王不留行對(duì)脂多糖和H2 O2誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞炎性反應(yīng)和氧化反應(yīng)的影響

袁德俊，吳康郁，黃曉冰

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510378）

王不留行為石竹科植物麥藍(lán)菜Vaccaria segetalis（Neck.）Garcke 的干燥成熟種子，別名奶米、王不留、麥藍(lán)子、剪金子、留行子，是我國(guó)傳統(tǒng)常用中藥，性味苦，平，歸肝、胃經(jīng)。具有活血通經(jīng)，下乳消腫，利尿通淋功能，用于乳汁不下、經(jīng)閉、痛經(jīng)、乳癰腫痛等癥［1］?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明王不留行具有廣泛的藥理學(xué)作用，包括抗腫瘤、抗炎鎮(zhèn)痛、抗氧化、抑制血管生成等藥理作用［2］。

目前王不留行抗炎活性研究較少。因此開展中藥王不留行相關(guān)藥效活性研究，有助于王不留行的發(fā)展與利用。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激RAW264.7 巨噬細(xì)胞是經(jīng)典體外炎癥模型，常用于研究藥物抗炎活性；過(guò)氧化氫（H2O2）可以造成細(xì)胞氧化損傷。本實(shí)驗(yàn)將以LPS 刺激RAW264.7 巨噬細(xì)胞作為研究載體，通過(guò)測(cè)定相關(guān)炎性因子，探討王不留行抗炎藥效活性；以H2O2造成RAW264.7 巨噬細(xì)胞氧化損傷，探討王不留行抗氧化活性。本實(shí)驗(yàn)將為王不留行抗炎抗氧化作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 藥物和試劑 RPMI?1640 培養(yǎng)基（批號(hào)＃8113920）、胎牛血清（批號(hào)＃42A0378K）、青霉素（批號(hào)＃J160035）均購(gòu)買于美國(guó) Gibco 公司；脂多糖（LPS，批號(hào)＃019M4009V）、二甲基亞砜（DMSO，貨號(hào)D2650）為美國(guó)Sigma 公司；MTT（貨號(hào)G4000，美國(guó)Progema 公司）；PBS（貨號(hào)ST447）、一氧化氮（NO，貨號(hào)S0021S）檢測(cè)試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；小鼠TNF?α（貨號(hào)ml002095）、IL?1β（貨號(hào) ml063132）、IL?6（貨號(hào)ml002293）、PGE2（貨號(hào) ml037542）、COX?2（貨號(hào)ml057994）ELISA 試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司）；SOD（貨號(hào)A001?3?2）、CAT（貨號(hào)A007?1?1）、GSH?PX（貨號(hào)A005?1?2）、MDA（貨號(hào)A003?4?1）試劑盒（南京建成生物工程研究所有限公司）。王不留行來(lái)源于嶺南中藥飲片有限公司，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院吳康郁副主任中藥師鑒定為石竹科植物麥藍(lán)菜Vaccaria segetalis（Neck.）Garcke 的干燥成熟種子。

1.2 細(xì)胞 RAW 264.7 小鼠單核巨噬細(xì)胞，購(gòu)自American Type Culture Collection（ATCC，USA）細(xì)胞資源中心。

1.3 儀器 SW?CJ?1FD 型超凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；DYS?810 型顯微鏡（上海點(diǎn)應(yīng)光學(xué)儀器有限公司）；HH4Y 型恒溫水浴鍋（上海啟前電子科技有限公司）；Neofuge 15R 型高速冷凍離心機(jī)（力康生物醫(yī)療科技控股有限公司）；DOI?50 型恒溫培養(yǎng)箱（上海三騰儀器有限公司）；LDZX?40BI 型立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）；酶標(biāo)儀和PCR 擴(kuò)增儀（美國(guó)Thermo Scientific 公司）。

2 方法

2.1 王不留行醇提物制備 取藥材王不留行于高速中藥粉碎機(jī)中打成藥材粉末，過(guò)3 號(hào)篩（60 目篩），按1 ∶10 料液比用石油醚回流脫脂2 h，加熱蒸發(fā)至沒(méi)有石油醚味，按料液比1 ∶10 加入80%乙醇，回流提取3 次，每次2 h，將所得濾液合并，減壓濃縮至沒(méi)有醇味，冷凍干燥，即得［3］。

2.2 RPMI?1640 完全培養(yǎng)基配制 RPMI?1640 培養(yǎng)基中添加10%滅活FBS 和1%青霉素，即得。

2.3 LPS 溶液配制 稱取5 mg LPS 至量瓶中，加入PBS定容至10 mL，制成500 mg／L LPS 溶液，－20 ℃避光保存。取適量LPS 溶液，RPMI?1640 完全培養(yǎng)基稀釋至500 ng／mL后，0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾，即得。

2.4 王不留行醇提物配制 稱取100 mg 王不留行醇提物溶于1.0 mL DMSO，制得100 mg／mL 母液，0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾，分別用RPMI?1640 完全培養(yǎng)基制成孔內(nèi)終質(zhì)量濃度為80、40、20、10 μg／mL，即得。

2.5 MTT 法測(cè)定王不留行醇提物對(duì)RAW264.7 巨噬細(xì)胞細(xì)胞活力的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7 巨噬細(xì)胞，按照4.0×104／孔的細(xì)胞濃度接種在96 孔板中，之后放置在5% CO2、37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。第2 天棄去原培養(yǎng)基，進(jìn)行分組處理，正常組加入含0.1% DMSO 的完全培養(yǎng)基，不同濃度給藥組分別加入80、40、20、10 μg／mL含完全培養(yǎng)基藥液培養(yǎng)24 h，每組6 個(gè)復(fù)孔。次日，每孔加入20 μL MTT 溶液，置于恒溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸棄培養(yǎng)液，并加入150 μL／孔DMSO 溶解，水平振蕩器搖動(dòng)10 min后收集DMSO 溶液，測(cè)定490 nm 波長(zhǎng)下的OD。

2.6 MTT 法測(cè)定H2O2對(duì)RAW264.7 巨噬細(xì)胞的細(xì)胞活力影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7 巨噬細(xì)胞，按照4.0×104／孔的細(xì)胞濃度接種在96 孔板中，之后放置在5% CO2、37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。第2 天棄去原培養(yǎng)基，進(jìn)行分組處理，正常組加入含0.1% DMSO 的完全培養(yǎng)基，其余各組分別加入不同濃度的H2O2溶液，每組6 個(gè)復(fù)孔。次日，每孔加入20 μL 的MTT 溶液，置于恒溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h。4 h 后吸棄培養(yǎng)液，并加入150 μL／孔的DMSO 溶解，水平振蕩器搖動(dòng)10 min 后收集DMSO 溶液，測(cè)定490 nm 波長(zhǎng)下的吸光度［4］。

2.7 Griess 法測(cè)定王不留行醇提物對(duì)RAW264.7 的NO 水平影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7 巨噬細(xì)胞，按照4.0×104／孔的細(xì)胞濃度接種在96 孔板中，5% CO2、37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后棄去原培養(yǎng)基，進(jìn)行分組處理，正常組和模型組加入含0.1% DMSO 的完全培養(yǎng)基，不同濃度給藥組分別加入40、20、10 μg／mL 含完全培養(yǎng)基藥液培養(yǎng)2 h，每組6 個(gè)復(fù)孔，2 h 后除了正常組，其余均加入500 ng／mL LPS 造模并繼續(xù)培養(yǎng)24 h。次日，收集各孔培養(yǎng)基100 μL，并依照一氧化氮檢測(cè)試劑盒說(shuō)明，測(cè)定540 nm波長(zhǎng)下OD，計(jì)算各組NO 水平。

2.8 王不留 行醇提物對(duì)TNF?α、IL?1β、IL?6 和iNOS mRNA 表達(dá)影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7 巨噬細(xì)胞，按照4.0×104／孔的細(xì)胞濃度接種在96 孔板中，5% CO2、37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后棄去原培養(yǎng)基，進(jìn)行分組處理，正常組和模型組加入含0.1% DMSO 的完全培養(yǎng)基，不同濃度給藥組分別加入40、20、10 μg／mL 含完全培養(yǎng)基藥液培養(yǎng)2 h，除了正常組其余各組均加入500 ng／mL LPS造模并繼續(xù)培養(yǎng)24 h。按照Total RNA 提取試劑盒，反轉(zhuǎn)錄試劑盒以及熒光定量PCR 試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，測(cè)定各樣品的TNF?α、IL?1β、IL?6、iNOSmRNA 表達(dá)。RT?PCR擴(kuò)增反應(yīng)采用CFX 96TM Real?Time PCR Detection System 擴(kuò)增儀對(duì)cDNA 進(jìn)行擴(kuò)增，條件為95 ℃、10 min；95 ℃、15 s，40 個(gè)循環(huán)；60 ℃、60 s，40 個(gè)循環(huán)，引物序列如表1 所示。以β?actin為內(nèi)參基因，計(jì)算相對(duì)表達(dá)量2－ΔΔCt：ΔCt（對(duì)照組）＝Ct（對(duì)照組目的基因）－Ct（對(duì)照組β?actin），ΔCt（正常組）＝Ct（正常組目的基因）－Ct（正常組β?actin），ΔΔCt＝ΔCt（對(duì)照組）－ΔCt（正常組），相對(duì)表達(dá)量＝2－ΔΔCt。

表1 目標(biāo)基因引物序列

2.9 王不留 行醇提物對(duì)TNF?α、IL?1β、IL?6、PGE2、COX?2 表達(dá)影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7 巨噬細(xì)胞，按4.0×104／孔接種在96 孔板中，5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后棄去原培養(yǎng)基，進(jìn)行分組處理，正常組和模型組加入含0.1%DMSO 的完全培養(yǎng)基，不同濃度給藥組分別加入40、20、10 μg／mL 含完全培養(yǎng)基藥液培養(yǎng)2 h，每組6 個(gè)復(fù)孔，2 h 后除了正常組，其余各組均加入500 ng／mL LPS 培養(yǎng)24 h。次日，收集各孔培養(yǎng)基，依照ELISA 試劑盒說(shuō)明測(cè)定TNF?α、IL?1β、IL?6、PGE2、COX?2 水平。

2.10 王不留行醇提物對(duì)CAT、SOD、GSH?PX、MDA 水平的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7 巨噬細(xì)胞，按4.0×104／孔接種在96 孔板中，5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后棄去原培養(yǎng)基，進(jìn)行分組處理，正常組和模型組加入含0.1% DMSO 的完全培養(yǎng)基，不同濃度給藥組分別加入40、20、10 μg／mL 含完全培養(yǎng)基藥液培養(yǎng)24 h，每組6 個(gè)復(fù)孔，24 h 后除了正常組，其余各組均加入600 μmol／L H2O2培養(yǎng)4 h。4 h 后收集各孔培養(yǎng)基，依照試劑盒說(shuō)明測(cè)定CAT、SOD、GSH?PX、MDA 水平。

2.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 分別采用Graphpad Prism 6、SPSS 23.0軟件進(jìn)行制圖、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以（）表示。多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較滿足方差齊性則用LSD 分析，不滿足方差齊性則用Dunnett T3 分析。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 王不留行醇提物對(duì)RAW264.7 巨噬細(xì)胞的細(xì)胞活力影響 如圖1 所示，10、20、40 μg／mL 王不留行醇提物對(duì)RAW264.7 細(xì)胞的細(xì)胞活力具有較好的維持作用，分別達(dá)到95.73%、96.89%、92.77%；80 μg／mL 王不留行醇提物給藥組細(xì)胞活力為89.14%，但相比其余3 個(gè)較弱，因此本實(shí)驗(yàn)選擇給藥劑量為10、20、40 μg／mL。結(jié)果表明，10～80 μg／mL 王不留行醇提物對(duì)RAW264.7 細(xì)胞沒(méi)有毒性。

圖1 王不留行醇提物對(duì)RAW264.7細(xì)胞的細(xì)胞活力影響（n＝6）

3.2 王不留行醇提物對(duì)RAW264.7 細(xì)胞TNF?α、IL?1β、IL?6 表達(dá)的影響 如圖2 所示，與正常組比較，RAW264.7細(xì)胞受到LPS 刺激后，TNF?α、IL?1β、IL?6 蛋白和mRNA表達(dá)均提高（P＜0.01）；給予王不留行醇提物干預(yù)后，TNF?α、IL?1β、IL?6 蛋白和mRNA 表達(dá)下調(diào)（P＜0.05，P＜0.01），其中40 μg／mL 王不留行醇提物給藥組下調(diào)效果最為突出，TNF?α mRNA 相對(duì)表達(dá)下降至42.46 倍，蛋白表達(dá)下降至505.00 pg／mL。

3.3 王不留行醇提物對(duì)RAW264.7 細(xì)胞iNOS 和COX?2 信號(hào)通路表達(dá)影響 如圖3 所示，與正常組相比，模型組iNOSmRNA 表達(dá)及NO、COX?2、PGE2水平增 加（P＜0.01）；給予20、40 μg／mL 王不留行醇提物干預(yù)后，iNOSmRNA 表達(dá)和NO 分泌水平受到抑制（P＜0.05，P＜0.01），10、20、40 μg／mL 王不留行醇提物對(duì)RAW264.7 可抑制COX?2、PGE2表達(dá)（P＜0.01）。

圖3 王不留行醇提物對(duì)RAW264.7 細(xì)胞iNOS 和COX?2 表達(dá)的影響（n＝6）

3.4 H2O2對(duì)RAW264.7 巨噬細(xì)胞的細(xì)胞活力影響 如圖4所示，不同濃度H2O2對(duì)RAW264.7 細(xì)胞活力造成不同影響，且隨著H2O2濃度增大，其對(duì)細(xì)胞的損傷越大。當(dāng)H2O2濃度低于600 μmol／L 對(duì)細(xì)胞造成的損傷不顯著，濃度超過(guò)600 μmol／L 則對(duì)細(xì)胞造成過(guò)度死亡。因此本次實(shí)驗(yàn)選擇600 μmol／L H2O2作為誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞體外氧化損傷模型的濃度藥物。

圖4 不同濃度H2O2 對(duì)RAW264.7 細(xì)胞活力影響（n＝6）

3.5 王不留行醇提物對(duì)RAW264.7 細(xì)胞CAT，SOD 和GSH?PX活性和MDA 水平影響 如圖5 所示，H2O2刺激RAW264.7 巨噬細(xì)胞后，細(xì)胞CAT、SOD、GSH?PX 水平均下調(diào)，MDA 水平升高（P＜0.01）；給予王不留行醇提物干預(yù)后，細(xì)胞CAT、SOD、GSH?PX、MDA 水平降低（P＜0.05，P＜0.01），其中40 μg／mL王不留行醇提物給藥組藥效最好，CAT 水平由6.38 U／mL漲 至17.15 U／mL，SOD 水平由1.50 U／mL 漲 至17.15 U／mL，GSH?PX 水平由11.98 漲至44.52 U／L，MDA 水平由21.10 nmol／mL 降至12.00 nmol／mL。

圖5 王不留行醇提物對(duì)RAW264.7 巨噬細(xì)胞CAT、SOD、GSH?PX、MDA 水平的影響（n＝6）

4 討論

采用小鼠RAW264.7 巨噬細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)載體，探討藥物是否對(duì)細(xì)胞活性具有干擾作用。結(jié)果說(shuō)明10～80 μg／mL王不留行醇提物對(duì)RAW264.7 細(xì)胞沒(méi)有細(xì)胞毒性。接著采用LPS 誘導(dǎo)RAW264.7 巨噬細(xì)胞作為體外炎癥模型，采用H2O2誘導(dǎo)RAW264.7 巨噬細(xì)胞作為體外氧化損傷模型，探討王不留行醇提物抗炎抗氧化活性。

腫瘤壞死因子（TNF?α）是炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)中最重要的因子之一，能誘發(fā)白介素1β（IL?1β），白介素6（IL?6）等炎性因子的分泌并參與組織、器官以及機(jī)體的損傷等重要的炎癥反應(yīng)過(guò)程［5?6］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，給予王不留行醇提物干預(yù)后，TNF?α、IL?1β 及IL?6 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，表明了王不留行具有抗炎活性。進(jìn)一步探討研究發(fā)現(xiàn)王不留行醇提物抗炎活性與其調(diào)控調(diào)控誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶（iNOS）和環(huán)氧化酶2（COX?2）信號(hào)通路蛋白表達(dá)有關(guān)。iNOS 和COX?2 在體內(nèi)分別誘導(dǎo)一氧化氮（NO）和前列腺素E2（PGE2）生成。過(guò)高含量NO 和PGE2引起氧化反應(yīng)并損傷細(xì)胞，造成多種炎癥疾病［7?8］。因此，調(diào)控iNOS 和COX?2 表達(dá)，抑制NO 和PGE2的過(guò)度生成，可以抑制炎性反應(yīng)的進(jìn)程［9?11］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，給予王不留行醇提物干預(yù)后，iNOS mRNA 水平和COX?2 表達(dá)顯著下降。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明王不留行醇提物能夠調(diào)控iNOS 和COX?2 信號(hào)通路蛋白表達(dá)，抑制下游的TNF?α，IL?1β 及IL?6 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)，發(fā)揮抗炎活性。

過(guò)氧化氫酶（CAT），超氧化物歧化酶（SOD），谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH?PX）是機(jī)體內(nèi)調(diào)控氧化應(yīng)激的重要相關(guān)酶，對(duì)機(jī)體的氧化與抗氧化的平衡起著至關(guān)重要的作用［12?14］。丙二醛（MDA）為不飽和脂肪酸脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物，其在體內(nèi)的堆積會(huì)造成細(xì)胞和組織損傷。本研究結(jié)果顯示，在給予王不留行醇提物后，細(xì)胞中CAT，SOD 和GSH?PX 活性明顯提高，同時(shí)MDA 含量顯著降低，說(shuō)明王不留行醇提物具有促進(jìn)抗氧化酶活性，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的藥物活性。

綜上所述，本研究證明了王不留行通過(guò)抑制iNOS 和COX?2 信號(hào)通路發(fā)揮抗炎活性，以及通過(guò)促進(jìn)抗氧化酶活性，恢復(fù)體內(nèi)氧化與抗氧化平衡，發(fā)揮抗氧化活性。