血府逐瘀湯聯(lián)合替莫唑胺對(duì)腦膠質(zhì)瘤大鼠ERK/MAPK信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用

陳燕偉 馬善波 張蕊

(空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院1.神經(jīng)外科；2.藥劑科;3.耳鼻喉科，陜西 西安 710032)

腦膠質(zhì)瘤是臨床常見(jiàn)的原發(fā)性顱腦惡性腫瘤之一，發(fā)病率約占顱內(nèi)腫瘤的35.2%～61.0%[1]。由于腦膠質(zhì)瘤的發(fā)病機(jī)制尚不明確，在臨床治療中有發(fā)病率及死亡率高，治愈率低等特點(diǎn)[2]。替莫唑胺為常用的治療腦膠質(zhì)瘤的藥物之一，其在臨床應(yīng)用中存在有效率低、不良反應(yīng)大等缺點(diǎn)[3]，所以對(duì)于腦膠質(zhì)瘤治療藥物的研發(fā)成為目前的臨床工作重點(diǎn)之一。血府逐瘀湯是以中醫(yī)學(xué)理論為指導(dǎo)的具有活血化瘀等作用的中藥湯劑，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)其在腦膠質(zhì)瘤的臨床治療中有顯著效果[4-5]。ERK/MAPK信號(hào)通路是與細(xì)胞增殖分化功能相關(guān)的重要信號(hào)通路之一，研究報(bào)道[6-7]其在體內(nèi)的表達(dá)水平與腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后等密切相關(guān)。本文探討血府逐瘀湯聯(lián)合替莫唑胺對(duì)腦膠質(zhì)瘤大鼠的作用及機(jī)制，旨在為腦膠質(zhì)瘤的治療及血府逐瘀湯的藥理研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)Wistar大鼠60只，雄性，8月齡，體重200～240g，購(gòu)自山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[許可證號(hào)：SCXK(魯) 2019 0001]，在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房飼養(yǎng)，溫度20～25℃，濕度40%～60%，自由進(jìn)食水；C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞(中科院上海細(xì)胞庫(kù))。

1.2 主要試劑 血府逐瘀湯(由桃仁12g，紅花、當(dāng)歸、生地黃、牛膝各9g，川芎、桔梗各4.5g，赤芍、枳殼、甘草各6g，柴胡3g組成)由藥材飲片制成生藥含量為5g/mL的湯劑，購(gòu)自北京同仁堂藥業(yè)公司(批號(hào)201908151)；替莫唑胺(江蘇天士力帝益藥業(yè)有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)：H20040637，規(guī)格：50mg)；ERK、p38MAPK兔單克隆抗體、超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IGg、生物素標(biāo)記山羊抗兔IGg、大鼠TGF-β1檢測(cè)試劑盒(碧云天生物公司，貨號(hào)AF1051、AF7668、P0018M、A0208、A0277、PT878)；總RNA提取試劑盒、一步法逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒、大鼠IL-2檢測(cè)試劑盒、大鼠IL-10檢測(cè)試劑盒、HE染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào)R1200、T2240、SR1110、SEKR-0003、SEKR-0006、G1120)；F-12K培養(yǎng)基(上海雅吉生物科技有限公司，貨號(hào)P007)；小鼠抗大鼠CD4+CD25+-FITC單克隆抗體(英國(guó)AbD Serotec公司，貨號(hào)DC040)；CD8+T細(xì)胞(艾美捷科技有限公司，貨號(hào)MAB4598)。PCR引物設(shè)計(jì)及合成由賽默飛世爾科技公司完成。

1.3 設(shè)備及儀器 DM2500光學(xué)/熒光顯微鏡(德國(guó)徠卡公司)；HM355S 全自動(dòng)切片機(jī)、E-Gel Imager凝膠成像儀(賽默飛世爾科技公司)；3-18KS臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Sigma公司)CytoFLEX S 流式細(xì)胞儀(貝克曼庫(kù)爾特商貿(mào)有限公司)。

1.4 方法

1.4.1 造模及分組 60只大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、腦膠質(zhì)瘤組、血府逐瘀湯組、替莫唑胺組及聯(lián)合給藥組，每組各12只，除空白對(duì)照組外，其余大鼠按照參考文獻(xiàn)方法[8]進(jìn)行造模，C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞復(fù)蘇傳代，并保證細(xì)胞活力在90%以上。大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉后，頭、背部表面消毒后沿中線切開(kāi)，暴露顱骨，在前冠狀縫與矢狀縫交點(diǎn)前1.0mm、右3.0mm 處鉆一小孔，直徑為1.0mm。沿鉆孔垂直進(jìn)針，每只大鼠緩慢注射25μL的C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞，10min后退針，骨蠟封閉骨孔，縫合皮膚并切口消毒，并在手術(shù)后對(duì)動(dòng)物觀察一小時(shí)，常規(guī)飼養(yǎng)，10d后以大鼠出現(xiàn)自主活動(dòng)障礙，顱內(nèi)壓升高，磁共振成像可見(jiàn)類圓形腫塊及環(huán)狀強(qiáng)化長(zhǎng) T1低信號(hào)、長(zhǎng)T2高信號(hào)視為造模成功[8]。血府逐瘀湯組按照20g/kg灌胃給予血府逐瘀湯[9]，替莫唑胺組給予替莫唑胺(25mg/kg)[10]，聯(lián)合給藥組同時(shí)給予血府逐瘀湯及替莫唑胺，空白對(duì)照組及腦膠質(zhì)瘤組給予蒸餾水，1次/d，連續(xù)5w[10]。對(duì)大鼠的處理符合動(dòng)物倫理要求，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)同意批準(zhǔn)。

1.4.2 大鼠外周血CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞測(cè)定 大鼠取血后置于肝素潤(rùn)洗過(guò)的離心管中，參照文獻(xiàn)方法[11]測(cè)定大鼠外周血CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞百分比。

1.4.3 大鼠瘤重占腦重比及抑瘤率測(cè)定 每組取6只大鼠，末次給藥后處死，取腫瘤組織并稱重，計(jì)算瘤重占腦重比及抑瘤率。瘤重占腦重比=(瘤重)/腦重×100%，抑瘤率=(腦膠質(zhì)瘤組瘤重占腦重比-給藥組瘤重占腦重比)/腦膠質(zhì)瘤組瘤重占腦重比。

1.4.4 大鼠腫瘤組織IL-2、IL-10、TGF-β1水平測(cè)定 取大鼠腫瘤組織(空白對(duì)照組取正常腦組織)，研磨勻漿取上清液，按照試劑盒方法測(cè)定大鼠腫瘤組織IL-2、IL-10、TGF-β1水平。

1.4.5 大鼠腦組織病理學(xué)檢查 每組取6只大鼠腦組織，在中性甲醛中固定后進(jìn)行4μm石蠟切片，經(jīng)常規(guī)HE染色后光鏡下觀察。

1.4.6 腦膠質(zhì)瘤組織ERK、p38MAPKmRNA水平測(cè)定 取大鼠腦膠質(zhì)瘤組織，空白對(duì)照組取正常腦組織，提取總RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以GAPDH作為內(nèi)參，使用試劑盒進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)，結(jié)果以2-ΔΔCT法計(jì)算基因表達(dá)量。引物序列為：GAPDH: 正向引物5′-AACAAGAATGGTGGGCAGTC-3′，反向引物5′-AACTCCTCGTCCGTCTGTC-3′；ERK:正向引物5′-TTGAGACCCTGGTGGACATC-3′，反向引物5′-CTACCAAAGTTCCCCCTCTC-3′；P38MAPK:正向引物5′-GATTTTTCACGACACCCTTCACC-3′，反向引物5′-GGTCCTCTGGTCAAACTCTTGGAG-3′。

1.4.7 Western blot檢查腦膠質(zhì)瘤組織ERK、p38MAPK蛋白水平 取腫瘤組織(空白對(duì)照組取正常腦組織)，裂解并勻漿后，以8000rpm離心10min，收集上清液，水浴煮沸變性后測(cè)定蛋白濃度，取50μg蛋白電泳分離，用ERK、p38MAPK、GAPDH兔單克隆抗體(1∶500稀釋)及二抗(1∶1000稀釋)孵育后，滴加顯影劑，凝膠成像后使用ImageJ進(jìn)行定量分析。

1.4.8 免疫組化檢查腦膠質(zhì)瘤組織ERK、p38MAPK表達(dá)水平 取大鼠腦膠質(zhì)瘤組織(空白對(duì)照組取正常腦組織)5μm石蠟切片，脫蠟、復(fù)水后進(jìn)行抗原修復(fù)，切片經(jīng)ERK、p38MAPK兔單克隆抗體(1:200稀釋)在 4℃條件下孵育過(guò)夜，洗滌后，切片經(jīng)山羊抗兔二抗室溫孵育2h，二氨基聯(lián)苯胺顯影，顯微鏡下拍照并使用Image-Pro Plus 6.0測(cè)定免疫組化積分光密度。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠外周血CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞水平比較 與空白對(duì)照組比較，腦膠質(zhì)瘤組大鼠外周血CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)升高(P<0.05)，CD8+T細(xì)胞數(shù)降低(P<0.05)；與腦膠質(zhì)瘤組大鼠比較，血府逐瘀湯組、替莫唑胺組及聯(lián)合給藥組外周血CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)降低(P<0.05)，CD8+T細(xì)胞數(shù)升高(P<0.05)；與血府逐瘀湯組及替莫唑胺組比較，聯(lián)合給藥組大鼠外周血CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)降低(P<0.05)，CD8+T細(xì)胞數(shù)升高(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠外周血CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞水平

2.2 各組大鼠瘤重占腦重比及抑瘤率比較 與腦膠質(zhì)瘤組大鼠比較，血府逐瘀湯組、替莫唑胺組及聯(lián)合給藥組大鼠瘤重占腦重比顯著降低(P<0.05)，與血府逐瘀湯組及替莫唑胺組比較，聯(lián)合給藥組大鼠瘤重占腦重比顯著降低(P<0.05)；抑瘤率計(jì)算結(jié)果表明，與血府逐瘀湯組及替莫唑胺組比較，聯(lián)合給藥組抑瘤率顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠瘤重占腦重比及抑瘤率比較

2.3 各組大鼠腫瘤組織IL-2、IL-10、TGF-β1水平比較 與空白對(duì)照組比較，腦膠質(zhì)瘤組腫瘤組織IL-2水平降低(P<0.05)，IL-10、TGF-β1水平升高(P<0.05)；與腦膠質(zhì)瘤組大鼠比較，血府逐瘀湯組、替莫唑胺組及聯(lián)合給藥組腫瘤組織IL-2水平升高(P<0.05)，IL-10、TGF-β1水平降低(P<0.05)；與血府逐瘀湯組及替莫唑胺組比較，聯(lián)合給藥組腫瘤組織IL-2水平升高(P<0.05)，IL-10、TGF-β1水平降低(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠腫瘤組織IL-2、IL-10、TGF-β1水平比較

2.4 各組大鼠腫瘤組織病理變化的影響 空白對(duì)照組大鼠腦組織未見(jiàn)明顯病理學(xué)變化，與空白對(duì)照組比較，腦膠質(zhì)瘤組大鼠腦組織可見(jiàn)明顯腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)，細(xì)胞排列不整齊，邊界不清晰；與腦膠質(zhì)瘤組大鼠比較，血府逐瘀湯組、替莫唑胺組及聯(lián)合給藥組大鼠腦組織腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減輕。見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠腫瘤組織病理學(xué)變化(HE200×)

2.5 各組大鼠腫瘤組織ERK及p38MAPK mRNA水平的影響 與空白對(duì)照組比較，腦膠質(zhì)瘤組腫瘤組織ERK及p38MAPK mRNA水平升高(P<0.05)；與腦膠質(zhì)瘤組大鼠比較，血府逐瘀湯組、替莫唑胺組及聯(lián)合給藥組腦膠質(zhì)瘤組腫瘤組織ERK及p38MAPK mRNA水平降低(P<0.05)；與血府逐瘀湯組及替莫唑胺組比較，聯(lián)合給藥組腫瘤組織ERK及p38MAPK mRNA水平降低(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 各組大鼠腫瘤組織ERK及p38MAPK mRNA水平比較

2.6 各組大鼠腫瘤組織ERK及p38MAPK蛋白水平的比較 與空白對(duì)照組比較，腦膠質(zhì)瘤組腫瘤組織ERK及p38MAPK 蛋白水平升高(P<0.05)；與腦膠質(zhì)瘤組大鼠比較，血府逐瘀湯組、替莫唑胺組及聯(lián)合給藥組腫瘤組織ERK及p38MAPK蛋白水平降低(P<0.05)；與血府逐瘀湯組及替莫唑胺組比較，聯(lián)合給藥組腫瘤組織ERK及p38MAPK蛋白水平降低(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

圖2 大鼠腫瘤組織ERK及p38MAPK蛋白水平

2.7 各組大鼠腫瘤組織ERK及p38MAPK免疫組化水平比較 與空白對(duì)照組比較，腦膠質(zhì)瘤組腫瘤組織ERK及p38MAPK 免疫組化IOD水平升高(P<0.05)；與腦膠質(zhì)瘤組大鼠比較，血府逐瘀湯組、替莫唑胺組及聯(lián)合給藥組腫瘤組織ERK及p38MAPK免疫組化IOD水平降低(P<0.05)；與血府逐瘀湯組及替莫唑胺組比較，聯(lián)合給藥組腫瘤組織ERK及p38MAPK免疫組化IOD水平降低(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

圖3 大鼠腫瘤組織ERK及p38MAPK免疫組化水平

3 討論

腦膠質(zhì)瘤是由于腦神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞在高電離輻射、遺傳因素、病毒感染等多種因素影響下發(fā)生基因突變而引起的腫瘤疾病，其5年病死率在全身腫瘤疾病中位居第三位[12]。目前臨床上對(duì)于腦膠質(zhì)瘤的治療存在復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)高、不良反應(yīng)大、患者生存質(zhì)量低等多種缺點(diǎn)，所以對(duì)于治療腦膠質(zhì)瘤的藥物開(kāi)發(fā)仍是臨床的迫切需求。

血府逐瘀湯是基于中醫(yī)學(xué)理論形成的具有活血化瘀療效的中藥成方制劑，其出自中醫(yī)學(xué)著作《醫(yī)林改錯(cuò)》，中醫(yī)常用其治療各種血瘀證，在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中常用于治療腦震蕩后遺癥、腦血栓等多種心腦血管疾病[13-14]。近年來(lái)臨床研究發(fā)現(xiàn)，血府逐瘀湯對(duì)于腦膠質(zhì)瘤具有顯著的治療作用，其中呂廣梅[4]、門艷芳等[5]先后報(bào)道了血府逐瘀湯治療腦膠質(zhì)瘤取得顯著成效的臨床案例，并指出血府逐瘀湯能夠抑制中晚期膠質(zhì)瘤患者腫瘤進(jìn)展，提高化療療效并減少化療相關(guān)性不良反應(yīng)。

外周血CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞是機(jī)體內(nèi)的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，其發(fā)揮免疫抑制作用進(jìn)而誘導(dǎo)腫瘤疾病的發(fā)生發(fā)展[15]，而CD8+T細(xì)胞作為特異性T細(xì)胞能夠分泌細(xì)胞因子，進(jìn)而促進(jìn)T淋巴細(xì)胞對(duì)病毒、腫瘤細(xì)胞等的殺傷作用[16]。IL-2主要由活化的T細(xì)胞產(chǎn)生，起到免疫促進(jìn)作用，誘導(dǎo)自然殺傷細(xì)胞增殖，促進(jìn)B細(xì)胞增殖及抗體的產(chǎn)生，進(jìn)而發(fā)揮對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用[17]；腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞能夠分泌TGF-β1，促進(jìn)神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞分化并分泌IL-10、TGF-β1等因子，起到免疫抑制作用，并進(jìn)一步促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的增殖。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與腦膠質(zhì)瘤組大鼠比較，血府逐瘀湯組、替莫唑胺組及聯(lián)合給藥組外周血CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)、腫瘤組織IL-10、TGF-β1水平降低，CD8+T細(xì)胞數(shù)、IL-2水平升高，且聯(lián)合給藥組變化更明顯，這表明血府逐瘀湯聯(lián)合替莫唑胺能夠通過(guò)調(diào)節(jié)自身免疫功能，激活體內(nèi)免疫過(guò)程，增強(qiáng)體內(nèi)淋巴細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，進(jìn)而發(fā)揮對(duì)腫瘤進(jìn)展的抑制作用。

ERK/MAPK信號(hào)通路在細(xì)胞因子、神經(jīng)遞質(zhì)等刺激因素作用下被激活，進(jìn)而細(xì)胞分化、細(xì)胞增殖、凋亡和自噬、運(yùn)動(dòng)性、學(xué)習(xí)記憶和新陳代謝等細(xì)胞生命活動(dòng)[18]。在腫瘤疾病的發(fā)生發(fā)展中，ERK/MAPK信號(hào)通路接受生長(zhǎng)因子、環(huán)境刺激等信號(hào)，通過(guò)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)作用于NF-кB等核轉(zhuǎn)錄因子，誘導(dǎo)腫瘤進(jìn)展，在乳腺癌、膠質(zhì)細(xì)胞瘤等腫瘤組織中都可發(fā)現(xiàn)ERK/MAPK的過(guò)度激活[19-20]。金戈等[21]研究發(fā)現(xiàn)ERK通路異常激活會(huì)增強(qiáng)腦膠質(zhì)瘤 U251 細(xì)胞增殖能力，而抑制ERK通路及相關(guān)蛋白則能夠顯著抑制U251 細(xì)胞增殖；張靜等[21]通過(guò)對(duì)人腦膠質(zhì)瘤組織樣本的臨床研究發(fā)現(xiàn)，在腦膠質(zhì)瘤組織中MAPK通路相關(guān)蛋白過(guò)度激活，并指出MAPK通路的異常激活在腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用；由此可見(jiàn)調(diào)節(jié)ERK/MAPK通路可能是腦膠質(zhì)瘤治療的新的方向。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與腦膠質(zhì)瘤組大鼠比較，血府逐瘀湯組、替莫唑胺組及聯(lián)合給藥組大鼠腫瘤組織ERK、p38MAPK mRNA水平及蛋白水平、免疫組化表達(dá)水平均降低，且血府逐瘀湯聯(lián)合替莫唑胺組對(duì)ERK、p38MAPK表達(dá)的抑制作用更明顯，提示血府逐瘀湯聯(lián)合替莫唑胺對(duì)腦膠質(zhì)瘤的抑制作用可能是通過(guò)抑制ERK/MAPK通路實(shí)現(xiàn)的。由于時(shí)間及實(shí)驗(yàn)條件的限制，本實(shí)驗(yàn)尚未能研究血府逐瘀湯聯(lián)合替莫唑胺對(duì)腦膠質(zhì)瘤大鼠ERK/MAPK通路上下游其他相關(guān)蛋白的調(diào)節(jié)作用及對(duì)ERK、p38MAPK的靶向調(diào)節(jié)作用，擬在今后的研究中對(duì)上述問(wèn)題做進(jìn)一步討論，并就血府逐瘀湯聯(lián)合替莫唑胺對(duì)ERK/MAPK通路相關(guān)蛋白的反饋性調(diào)節(jié)作用進(jìn)行闡述。

4 結(jié)論

血府逐瘀湯聯(lián)合替莫唑胺能夠抑制腦膠質(zhì)瘤大鼠腫瘤進(jìn)展，調(diào)節(jié)大鼠免疫功能，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)ERK/MAPK信號(hào)通路有關(guān)。