高效液相色譜法測定膚康凝膠中苦參堿和黃芩苷的含量研究*

甘燦云 陳海紅 楊海燕

杭州市中醫(yī)院 浙江 杭州 310007

膚康凝膠是院內(nèi)制劑復(fù)方苦參洗劑通過劑型優(yōu)化而成，該處方由我院皮膚科省級名中醫(yī)根據(jù)多年臨床經(jīng)驗(yàn)，在中醫(yī)古方“苦參湯”的基礎(chǔ)上研制而成，具有清熱解毒、燥濕止癢之功效，并經(jīng)過長期臨床應(yīng)用，在治療濕疹、皮膚膿皰疹及紅痱等瘙癢性、感染性皮膚病方面療效顯著，深受患者的歡迎，已成為皮膚科中醫(yī)治療的優(yōu)勢藥物[1]。臨床上由于中藥洗劑存在用量大、攜帶使用不方便、病人依從性差等因素，故將其改造成具有生物相容性好,制備工藝簡單，局部給藥后易吸收、易清洗、使用舒適的外用凝膠，克服原劑型的缺陷，更好地發(fā)揮其顯著療效，提升我院新制劑的研制水平。為保證該制劑質(zhì)量的穩(wěn)定可控，安全有效，本文采用高效液相色譜法（HPLC）測定苦參堿及黃芩苷的含量，以建立膚康凝膠的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

1 儀器與材料

1.1 儀器與設(shè)備：高效液相色譜儀(日本島津LC-20AT型，SPD-20A型紫外可見檢測器)；RE-200B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；DHG9246A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；DK-S24電熱恒溫水浴鍋(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；XS105DU分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司d=0.01mg)；BT 224S電子分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司d=0.1mg）；BY-G16型高速醫(yī)用離心機(jī)(北京白洋醫(yī)療器械有限公司)；OKO-PN電動(dòng)噴霧器（武漢藥科新技術(shù)開發(fā)有限公司）；YOKO-PX薄層顯色抽氣箱（武漢藥科新技術(shù)開發(fā)有限公司）；ZF1-Ⅱ紫外分析儀（上海嘉鵬科技有限公司）；硅膠G薄層板（青島海洋化工廠）。

1.2 藥品與試劑：苦參（產(chǎn)地：浙江）、黃芩（產(chǎn)地：山西）、黃連（產(chǎn)地：四川）均購于浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片廠；苦參堿對照品（批號：110805-200508，含量100%）；黃芩苷對照品（批號：110715-201619，含量93.5%）均購自中國藥品食品檢定研究院；膚康凝膠（批號：180520，180521，180522），陰性樣品均由本實(shí)驗(yàn)室自制；乙醇、無水乙醇、甲醇、磷酸、乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷均為分析純；甲醇色譜純、乙腈色譜純（天津四友精細(xì)化學(xué)品有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 苦參堿的含量測定：分述如下。

2.1.1 色譜條件[2-3]：色譜柱Agilent ZORBAX NH2(4.6mm×150mm，5μm)，流動(dòng)相乙腈-無水乙醇-3%磷酸溶液（82∶10∶8），流速1.0ml/min；柱溫30℃，檢測波長220nm，進(jìn)樣量為10μl。理論塔板數(shù)按苦參堿峰計(jì)算應(yīng)不低于2000，分離度＞1.5，各成分基線分離良好。

2.1.2 線性范圍考察：精密稱取苦參堿對照品9.28mg至25ml的容量瓶中，加乙腈-無水乙醇（80∶20）混合溶液溶解并定容至25ml，制成對照品溶液母液。分別精密吸取0.5、1、2、4、8ml置10ml容量瓶中，加乙腈-無水乙醇（80∶20）稀釋至刻度，得一系列對照品溶液，濃度分別為18.56、37.12、74.24、148.48、296.96μg/ml，分別進(jìn)樣 10μl，峰面積分別為 98800、213446、434292、848252、1770232。以進(jìn)樣濃度x(μg/ml)為橫坐標(biāo)、峰面積y為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得回歸方程為y=5977.9x－14889(R2=0.9996)，表明苦參堿在 18.56～296.96μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.3 供試品溶液的制備：取本品1g至10ml量瓶中，加1ml氨水，加入適量三氯甲烷，超聲30min，放置過夜，過濾，濾液蒸干，殘?jiān)訜o水乙醇定容至10ml，搖勻，用0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液即得。

2.1.4 陰性溶液的制備：按膚康凝膠處方和制備工藝制備缺苦參的陰性凝膠，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制成陰性對照溶液。

2.1.5 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)：取“2.1.2”“2.1.3”“2.1.4”項(xiàng)下對照品溶液、供試品溶液及陰性對照溶液，按“2.2.1”色譜條件注入高效液相色譜儀測定，記錄色譜圖，理論塔板數(shù)按苦參堿峰計(jì)算應(yīng)不低于2000，分離度＞1.5，各成分基線分離良好?？鄥A對照品溶液在12.5min左右有峰，供試品在相應(yīng)時(shí)間均有峰與之對應(yīng)，而陰性對照溶液在12.5min左右無峰，表明其他成分對苦參堿的測定無干擾。結(jié)果見圖1。

圖1 苦參堿高效液相色譜圖

2.1.6 精密度考察：精密吸取“2.1.2”項(xiàng)下對照品溶液，在“2.1.1”色譜條件下，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次10μl，測定苦參堿的峰面積，結(jié)果，苦參堿峰面積的RSD=0.827%（n＝6）。表明儀器精密度良好。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)：取“2.1.3”項(xiàng)下供試品溶液，在“2.1.1”色譜條件下于0、2、4、8、12h分別進(jìn)樣，進(jìn)樣量為10μl，測定苦參堿的峰面積，結(jié)果苦參堿峰面積的RSD=1.081%（n＝6）。表明供試品溶液在 12h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.1.8 重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批次樣品6份，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”色譜條件測定峰面積，記錄峰面積并計(jì)算含量。結(jié)果苦參堿的RSD=1.193%（n＝6）。表明本方法重復(fù)性良好。

2.1.9 加樣回收率試驗(yàn)：精密稱取6份已知含量的凝膠1g，分別精密加入“2.1.2”項(xiàng)下苦參堿296.96μg/ml對照品溶液1ml，按“2.1.3”制備。在“2.1.1”色譜條件下測定其峰面積。加樣回收率（%）=[（測得量－樣品量）/標(biāo)準(zhǔn)量]×100%。測得平均回收率98.80%，RSD值為1.016%。說明本方法回收率較好。結(jié)果見表1。

表1 苦參堿加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

2.1.10 樣品含量測定：取3批樣品各適量，分別按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定并計(jì)算含量，結(jié)果三批樣品中苦參堿含量分別為255.712μg/g、259.086μg/g、258.106μg/g。

2.2 黃芩苷的含量測定[4]：分述如下。

2.2.1 色譜條件：色譜柱Agilent Eclipse Plus C18(4.6mm×250mm，5μm)，流動(dòng)相乙腈-0.1%磷酸溶液（23∶77），流速1.0ml/min；柱溫30℃，檢測波長280nm，進(jìn)樣量為10μl。

2.2.2 線性范圍考察：精密稱取黃芩苷對照品11.13mg，加甲醇溶解并定容至25ml，制成對照品溶液母液。分別精密吸取0.5、1、2、4、8ml置25ml容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，得一系列對照品溶液，濃度分別為8.325、16.650、33.301、66.602、133.204、416.262 μg/ml，分別進(jìn)樣 10μl，峰面積分別為 318001、628671、1284462、2529878、5188639、16337665，以進(jìn)樣濃度x(μg/ml)為橫坐標(biāo)、峰面積y為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得回歸方程為y=39315x-37471(R2=1)，表明黃芩苷在8.325～416.262μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.3 供試品溶液的制備：取本品0.25g至50ml量瓶中，加入適量甲醇，60℃水浴保溫15min，再超聲30 min，冷卻后加甲醇定容至50ml，搖勻，用0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液即得。

2.2.4 陰性溶液的制備：按膚康凝膠處方和制備工藝制備缺黃芩的陰性凝膠，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制成陰性對照溶液。

2.2.5 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)：取“2.2.2”“2.2.3”“2.2.4”項(xiàng)下對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液各適量，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，理論塔板數(shù)按黃芩苷峰計(jì)算應(yīng)不低于2500，分離度＞1.5，各成分基線分離良好。供試品溶液的色譜圖在與黃芩苷對照品相應(yīng)保留時(shí)間處有色譜峰與之對應(yīng)，而缺黃芩的陰性對照溶液在15min左右沒有色譜峰，表明陰性對照對黃芩苷的測定無干擾。見圖2。

圖2 黃芩苷高效液相色譜圖

2.2.6 精密度試驗(yàn)：精密吸取“2.2.2”項(xiàng)下對照品溶液適量，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次10μl，測定黃芩苷記錄峰面積，結(jié)果，黃芩苷峰面積的RSD＝0.069%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)：取“2.2.3”項(xiàng)下供試品溶液適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、16h時(shí)按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，黃芩苷峰面積的RSD＝0.341%（n＝6），表明供試品溶液在室溫放置16 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.2.8 重復(fù)性試驗(yàn)：精密稱取同一批樣品適量，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算含量。結(jié)果黃芩苷的RSD＝2.549%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.2.9 加樣回收率試驗(yàn)：精密稱取黃芩苷對照品17.91mg，加甲醇溶解并定容至25ml，制成對照品溶液，再精密稱取6份已知含量的膚康凝膠0.25g，分別精密加入對照品溶液3ml，按“2.2.3”制備。在“2.2.1”色譜條件下測定其峰面積計(jì)算加樣回收率。加樣回收率（%）=[（測得量-樣品量）/標(biāo)準(zhǔn)量]×100%。測得平均回收率92.88%，RSD值為1.111%。說明本方法回收率較好。結(jié)果見表2。

表2 黃芩苷加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果表(n=6)

2.2.10 樣品含量測定：取3批樣品各適量，分別按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定并計(jì)算含量，結(jié)果三批樣品中黃芩苷含量分別為7.504mg/g、7.661mg/g、7.528mg/g。

3 討論

膚康凝膠方中苦參為主藥，具有清熱燥濕、祛風(fēng)殺蟲的作用，治療滲出、瘙癢、紅腫皮膚?。稽S芩清熱燥濕、消腫止血；黃連味苦、性寒，清熱燥濕、瀉火解毒，兩者皆為臣藥，屬于清熱燥濕配伍的經(jīng)典對藥。其作為院內(nèi)制劑應(yīng)用于臨床20余年，在皮膚病方面療效顯著?？鄥A是苦參中主要有效成分，具有廣泛的生物活性，具有抗菌、抗病毒、抗炎等藥理功效[5]，苦參又為方中君藥，與該制劑的功能主治相符，黃芩苷為黃芩的主要活性成分之一[6]，也具有顯著的抗菌、抗炎、抗病毒作用，由于復(fù)方制劑成分復(fù)雜，充分考慮到本方其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)為多成分共同作用，因此，本試驗(yàn)對苦參和黃芩進(jìn)行了定量考察。

本次實(shí)驗(yàn)考察苦參堿含量時(shí)查閱了大量文獻(xiàn)和參考藥典供試品處理方法，比較了乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷超聲萃取的方法，萃取效果較為理想的是三氯甲烷。流動(dòng)相分別考察了乙腈-無水乙醇-3%磷酸（80∶10∶10，81∶10∶9，82∶10∶8，V/V），最終確定（82∶10∶8）的流動(dòng)相分離度最佳，峰形好，出峰時(shí)間合適；在測定黃芩苷的含量時(shí)，分別采用了乙腈-0.1%磷酸溶液（25∶75，24∶76，23∶77，22∶78，V/V）等不同配比流動(dòng)相進(jìn)行試驗(yàn)，由于中藥成分較多且復(fù)雜，每針進(jìn)樣時(shí)間考察40min。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，流動(dòng)相配比為乙腈-0.1%磷酸溶液（25∶75，24∶76，V/V）時(shí)，黃芩苷的分離度均＜1.5，當(dāng)乙腈-0.1%磷酸溶液（23∶77，V/V）時(shí)分離度為2.2，峰形較好，分離度、峰面積均合適，保留時(shí)間約15min，在35min中左右時(shí)，樣品仍有出峰。而乙腈-0.1%磷酸溶液（22∶78，V/V）分離度高達(dá)21，保留時(shí)間約21min，相應(yīng)進(jìn)樣時(shí)間40mim后，還有樣品峰出現(xiàn)，進(jìn)樣時(shí)間大大增加。最終選擇流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸溶液（23∶77，V/V）。

綜上所述，本試驗(yàn)中苦參堿和黃芩苷的含量測定，方法特征性強(qiáng)，無陰性干擾，分離度、重復(fù)性、穩(wěn)定性、加樣回收率均符合要求，且所測3批樣品含量穩(wěn)定，說明該方法可行，可作為該制劑的含量測定方法。結(jié)果表明所建立的定量方法能較好地控制膚康凝膠質(zhì)量，提高了藥品質(zhì)量的可控性。