HPLC 法同時(shí)測(cè)定金銀花配方顆粒中6 種成分

胡 楊李先芝 錢全全嚴(yán) 玲毛瓊麗林 露劉 洋石 豪

（1.勁牌有限公司，湖北 大冶435112； 2.中藥保健食品質(zhì)量與安全湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 大冶 435112）

金銀花是忍冬科植物忍冬Lonicera japonicaThunb.的干燥花蕾或帶初開(kāi)的花，具有清熱解毒、疏散風(fēng)熱 之功效［1］，主要含 有黃酮［2?3］、有 機(jī)酸［4?5］、多糖［6?7］、揮發(fā)油［8］、多酚［9?10］等成分，在抗炎［11?12］、抗氧化［6，13］、抗病毒［14?15］、抗癌［16?17］、調(diào)節(jié)免疫力［18?19］等方面具有顯著功效，正成為研究熱點(diǎn)。金銀花配方顆粒是以金銀花飲片為原料，采用現(xiàn)代工藝技術(shù)對(duì)其進(jìn)行提取、濃縮、干燥、制粒、包裝等工序加工制成的新型中藥制劑，與傳統(tǒng)飲片相比，它具有免煎煮、易于攜帶、安全衛(wèi)生等優(yōu)勢(shì)［20］，但在性狀、鑒別上與原藥材有較大差異，為了確保其安全有效、質(zhì)量穩(wěn)定，對(duì)其指標(biāo)性成分含量進(jìn)行測(cè)定顯得尤為重要［21］。目前，對(duì)金銀花配方顆粒的研究主要集中在指紋圖譜或單一成分（如綠原酸、木犀草苷）［22?24］，但鮮有同時(shí)測(cè)定6種綠原酸及其異構(gòu)體含量的報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)采用HPLC 法同時(shí)測(cè)定金銀花配方顆中綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C 的含量，以期為該制劑的質(zhì)量控制提供有效手段。

1 材料

1.1 儀器 UltiMate 3000 高效液相色譜儀（美國(guó)賽默飛世爾科技公司）；SQP 電子分析天平（德國(guó)賽多利斯公司）；數(shù)控超聲波清洗儀（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）；PURELAB classic UV 超純水儀（英國(guó)ELGA 公司）；數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州國(guó)華電器有限公司）。

1.2 試劑 綠原酸對(duì)照品（批號(hào)110753?201716，純度99.3%，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；異綠原酸C 對(duì)照品（批號(hào)250036?202005，純度99.21%，上海鴻永生物科技有限公司）；隱綠原酸（批號(hào)DST200522?035，純度98.77%）、新綠原酸（批號(hào)DST200521?015，純度99.68%）、異綠原酸A（批號(hào)DST190918?036，純度99.55%）、異綠原酸B（批號(hào)DST191008?037，純度99.04%）對(duì)照品（成都德思特生物技術(shù)有限公司）。乙腈為色譜純（美國(guó)費(fèi)希爾公司）；磷酸為色譜純（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；其他試劑均為分析純；水為超純水。

1.3 藥物 金銀花配方顆粒共3 批，由勁牌持正堂藥業(yè)有限公司提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Waters Atlantis T3 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈（A）?0.1%磷酸（B），梯度洗脫，程序見(jiàn)表1；體積流量1.0 mL／min；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)348 nm；進(jìn)樣量10 μL。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution programs

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱取綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C對(duì)照品適量，50%甲醇溶解，制成每1 mL 分別含0.5、0.5、0.3、0.4、0.4、0.3 mg 上述成分的溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液 精密稱取配方顆粒粉末0.1 g，置于25 mL 量瓶中，20 mL 50%甲醇超聲處理30 min，冷卻至室溫，50%甲醇定容至刻度，搖勻，0.25 μm 微孔濾膜過(guò)濾，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液 精密稱取麥芽糊精粉末0.1 g，置于25 mL 量瓶中，加20 mL 50%甲醇超聲處理30 min，冷卻至室溫，50% 甲醇定容至刻度，搖勻，0.25 μm 微孔濾膜過(guò)濾，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 系統(tǒng)適應(yīng)性考察 取對(duì)照品、供試品、陰性樣品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖1。由此可知，供試品、對(duì)照品溶液在相同保留時(shí)間上都有色譜峰，陰性無(wú)干擾。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.3.2 線性關(guān)系考察 將“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液稀釋成5 個(gè)質(zhì)量濃度，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，結(jié)果見(jiàn)表2，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 各成分線性關(guān)系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.3.3 精密度試驗(yàn) 取同一批配方顆粒（批號(hào)C20442001011），按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次，測(cè)得新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C 峰面積RSD 分別為0.27%、0.28%、0.25%、0.18%、1.16%、0.15%，表明儀器精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批配方顆粒（批號(hào)C20442001011），于0、4、8、12、16、20 h 在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C 峰面積RSD 分別為0.36%、0.27%、0.38%、0.50%、1.06%、0.33%，表明溶液在20 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批配方顆粒6 份（批號(hào)C20442001011），按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C 含量RSD 分別為0.43%、0.38%、0.48%、0.35%、0.77%、0.39%，表 明該方法重復(fù)性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取各成分含量已知的同一批配方顆粒（批號(hào)C20442001011）50 mg，置于25 mL 量瓶中，共9 份，分別按低、中、高水平加入對(duì)照品適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果，各成分平均加樣回收率（RSD）分別為新綠原酸99.27%（2.49%）、綠原酸99.60%（1.88%）、隱綠原酸98.40%（2.77%）、異綠原酸B 101.17%（1.27%）、異綠原酸A 101.38%（1.28%）、異綠原酸C 99.76%（1.26%）。

2.3.7 樣品含量測(cè)定 取3 批配方顆粒，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 各成分含量測(cè)定結(jié)果（mg／g， n＝3）Tab.3 Results of content determination of various constituents（mg／g， n＝3）

3 討論

3.1 供試品溶液制備方法篩選

3.1.1 提取溶劑 考察了甲醇、水、50% 甲醇，發(fā)現(xiàn)以水提取時(shí)，各成分含量均很低；以甲醇提取時(shí)，綠原酸、隱綠原酸含量較低；以50% 甲醇提取時(shí)，各成分提取效果最好。因此，選擇50% 甲醇作為提取溶劑。

3.1.2 提取方法 考察了超聲、加熱回流、冷浸，發(fā)現(xiàn)加熱回流、超聲提取效果均較好，冷浸效果最差。為了操作簡(jiǎn)便，選擇超聲作為提取方法。

3.2 色譜條件篩選

3.2.1 色譜柱 考察了Waters、Thermo 等不同廠家的色譜柱，發(fā)現(xiàn)Waters 色譜柱分離效果最好，重復(fù)性理想。

3.2.2 檢測(cè)波長(zhǎng) 將對(duì)照品、樣品在190～800 nm范圍內(nèi)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，發(fā)現(xiàn)各成分在348 nm 處均有較大吸收峰，而且干擾較小，基線平穩(wěn)。因此，選擇348 nm 作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了HPLC 法同時(shí)測(cè)定金銀花配方顆粒中新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C 的含量，該方法操作簡(jiǎn)便，重復(fù)性好，準(zhǔn)確度高，可為該制劑的質(zhì)量監(jiān)控提供參考。