基于電子舌表征和化學(xué)成分的“譜味”相關(guān)性探究川芎辛味物質(zhì)基礎(chǔ)

楊露萍倪 妮洪燕龍吳 飛沈 嵐

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，上海201203； 2.上海中醫(yī)藥大學(xué)上海中醫(yī)健康服務(wù)協(xié)同創(chuàng)新中心，上海201203； 3.上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥現(xiàn)代制劑技術(shù)教育部工程研究中心，上海 201203）

中藥五味理論是中藥藥性理論的重要組成部分，“五味”原指中藥“辛、甘、酸、苦、咸”5種滋味，隨著中醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展，五味逐漸與五行、五臟、陰陽(yáng)等理論相結(jié)合，演化為藥物功能分類的標(biāo)志［1?2］。化學(xué)成分是聯(lián)系五味“味與效”的基礎(chǔ)［3］。對(duì)五味物質(zhì)基礎(chǔ)的探索一直是五味理論的重點(diǎn)難點(diǎn)，目前多采用歸納總結(jié)或受體虛擬對(duì)接的方式，缺乏有力的實(shí)驗(yàn)支撐［4?5］。

辛味作為五味之一，能散、能行、能潤(rùn)、能燥，臨床應(yīng)用極其廣泛。作為辛味代表中藥之一的川芎為傘形科植物川芎Ligusticum chuanxiongHort.的干燥根莖，其藥性辛溫，重在能行、能散，妙在走竄，上行可達(dá)巔頂，下行可入血海［6］。探明川芎辛味物質(zhì)基礎(chǔ)對(duì)于闡明辛味味與效的聯(lián)系有重要意義。然目前川芎味效相關(guān)研究較多集中于藥效物質(zhì)基礎(chǔ)方面，味覺(jué)物質(zhì)基礎(chǔ)研究尚且匱乏［7?8］。

電子舌是一種智能味覺(jué)仿生系統(tǒng)，基于其類似于人類味蕾工作原理的人工脂膜傳感器技術(shù)，可通過(guò)感受味覺(jué)物質(zhì)產(chǎn)生味信號(hào)對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行分析與識(shí)別。因此，本實(shí)驗(yàn)以川芎辛味為研究對(duì)象，引入電子舌為主要研究手段，并聯(lián)合GC 分析其辛味物質(zhì)基礎(chǔ)。鑒于同科屬中藥具有相似的化學(xué)成分，本實(shí)驗(yàn)以科為分類，表征不同科辛味中藥，探究電子舌表征中藥辛味可行性；根據(jù)物質(zhì)組群可拆分原理，探明中藥川芎辛味部位；對(duì)不同產(chǎn)地川芎辛味部位電子舌響應(yīng)值與其主要成分含量進(jìn)行相關(guān)性分析并驗(yàn)證，以期明確川芎辛味物質(zhì)基礎(chǔ)，為辛味中藥臨床應(yīng)用提供依據(jù)，并為科學(xué)解析五味理論提供參考。

1 材料

1.1 儀器 α?ASTREE Ⅱ電子舌系統(tǒng)（法國(guó)Alpha MOS 公司），由7 個(gè)味覺(jué)傳感器ZZ、JE、BB、CA、GA、DA、JB 和1 個(gè)氯化銀參比電極組成；Agilent 7890A 型氣相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司）；XP205 型分析天平（十萬(wàn)分之一，瑞士梅特勒?托利多公司）；FA2104N 型分析天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；TGL?18C 高速臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；Milli?Q 超純水制備儀（密理博上海貿(mào)易有限公司）。

1.2 試劑 藁本內(nèi)酯（批號(hào)PRF10042505，純度≥98%）、洋川芎內(nèi)酯A（批號(hào)PRF20071541，純度≥98%），均購(gòu)于成都普瑞法科技開發(fā)有限公司；α?蒎烯（批號(hào)E4770050，純度99.2%，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）；4?松油醇（批號(hào)H02J6Q2，純度≥98%，上海源葉生物科技有限公司）；丁烯苯酞（批號(hào)101413?201601，純度≥98%）、阿魏酸（批號(hào) 110773?201614，純 度99.0%）、鄰苯二甲酸二乙酯（批號(hào) 190047?201403，純度≥98%），均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇、無(wú)水乙醇、乙酸乙酯、氯仿、濃鹽酸、濃氨水等均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3 材料 32 種不同科辛味中藥信息見(jiàn)表1，10批不同產(chǎn)地川芎信息見(jiàn)表2，均經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)生藥教研室崔亞君教授鑒定為正品。

表1 32 批樣品信息Tab.1 Information of thirty?two batches of samples

表2 不同產(chǎn)地10 批樣品信息Tab.2 Information of ten batches of samples from different growing areas

2 方法與結(jié)果

2.1 電子舌對(duì)川芎辛味的表征

2.1.1 中藥水煎液制備 取30 種常規(guī)類中藥飲片各10 g，加50 mL 水浸泡30 min 后煎煮30 min，300 目篩過(guò)濾，濾渣加入50 mL 水再煎煮20 min，300 目篩過(guò)濾，合并2 次濾液，定容至100 mL，5 000 r／min離心15 min，取上清液，超純水稀釋至10 mg／mL，0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾，即得。2 種后下類中藥（薄荷、砂仁）各取飲片10 g，加100 mL水煮沸5 min，300 目篩過(guò)濾，定容至100 mL，5 000 r／min離心15 min，取上清液，超純水稀釋至10 mg／mL，0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾，即得。

2.1.2 川芎揮發(fā)油制備 飲片打粉，稱取通過(guò)2號(hào)篩但不能通過(guò)4 號(hào)篩粉末100 g，加1 000 mL 純水浸泡2 h，水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油8 h，加無(wú)水硫酸鈉，4 ℃靜置過(guò)夜，讀取揮發(fā)油量，于棕色瓶中密封，4 ℃保存。精密吸取5、10、15 μL，10%乙醇定容至100 mL，0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾，即得，記為Y1、Y2、Y3（分別約相當(dāng)于生藥量10、20、30 mg／mL）。

2.1.3 川芎堿性部位制備 將上述提取揮發(fā)油之后的藥液用300 目篩過(guò)濾，濾液在60 ℃以下濃縮干燥，粉碎。取4.0 g 浸膏粉，以100 mL 1 mol／L 鹽酸溶解，濾過(guò)，濾液用濃氨水調(diào)pH 至9～10，以氯仿40、30、20 mL 萃取3 次，合并氯仿層，60 ℃水浴蒸干，2.0 mL 無(wú)水乙醇溶解得堿性部位。精密吸取130、260、390 μL，10% 乙醇定容至100 mL，0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾，即得，記為J1、J2、J3（分別約相當(dāng)于生藥量10、20、30 mg／mL）。

2.1.4 川芎酸性部位制備 另取4.0 g 浸膏粉，100 mL pH 11 氨水溶解，濾過(guò)，濾液用濃鹽酸調(diào)pH 至2～3，以乙酸乙酯40、30、20 mL 萃取3 次，合并乙酸乙酯層，60 ℃水浴蒸干，2.0 mL無(wú)水乙醇溶解得酸性部位。精密吸取130、260、390 μL，10%乙醇定容至100 mL，0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾，即得，記為S1、S2、S3（分別約相當(dāng)于生藥量10、20、30 mg／mL）。

2.2 電子舌測(cè)定方法建立 取100 mL 樣品，置于電子舌專用燒杯中，傳感器浸入樣品中測(cè)定120 s，記錄第100～120 s 數(shù)據(jù)的平均值，每次測(cè)量完成后傳感器在去離子水中清洗10 s。每份樣品測(cè)試10次，取后3 次數(shù)據(jù)作分析。

2.3 電子舌對(duì)不同科辛味中藥表征 取“2.1.1”項(xiàng)下32 種中藥水煎液，按“2.1.2”項(xiàng)下方法測(cè)試，結(jié)果作主成分分析（Principal composition analysis，PCA），見(jiàn)圖1，圖中PC1 與PC2 分別代表第一主成分與第二主成分的方差貢獻(xiàn)率，其值越大，越能反應(yīng)樣品整體信息［9］，PCA 圖中各樣品之間相對(duì)位置的遠(yuǎn)近能反映樣品間的相似度與區(qū)分度。由圖1 可知，傘形科、姜科、唇形科、蕓香科、木蘭科、樟科各同科辛味中藥（相同顏色標(biāo)記）相互聚集，即其味覺(jué)在電子舌上的響應(yīng)相似，由于同科中藥具有類似的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)，推測(cè)電子舌對(duì)同科中藥的特殊味覺(jué)化學(xué)成分或結(jié)構(gòu)有相同的響應(yīng)?；陔娮由嗄軐?duì)樣品整體味覺(jué)信息進(jìn)行數(shù)字化定量，結(jié)合化學(xué)成分分析，其可作為探究具體辛味味覺(jué)物質(zhì)成分的手段。

圖1 電子舌表征不同科辛味中藥的主成分分析圖Fig.1 PCA image of pungent herbs from different families by ET

2.4 電子舌對(duì)川芎辛味部位表征 川芎水提液用10%乙醇稀釋至10 mg／mL，0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾，記為CX；另取“2.1.1”項(xiàng)下川芎揮發(fā)油Y1、Y2、Y3，川芎堿性部位J1、J2、J3，川芎酸性部位S2、S3，按“2.1.2”項(xiàng)下方法測(cè)試，進(jìn)行主成分分析，再利用電子舌自帶分析軟件AlphaSoft 14.2 計(jì)算不同樣品之間的歐氏距離（反映樣品之間區(qū)分度），結(jié)果見(jiàn)圖2。由此表明，川芎揮發(fā)油與川芎距離最近，而酸性、堿性部位相對(duì)較遠(yuǎn)，提示電子舌對(duì)川芎揮發(fā)油與川芎的響應(yīng)最類似，對(duì)兩者中某些共同物質(zhì)或結(jié)構(gòu)有相同的響應(yīng)，并且揮發(fā)油對(duì)川芎味覺(jué)信息的貢獻(xiàn)度最大。

圖2 電子舌表征川芎辛味部位Fig.2 ET characterization for pungent part of L.chuanxiong

2.5 電子舌對(duì)不同產(chǎn)地川芎辛味部位表征 取10批樣品（CX1～CX10）揮發(fā)油各5 μL，10% 乙醇定容 至100 mL，0.45 μm 微孔濾膜過(guò) 濾，按“2.1.2”項(xiàng)下方法測(cè)試，各電極響應(yīng)值的雷達(dá)圖見(jiàn)圖3。由此可知，不同電極對(duì)不同產(chǎn)地的川芎揮發(fā)油均有一定區(qū)分能力，其中以ZZ、JE、DA最強(qiáng)。

圖3 電子舌表征不同產(chǎn)地川芎揮發(fā)油雷達(dá)圖Fig.3 ET Radar map of volatile oils of L.chuanxiong from different growing areas

2.6 川芎揮發(fā)油中6 種成分的GC 同步定量表征

2.6.1 色譜條件 B?624 色譜柱（0.45 mm×30 m，2.55 μm）；體積流量1.5 mL／min；進(jìn)樣量1 μL；不分流；進(jìn)樣口溫度250 ℃；檢測(cè)器溫度260 ℃；程序升溫，初始溫度60 ℃，以10 ℃／min升至160 ℃，保持6 min 后，以5 ℃／min 升至200 ℃，保持8 min 后，以5 ℃／min 升至230 ℃，保持10 min。見(jiàn)圖4。

圖4 川芎揮發(fā)油GS 色譜圖Fig.4 GS chromatogram of volatile oil of L.chuanxiong

2.6.2 溶液制備

2.6.2.1 對(duì)照品貯備液 取α?蒎烯、4?松油醇、阿魏酸、丁烯苯酞、藁本內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯A 對(duì)照品適量，精密稱定，甲醇定容，制成質(zhì)量濃度分別為1.272 0、7.544 0、5.880 0、7.650 0、8.450 0、6.595 0 mg／mL 的溶液。

2.6.2.2 內(nèi)標(biāo)溶液 取鄰苯二甲酸乙酯對(duì)照品適量，精密稱定，甲醇定容，制成質(zhì)量濃度為10.685 0 mg／mL 的溶液。

2.6.2.3 對(duì)照品溶液 精密吸取各對(duì)照品貯備液適量，甲醇定容，制成α?蒎烯、4?松油醇、阿魏酸、丁烯苯酞、藁本內(nèi)酯，洋川芎內(nèi)酯A 質(zhì)量濃度分別為0.254 4、0.377 2、0.294 0、0.382 5、4.225 0、0.824 4 mg／mL 的貯備液，分別精密吸取其與內(nèi)標(biāo)溶液適量，甲醇定容，即得。

2.6.2.4 供試品溶液 取樣品適量，精密稱定，再精密加入適量?jī)?nèi)標(biāo)溶液，甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.6.3 方法學(xué)考察

2.6.3.1 線性關(guān)系考察 取“2.6.2.3”項(xiàng)下貯備液50、100、150、200、400、800 μL，各加入50 μL 內(nèi)標(biāo)溶液，甲醇定容，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣。以各成分質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），各成分峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比值為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，得α?蒎烯、4?松油醇、阿魏酸、丁烯苯酞、藁本內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯A 方程分別為Y＝2.045 1X＋0.002 3（r＝0.999 1）、Y＝2.283 7X＋0.007 1（r＝0.999 8）、Y＝0.885 4X－0.002 4（r＝0.999 3）、Y＝2.975 5X＋0.005 9（r＝0.999 6）、Y＝1.707 6X＋0.003 3（r＝0.999 7）、Y＝2.255 0X－0.018 0（r＝0.999 4），在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6.3.2 精密度試驗(yàn) 取混合對(duì)照品溶液，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6 次，測(cè)得以上6種成分峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比值的RSD 均小于3%，表明儀器精密度良好。

2.6.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，于0、2、4、6、8、12、24 h 在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，測(cè)得以上6 種成分峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比值的RSD 均小于3%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6.3.4 加樣回收率試驗(yàn) 取同一批川芎揮發(fā)油，平行制備6 份供試品溶液，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，測(cè)得以上6 種成分平均加樣回收率為95%～105%，RSD 均小于3%。

2.6.4 樣品含量測(cè)定 取10 批樣品揮發(fā)油制備供試品溶液，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，內(nèi)標(biāo)法計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 不同產(chǎn)地川芎揮發(fā)油中各成分含量測(cè)定結(jié)果（%，， n＝3）Tab.3 Results of content determination for various constituents in volatile oils of L.chuanxiong from different growing areas（%，， n＝3）

表3 不同產(chǎn)地川芎揮發(fā)油中各成分含量測(cè)定結(jié)果（%，， n＝3）Tab.3 Results of content determination for various constituents in volatile oils of L.chuanxiong from different growing areas（%，， n＝3）

2.7 基于電子舌表征與化學(xué)成分相關(guān)性分析川芎辛味物質(zhì)基礎(chǔ)

2.7.1 川芎揮發(fā)油成分含量與電子舌響應(yīng)的相關(guān)性分析 采用SPSS 22.0 軟件作川芎揮發(fā)油中6 種成分與電子舌7 枚電極響應(yīng)的Pearson 相關(guān)性分析，結(jié)果見(jiàn)表4。由表4 可知，丁烯苯酞含量與電極ZZ、JE、BB、GA 響應(yīng)呈極顯著正相關(guān)，與DA、JB 響應(yīng)呈顯著正相關(guān)；藁本內(nèi)酯含量與電極CA 響應(yīng)呈正相關(guān)；洋川芎內(nèi)酯A 含量與電極DA 響應(yīng)呈顯著負(fù)相關(guān)，表明丁烯苯酞、洋川芎內(nèi)酯A、藁本內(nèi)酯的含量高低對(duì)電子舌響應(yīng)影響顯著，而其他萜類、酚酸類（如α?蒎烯、4?松油醇、阿魏酸）則無(wú)顯著影響，提示川芎辛味的味覺(jué)物質(zhì)可能主要為其揮發(fā)油中的苯酞類成分。

表4 川芎揮發(fā)油中6 種成分含量與7 枚電極響應(yīng)的相關(guān)性分析Tab.4 Correlation analysis between contents of six constituents in volatile oils of L.chuanxiong and responses of seven electrodes

2.7.2 川芎辛味物質(zhì)基礎(chǔ)的電子舌驗(yàn)證 精密稱取α?蒎烯、4?松油醇、阿魏酸、丁烯苯酞、藁本內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯A 與川芎揮發(fā)油各5 mg 于10% 乙醇中，0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾，按“2.1.2”項(xiàng)下方法測(cè)試，進(jìn)行PCA 分析，并計(jì)算不同樣品之間歐式距離。如圖5 所示，丁烯苯酞、藁本內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯A 與川芎揮發(fā)油距離相近，而α?蒎烯、4?松油醇、阿魏酸則距川芎揮發(fā)油距離較遠(yuǎn)，進(jìn)一步驗(yàn)證丁烯苯酞、藁本內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯A 是川芎辛味的物質(zhì)基礎(chǔ)。

圖5 電子舌表征川芎揮發(fā)油6 種成分Fig.5 ET characterization of six constituents in volatile oil of L.chuanxiong

3 討論

人工口嘗是最主要的五味標(biāo)定方法，然而其主觀性使之不能成為確定的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。電子舌技術(shù)最先應(yīng)用于食品飲料行業(yè)，近年來(lái)陸續(xù)有學(xué)者將其移植到中藥五味的標(biāo)定中，突破了五味確定標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一的壁壘［10］。而藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究則偏離五味核心理論，出現(xiàn)以藥效指標(biāo)以偏概全解讀藥味的思維混亂問(wèn)題。理清中藥藥味物質(zhì)基礎(chǔ)是科學(xué)解析五味理論的基石，基于電子舌可客觀、量化表征味覺(jué)信息的特點(diǎn)，有望成為探明藥味物質(zhì)基礎(chǔ)的有力手段。

然而，電子舌對(duì)五味之辛味的表征區(qū)分尚未能取得理想成果［11?12］。杜瑞超等［13］以22 種常用中藥水煎液為對(duì)象，成功在電子舌上歸屬出中藥“酸、甜、苦、咸”四味劃分區(qū)域，而未歸屬出辛味區(qū)域。曹煌等［14］以辣椒素為辛味藥陽(yáng)性對(duì)照，于電子舌上表征歸屬中藥藥材、物質(zhì)組群及單體成分的藥味，其結(jié)果規(guī)律性并不明顯。目前，在傳統(tǒng)五味分類方式下，辛味藥在電子舌上無(wú)特定歸屬區(qū)域，且缺乏合適的陽(yáng)性對(duì)照物質(zhì)，使電子舌對(duì)中藥辛味藥的研究陷入瓶頸。

本研究以科為分類，基于電子舌表征不同科辛味中藥，同科辛味中藥相互聚集，不同科辛味中藥相互分離，呈現(xiàn)明顯的規(guī)律性。按科分布是辛味中藥在電子舌上的響應(yīng)規(guī)律，本質(zhì)上也是電子舌對(duì)不同物質(zhì)基礎(chǔ)的響應(yīng)規(guī)律。因此，本實(shí)驗(yàn)在按科分類的基礎(chǔ)上，以電子舌作為分析中藥辛味物質(zhì)基礎(chǔ)的有效手段，并借鑒中藥譜效研究思路，對(duì)川芎辛味的仿生電子舌味覺(jué)表征信息與化學(xué)指紋圖譜的“譜味”相關(guān)關(guān)系進(jìn)行研究，找出顯著影響電子舌響應(yīng)的具體味覺(jué)成分，此法可為中藥五味理論的物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供一種可行的方法。

雙變量相關(guān)性分析常用于度量2 個(gè)連續(xù)變量之間相關(guān)趨勢(shì)與程度［15］，本研究對(duì)不同產(chǎn)地川芎揮發(fā)油電子舌響應(yīng)值與成分含量進(jìn)行雙變量相關(guān)性分析，以揭示川芎揮發(fā)油中主要辛味味覺(jué)成分以及對(duì)此響應(yīng)敏感的電極。實(shí)驗(yàn)所用傳感器電極為電位型多通道類脂膜，采用不同材料的類脂膜模擬不同特性的味覺(jué)細(xì)胞，通過(guò)影響膜兩側(cè)電勢(shì)變化綜合反映樣品味覺(jué)信息［16］。電子舌對(duì)同一類味覺(jué)物質(zhì)有類似的響應(yīng)模式［17］，由結(jié)果可知，藁本內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯A 與丁烯苯酞3 種苯酞類成分與川芎揮發(fā)油響應(yīng)特征相似，表明其相同的味覺(jué)物質(zhì)基礎(chǔ)。同時(shí)，電子舌也能在同一類相似味覺(jué)中區(qū)分化學(xué)物質(zhì)［18］，結(jié)果顯示，電極CA 對(duì)藁本內(nèi)酯響應(yīng)顯著，電極DA 對(duì)洋川芎內(nèi)酯A 響應(yīng)顯著，而電極ZZ、JE、BB、GA、DA、JB 均對(duì)丁烯苯酞響應(yīng)顯著，同一電極對(duì)不同物質(zhì)敏感性不同。