慢性阻塞性肺疾病急性加重期患者應(yīng)用痰真菌涂片與痰真菌免疫熒光染色檢測法進(jìn)行快速診斷的價值比較

劉鴻宇 周峻林

上海市東方醫(yī)院吉安醫(yī)院呼吸科，江西吉安 343000

慢性阻塞性肺疾病急性加重期（acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease，AECOPD）是由于患者肺部炎癥反應(yīng)造成呼吸道粘液分泌增多后容易堵塞結(jié)構(gòu)相對狹窄的支氣管腔，從而造成氣流阻塞。本病多為感染所致，尤其是免疫功能低下、體質(zhì)較差的老年患者[1]。本病的早期診斷對及時預(yù)防惡性并發(fā)癥具有重要作用。過去，病人的痰液常被采集作真菌培養(yǎng)，作為診斷呼吸道感染的金標(biāo)準(zhǔn)。陽性標(biāo)本中可觀察到真菌孢子、菌絲、孢子囊等，但該方法耗時長，不便于大樣本的篩選。雖然采用直接涂片顯微鏡檢查比較方便，但陽性率較低，因此仍需尋找一種更方便有效的檢測手段[2]。

真菌免疫熒光染色法是一種快速檢測真菌的方法，適用于臨床檢測各種疑似真菌感染的熒光染料和活檢標(biāo)本或體液（黏液、肺泡灌洗液等）中可能含有β-的真菌細(xì)胞壁多糖，進(jìn)行熒光標(biāo)記后，在熒光檢測顯微鏡下，可以快速定性檢測人體組織和體液中可能存在的各種真菌（霉菌和酵母菌），能夠初步判定真菌感染，檢測精度和速度比傳統(tǒng)真菌有了很大提高[3-5]?；诖?，本研究選取上海市東方醫(yī)院吉安醫(yī)院送檢的60 例AECOPD 患者的痰液標(biāo)本作為研究對象，旨在比較痰真菌涂片與痰真菌免疫熒光染色檢測法用于AECOPD 患者的快速診斷的價值，以推廣優(yōu)勢方法用于AECOPD 患者真菌感染的早期診斷及治療。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年6月—2020年6月于上海市東方醫(yī)院吉安醫(yī)院送檢的60 例AECOPD 患者的痰液標(biāo)本作為研究對象。其中男31 例，女29 例；年齡20～82歲；來自呼吸科病房34 例，ICU 病房26 例。本研究經(jīng)過醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)，患者均自愿參與研究并簽署知情同意書。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合世界中醫(yī)藥學(xué)會聯(lián)合會《國際中醫(yī)臨床實踐指南慢性阻塞性肺疾病》 中慢性阻塞性肺疾病急性加重期的診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]；②影像學(xué)上出現(xiàn)了新的肺部浸潤影；③持續(xù)發(fā)熱≥96 h，經(jīng)過積極抗菌治療后無效。排除標(biāo)準(zhǔn)：①入院1 周內(nèi)已接受過抗真菌治療；②接受過血液透析治療。

1.2 方法

及時將痰標(biāo)本送檢痰真菌涂片、痰免疫熒光染色、痰真菌培養(yǎng)等檢查。

1.2.1 標(biāo)本取材 入院后應(yīng)立即取痰標(biāo)本。建議在清晨取痰標(biāo)本?；颊咴绯科鸫埠髴?yīng)清潔口腔3 次。清潔后，用力咳嗽，將深呼吸道的痰咳入無菌容器，然后密封送至實驗室。對于人工氣道患者，醫(yī)務(wù)人員應(yīng)在氣道插管下用集痰器收集深呼吸道分泌物，并嚴(yán)格執(zhí)行無菌操作。

1.2.2 痰真菌涂片 將送檢標(biāo)本先進(jìn)行涂片，按規(guī)范步驟進(jìn)行革蘭染色，鏡下觀察10 個視野，若發(fā)現(xiàn)真菌，需詳細(xì)記錄菌體、可疑性病原菌、球囊的情況。

1.2.3 痰真菌培養(yǎng)對已涂布觀察的標(biāo)本進(jìn)行真菌培養(yǎng)，培養(yǎng)基材料包括哥倫比亞血瓊脂、萬古霉素巧克力瓊脂、沙氏葡萄瓊脂以及念珠菌顯色平板，置于35℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，5 d 后若無真菌生長則為陰性。

1.2.4 痰真菌免疫熒光檢測 ①檢測原理：真菌免疫熒光顯色試劑購自濟(jì)南德亨醫(yī)學(xué)科技有限公司（魯濟(jì)械備20180127 號）。該試劑盒可根據(jù)免疫學(xué)和熒光顯色原理快速檢測各種樣品中的β 葡聚糖或幾丁質(zhì)成分。根據(jù)其形態(tài)特征，對標(biāo)記物進(jìn)行了鑒定和分析。真菌細(xì)胞壁富含葡聚糖、幾丁質(zhì)等多糖，因此更容易被標(biāo)記，通過熒光顯微鏡紫外光（波長：340～380 nm）激發(fā)靶點上的熒光素發(fā)光，鏡下可觀察其形態(tài)，從而定性檢測真菌。②具體步驟：挑取樣本制成涂片，干燥后充分固定;或者將組織切片按常規(guī)脫蠟至水。將標(biāo)本放于水平位置，加一滴顯色試劑覆蓋于標(biāo)本上，蓋上蓋玻片，使其與標(biāo)本充分結(jié)合。染色維持2 min，濾紙吸收多余染料，熒光顯微鏡下觀察（波長：340～380 nm）。真菌菌絲體和孢子呈亮藍(lán)色，結(jié)構(gòu)清晰。但真菌感染的診斷應(yīng)以臨床經(jīng)驗為依據(jù)判斷。③注意事項：a.壓片后，用濾紙吸去多余染液，這樣可使鏡下效果更清晰，同時避免液體溢出造成污染[6]。b.染色后盡快閱片，以免液體干涸影響觀察。c.在暗室環(huán)境中使用波長范圍: 340～380 nm 的熒光濾板閱片，否則會造成假陰性結(jié)果[7]。d.試劑貯存時，盡量避免高、低溫環(huán)境及陽光直射。e.每次試劑使用后，請迅速蓋好密封保存，以免揮發(fā)及影響效果。

1.3 觀察指標(biāo)及評價標(biāo)準(zhǔn)

比較兩種方法在痰真菌培養(yǎng)陽性結(jié)果中痰真菌涂片陽性率和真菌免疫熒光檢測的陽性率。以痰真菌培養(yǎng)結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，靈敏度=真陽性例數(shù)/（真陽性+假陰性）例數(shù)×100%；特異度=真陰性例數(shù)/（假陽性+真陰性）例數(shù)×100%；準(zhǔn)確度=（真陽性+真陰性）例數(shù)/總例數(shù)×100%。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 21.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計數(shù)資料采用率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 痰真菌涂片及痰真菌免疫熒光檢測結(jié)果

痰真菌涂片檢出真陽性患者30 例，真陰性患者12 例；痰真菌免疫熒光檢測檢出真陽性患者39 例，真陰性患者16 例（表1）。

表1 痰真菌涂片及痰真菌免疫熒光檢測結(jié)果（例）

2.2 兩種檢測方法靈敏度、特異度、準(zhǔn)確度的比較

痰真菌免疫熒光檢測結(jié)果靈敏度為92.86%，高于痰真菌涂片的71.42%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；痰真菌免疫熒光檢測結(jié)果特異度為88.89%，高于痰真菌涂片的66.67%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；痰真菌免疫熒光檢測結(jié)果準(zhǔn)確度為93.33%，高于痰真菌涂片的70.00%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）（表2）。

表2 兩種檢測方法靈敏度、特異度、準(zhǔn)確度的比較[%（n/N）]

3 討論

慢性阻塞性肺疾病是一種常見的疾病，其特征是持續(xù)的呼吸系統(tǒng)癥狀和氣流受限，通常是由氣道或肺泡異常引起的。2012年，約有300 萬人死于慢性阻塞性肺疾病，占全球死亡人數(shù)的6%；2013年，中國約有91 萬人死于慢性阻塞性肺疾病，占全球死亡總數(shù)的31.1%[8]。目前，慢性阻塞性肺病是全球第四大疾病死亡原因，預(yù)計到2020年將升至第三位[8]。在AECOPD患者中，感染是其發(fā)生的重要原因，近年來真菌感染的發(fā)病率逐漸上升，是導(dǎo)致AECOPD 惡化的誘因之一。肺部真菌感染的臨床表現(xiàn)缺乏特異性，易導(dǎo)致肺部感染的早期診斷和治療[9]。以往痰涂片革蘭氏染色法以其操作簡單、觀察方便等優(yōu)點被廣泛應(yīng)用于實驗室，但其陽性檢出率明顯低于培養(yǎng)法[10]。痰標(biāo)本真菌培養(yǎng)也是目前臨床微生物學(xué)檢查中最好的診斷方法，培養(yǎng)后，顯微鏡下可見真菌孢子、菌絲、顆粒和孢囊等，但培養(yǎng)時間長，標(biāo)本不合格或培養(yǎng)不規(guī)范，會降低結(jié)果的準(zhǔn)確性[11]。因此，痰涂片和痰培養(yǎng)需要進(jìn)一步的研究和分析。

真菌免疫熒光染色法是一種新型的真菌檢測方法，操作簡便、快速、準(zhǔn)確，可檢測各種真菌樣品[12]。該技術(shù)能快速、定性地檢測人體組織或標(biāo)本中可能存在的各種真菌，通過抗體特異性結(jié)合和形態(tài)學(xué)觀察，確保真菌檢測結(jié)果的高陽性率和高準(zhǔn)確率，從而提高臨床治愈率。真菌熒光染色用于苯乙烯類化合物，是一種新型非特異性熒光染料，通過特殊的熒光標(biāo)記結(jié)合幾丁質(zhì)酶與真菌細(xì)胞壁上的幾丁質(zhì)結(jié)合產(chǎn)生特異性，在熒光顯微鏡下觀察，菌絲和孢子在特定波長下發(fā)出明亮的藍(lán)色熒光，而其他成分均為淡灰藍(lán)色，能快速檢測出真菌，適用于各種疑似真菌感染的檢查，熒光染色法能快速高效地發(fā)現(xiàn)真菌菌絲和孢子，且結(jié)構(gòu)清晰，提高真菌檢測率[13]。本研究通過比較痰一般細(xì)菌涂片法及痰真菌免疫熒光檢測法的陽性率占真菌培養(yǎng)陽性結(jié)果中的比例，從而分析出上述兩種痰真菌檢測方法的優(yōu)勢，以便指導(dǎo)臨床快速診斷ACEOPD 患者真菌感染。本研究結(jié)果顯示，痰真菌免疫熒光檢測結(jié)果靈敏度為92.86%，高于痰真菌涂片的71.42%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；痰真菌免疫熒光檢測結(jié)果特異度為88.89%，高于痰真菌涂片的66.67%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；痰真菌免疫熒光檢測結(jié)果準(zhǔn)確度為93.33%，高于痰真菌涂片的70.00%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。提示痰真菌免疫熒光檢測適合推廣用于AECOPD 患者真菌感染快速診斷，能夠快速指導(dǎo)臨床抗真菌藥物的使用，從而對減少AECOPD 的治療負(fù)擔(dān)有重要意義[14-15]。

綜上所述，真菌免疫熒光法與痰真菌涂片相比具有更高的靈敏度、特異度和準(zhǔn)確度，可減少假陰性的發(fā)生，降低漏檢率，值得推廣應(yīng)用。