鋅復合污染條件下馬纓丹生物量顯著高于CK，在高含量污染條件下，馬纓丹生物量才隨污染程度加重表現(xiàn)出逐漸降低趨勢，直至T6〔w(Cd)、w(Pb)和w(Zn)分別為60、800和1 000 mg·kg-1〕處理，土壤重金屬含量遠高于GB 15618—2018中風險篩選值〔w(Cd)、w(Pb)和w(Zn)分別為0.3、120和250 mg·kg-1〕和風險管制值〔w(Cd)和w(Pb)分別為3.0和700 mg·kg-1〕時才較CK顯著降低。這表明馬纓丹能在高含量鎘、鉛、鋅復合污染條件下正常生長，對鎘、鉛、鋅具有較高耐性。T7處理馬纓丹根系和地上部生物量均達到最小，且根系生物量下降幅度(32.8%)大于地上部(18.9%)，表明在同樣高含量復合污染水平下，馬纓丹地上部受到的毒害作用小于根系。

重金屬離子可與巰基和磷脂類物質(zhì)反應，破壞細胞膜蛋白和磷脂類結構，使得細胞膜透性增加，大量電解質(zhì)外滲，引起離子平衡失調(diào)和細胞代謝紊亂[29]。相對電導率是表征膜透性的重要指標之一。研究[30]發(fā)現(xiàn)，在鎘、鉛、鋅單一污染條件下，天竺葵葉片相對電導率隨重金屬含量上升而顯著上升。筆者試驗結果表明，隨著鎘、鉛、鋅復合污染程度加重，馬纓丹根系和葉片相對電導率不斷上升，但直到T3處理才與CK表現(xiàn)出顯著差異，表明馬纓丹對低含量重金屬脅迫有一定耐受能力，但隨著污染程度加重，馬纓丹細胞膜損害程度加深。T7處理馬纓丹根系和葉片相對電導率均達到最大，且根系相對電導率上升幅度(2.08倍)大于葉片(1.45倍)，表明在高含量鎘、鉛、鋅復合脅迫下，馬纓丹葉片損害程度小于根系。這可能是馬纓丹地上部受重金屬毒害作用低于根系的原因。

重金屬在植物體內(nèi)各器官中的積累和分布與其耐性密切相關。研究[31-32]發(fā)現(xiàn)，在復合污染條件下，鉛、鋅可抑制川芎和天藍遏藍菜對鎘的吸收，提高植物耐性。對比前期研究，鎘、鉛、鋅單一污染條件下，馬纓丹各部位中重金屬含量隨污染含量升高而升高[22-23,33]；而筆者研究中，隨著鎘、鉛、鋅復合含量增加，馬纓丹各部位中鉛、鋅含量逐漸增加，鎘含量則表現(xiàn)出先增加后降低的趨勢。這可能是由于鎘、鉛、鋅均為二價陽離子，較多的鉛、鋅離子會占據(jù)根系表面的吸附位點[34]，使得在復合污染條件下，馬纓丹根系對鎘的吸收減少，減輕了鎘對馬纓丹的毒害，增強了馬纓丹對復合污染的耐性。在不同含量鎘、鉛、鋅單一污染條件下，馬纓丹根系中鎘含量始終高于地上部；在低鉛含量條件下較地上部更高，在高鉛含量條件下較地上部更低；鋅含量則相反[22-23,33]。筆者試驗中，在復合污染條件下，馬纓丹根系鉛含量低于地上部，而鎘、鋅含量均高于地上部，表明在重金屬脅迫下，馬纓丹可將大部分鎘、鋅固定在根系中，減輕其對地上部的傷害，增強自身耐性。對比馬纓丹在單一和復合污染條件下各部位重金屬分布情況，發(fā)現(xiàn)復合污染時鎘含量與單一污染時相同，復合污染時鉛、鋅含量則與單一污染時不同，復合污染條件下，馬纓丹地上部鉛含量均高于根系，鋅含量均低于根系，表明復合污染對鉛在馬纓丹體內(nèi)的轉(zhuǎn)運有一定促進作用；對鋅則有一定抑制作用。簡敏菲等[35]發(fā)現(xiàn)，鎘、鉛復合處理時，鎘可促進丁香蓼體內(nèi)鉛的轉(zhuǎn)運；而在鎘、鋅復合污染條件下，鎘會抑制柔毛委陵菜(Potentillagriffithii)體內(nèi)鋅向地上部轉(zhuǎn)移[36]。這是因為一方面，植物根系中核酸、蛋白質(zhì)和多糖可與重金屬結合形成大分子物質(zhì)或不易溶解的有機分子沉積，將其固定在根部，提高自身耐性。但馬纓丹根系對重金屬的固持能力有限，在復合污染條件下，Cd2+、Zn2+與Pb2+間相互競爭，搶占結合位點，從而促進鉛向地上部轉(zhuǎn)運；另一方面，重金屬離子向地上部的運輸通過某些載體完成，不同金屬離子可能是由相同的轉(zhuǎn)運蛋白介導，因此，在鎘、鉛、鋅復合污染條件下，Cd2+、Zn2+可能會搶奪同一運輸載體，從而抑制鋅向地上部的轉(zhuǎn)運[37]。由此可見，重金屬離子由根系轉(zhuǎn)運至地上部時，相互之間的作用是復雜的，具體作用機制還有待進一步探究。

區(qū)隔化作用是植物在重金屬脅迫下重要的內(nèi)部耐受機制之一。植物細胞壁上含有大量果膠酸、多糖和蛋白質(zhì)等物質(zhì)，可與重金屬離子結合，將其固定在細胞壁中，限制重金屬在細胞內(nèi)的跨膜運輸，維持細胞的正常生理代謝過程。然而，細胞壁并不能完全阻隔重金屬，部分重金屬離子仍可進入原生質(zhì)體。已進入原生質(zhì)體的金屬離子大多會被運送到液泡中，與富硫肽和有機酸等物質(zhì)結合，貯存于液泡中，減少對細胞器造成的傷害[11-12]。朱光旭等[38]發(fā)現(xiàn)，野艾蒿、勝紅薊和野茼蒿3種菊科植物根、莖、葉中鎘、鉛、鋅主要分布于細胞壁和可溶性組分中，在細胞器中分布較少。筆者研究中，鎘、鉛主要儲存于可溶性組分(45.2%～62.5%和44.2%～66.7%)中，細胞壁(29.7%～44.0%和25.2%～44.1%)次之，這表明細胞壁對鎘、鉛的固持能力有限，進入植物體內(nèi)的鎘、鉛主要被轉(zhuǎn)運至液泡中以緩解毒害；鋅在馬纓丹細胞壁(39.8%～50.4%)和可溶性組分(39.2%～52.4%)中占比較高，且相差不大，表明相較于鎘、鉛，馬纓丹細胞壁對鋅的固持作用更強，細胞壁固持和液泡區(qū)隔化作用均是馬纓丹降低鋅毒害的重要機制。細胞器作為植物細胞內(nèi)代謝最活躍的部位，其重金屬含量越多，植物受到的損害越大[15]。筆者試驗發(fā)現(xiàn)，在復合污染條件下，只有極少數(shù)鎘、鉛、鋅分布于細胞器中，分別僅占總量的7.1%～12.2%、6.0%～13.1%和4.8%～11.6%，這與馬纓丹在鎘、鉛、鋅單一污染條件下的研究結果[22-23,33]一致，表明在單一或復合污染條件下，區(qū)隔化作用都是增強馬纓丹耐性、維持其正常生長的重要途徑。馬纓丹根系及其細胞器中重金屬總含量大于地上部，這可能是馬纓丹根系在鎘、鉛、鋅復合脅迫下受抑制程度高于地上部的重要原因。

重金屬在植物體內(nèi)的毒性和遷移能力與其存在形態(tài)密切相關。乙醇提取態(tài)(主要提取無機鹽和氨基酸鹽)和水提取態(tài)(主要提取有機酸鹽和水溶性磷酸鹽)重金屬具有較強遷移能力和較高毒性，氯化鈉提取態(tài)(主要提取蛋白質(zhì)和果膠酸鹽)和醋酸提取態(tài)(主要提取難溶性磷酸鹽)次之，鹽酸提取態(tài)(主要提取草酸鹽)和殘渣態(tài)的遷移能力和毒性最弱[16-17]。筆者研究發(fā)現(xiàn)，鎘、鉛、鋅在馬纓丹各器官中主要以氯化鈉提取態(tài)和醋酸提取態(tài)形式存在，這與XIN等[39]對荻的研究結果相似，表明重金屬在馬纓丹體內(nèi)主要與蛋白質(zhì)、果膠酸鹽和難溶性磷酸鹽結合，形成毒性較低的復合物以提高自身耐性。隨著重金屬處理含量增加，馬纓丹莖、葉中醋酸提取態(tài)鎘，醋酸提取態(tài)、鹽酸提取態(tài)和殘渣態(tài)鉛、鋅占比增加，表明馬纓丹地上部可通過將重金屬轉(zhuǎn)變?yōu)槎拘暂^低的形態(tài)以減輕鎘、鉛、鋅的毒害。同時，馬纓丹莖、葉中乙醇提取態(tài)和水提取態(tài)鋅較同形態(tài)鎘、鉛占比更高，這可能是由于鋅是植物生長的必需營養(yǎng)元素之一，在植物體內(nèi)遷移能力較強，能被轉(zhuǎn)移至生理代謝所需部位，滿足植物生長發(fā)育需要。

4 結論

(1)馬纓丹對鎘、鉛、鋅復合污染具有較好耐性，能夠忍耐w(Cd)、w(Pb)和w(Zn)分別為40、600和800 mg·kg-1的復合污染，可用于鋅礦區(qū)植被恢復和重金屬污染土壤治理。

(2)鎘、鉛、鋅復合脅迫下，馬纓丹可將大部分重金屬，尤其是鎘、鋅滯留在根系中，限制其向地上部轉(zhuǎn)運以提高自身耐性；同時，馬纓丹根系中重金屬總量高于地上部，這是地上部受毒害程度低于根系的重要原因。

(3)細胞壁固持和液泡區(qū)隔化作用是馬纓丹增強自身耐性的重要途徑，且相較于鋅而言，馬纓丹對鎘、鉛的耐性主要依賴于液泡區(qū)隔化作用。同時，通過螯合作用將鎘、鉛、鋅轉(zhuǎn)變?yōu)槎拘暂^低的氯化鈉提取態(tài)和醋酸提取態(tài)也是馬纓丹重要的耐性和解毒機制之一。