瑞舒伐他汀對(duì)載脂蛋白E基因敲除動(dòng)脈粥樣硬化小鼠的作用研究

吳 妍 韓 銓 胡 柳 王昱植 付國峰 郭 璐

浙江養(yǎng)生堂天然藥物研究所有限公司，浙江杭州 310024

動(dòng)脈粥樣硬化屬于心腦血管疾病范疇，涵蓋冠心病的根本病理基礎(chǔ)，是冠心病的主要潛在病因，包括脂質(zhì)代謝失調(diào)以及涉及單核細(xì)胞與功能紊亂的內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合[1]。動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)長期且十分復(fù)雜的病理過程，近幾十年來，已有多種假說解釋動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制，包括氧化應(yīng)激學(xué)說、機(jī)械損傷學(xué)說、炎癥學(xué)說等[1]，但目前為止以上所有學(xué)說均不能很好全面地解釋動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生與發(fā)展的全過程。由于動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制的復(fù)雜性以及其具有動(dòng)態(tài)變化的特性，給動(dòng)脈粥樣硬化的治療帶來了一定的困難。近年來，中醫(yī)中藥的療效優(yōu)勢逐漸受到重視，但中藥復(fù)方的作用靶點(diǎn)仍不甚明了。目前他汀類藥物是臨床應(yīng)用最為廣泛的調(diào)脂藥物[2]。本研究在既往研究的基礎(chǔ)上，以載脂蛋白E（apolipoprotein E，ApoE-/-）基因敲除動(dòng)脈粥樣硬化小鼠為研究對(duì)象，觀察瑞舒伐他汀調(diào)控血脂及相關(guān)炎癥指標(biāo)和抗動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 ApoE-/-小鼠，6 周齡，共20 只。同齡的具有相同遺傳背景的C57BL/6/J 小鼠10 只。所有動(dòng)物均在浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)，SPF 級(jí)，自由飲水及攝食。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物購自南京集萃藥康生物有限公司，合格證號(hào)：SCXK（蘇）20180008。本實(shí)驗(yàn)已經(jīng)過相關(guān)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核同意。

1.1.2 藥物及試劑 瑞舒伐他汀片[商品名：可定；規(guī)格：10 mg/片（按照人體最大劑量換算）；批號(hào)：S01102；阿斯利康藥業(yè)（中國）有限公司]。蘇丹Ⅳ染色劑（Sigma，貨號(hào)：198102）、無水乙醇、二甲苯購自中國醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司。

1.1.3 儀器 LWC400 全自動(dòng)血生化分析儀（深圳藍(lán)韻醫(yī)療科技有限公司）；OLYMPUS-SZ61 體式顯微鏡（Olympus optical 公司）；Kylin-bell TS-2 數(shù)顯搖床；西門子Sequoia512 彩色多普勒超聲診斷儀。

1.2 分組、造模及給藥

所有ApoE-/-小鼠6 周齡起全程給予高脂飼料。20 只ApoE-/-小鼠隨機(jī)分為模型組和瑞舒伐他汀組，每組各10 只。另10 只C57BL/6J 小鼠作為正常組予以普通飼料。正常組：給予等體積水灌胃并同時(shí)給予普通飼料；模型組：給予等體積水灌胃并同時(shí)給予高脂飼料；瑞舒伐他汀組：按瑞舒伐他汀片10 mg/kg劑量灌胃給藥并同時(shí)給予高脂飼料。所有小鼠均于16 周齡起給予藥物或水灌胃，灌胃時(shí)間為每天上午10 點(diǎn)，每天灌胃1 次，共計(jì)4 周，給藥并觀察至20 周齡末取材。

1.3 取材

每組小鼠于20 周齡末摘眼球取血并分離血清，檢測總膽固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）、血清腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、細(xì)胞間黏附分子（intercellular adhesion molecule，ICAM-1）、單核細(xì)胞趨化蛋白（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）。分離主動(dòng)脈予以甲醛固定，一半進(jìn)行動(dòng)脈粥樣硬化斑塊染色，一半進(jìn)行斑塊穩(wěn)定性及血管硬化程度分析。

1.4 檢測指標(biāo)

1.4.1 血脂檢測 各組小鼠分別摘眼球，內(nèi)眥取血，離心分離血清，檢測TC、TG、LDL。

1.4.2 血清TNF-α、ICAM-1、MCP-1 變化檢測 按照試劑盒說明書進(jìn)行檢測。

1.4.3 主動(dòng)脈病理形態(tài)學(xué)觀察 取主動(dòng)脈，甲醛固定，并采用蘇丹Ⅳ染色劑進(jìn)行染色，使用Image J 進(jìn)行斑塊面積分析。

1.4.4 動(dòng)脈超聲檢測 所有小鼠在處死之前1 d 禁食超過8 h，檢查前剔除腹部體毛，應(yīng)用西門子Sequoia512彩色多普勒超聲診斷儀，14 MHz 高頻線陣探頭分別測量肝后段主動(dòng)脈中膜厚度3 次，取平均值。同時(shí)測量同一位置主動(dòng)脈最大血流速度3 次（θ 角=60°），取平均值。

1.4.5 動(dòng)脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性分析 使用Movat5 色套染法和HE 染色，利用圖像分析軟件測量并計(jì)算胞外脂質(zhì)、泡沫細(xì)胞、膠原以及平滑肌各自占斑塊面積的比例，根據(jù)計(jì)算公式：斑塊易損指數(shù)=（胞外脂質(zhì)成分+泡沫細(xì)胞）/（平滑肌細(xì)胞+膠原成分）綜合評(píng)估瑞舒伐他汀對(duì)小鼠主動(dòng)脈斑塊穩(wěn)定性的影響。

1.4.6 動(dòng)脈粥樣硬化血管硬化程度分析 取小鼠主動(dòng)脈弓血管，包埋、切片后使用Von Kossa 染色法，在光鏡下觀測主動(dòng)脈鈣鹽沉積情況。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 瑞舒伐他汀對(duì)小鼠血脂水平的影響

與正常組比較，模型組小鼠的血清TC、TG、LDL水平均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與模型組比較，瑞舒伐他汀組小鼠的血清TG 水平下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；瑞舒伐他汀組小鼠的血清LDL、TC 水平與模型組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（圖1）。

2.2 瑞舒伐他汀對(duì)小鼠炎癥指標(biāo)的影響

與正常組比較，模型組小鼠的血清TNF-α、ICAM-1、MCP-1 水平均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；瑞舒伐他汀組小鼠的血清TNF-α、ICAM-1、MCP-1 水平與模型組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（圖2）。

圖2 各組實(shí)驗(yàn)小鼠血清TNF-α、ICAM-1、MCP-1 水平的比較（mmol/L，±s，n=10）

2.3 瑞舒伐他汀對(duì)斑塊面積的影響

模型組小鼠的主動(dòng)脈斑塊沉積面積平均值達(dá)39.66%，瑞舒伐他汀組小鼠的主動(dòng)脈斑塊沉積面積平均值達(dá)25.87%；瑞舒伐他汀組與模型組小鼠的主動(dòng)脈斑塊沉積面積比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）（圖3，封三）。

圖3 瑞舒伐他汀對(duì)斑塊面積的影響（n=6）

2.4 瑞舒伐他汀對(duì)主動(dòng)脈中膜厚度的影響

主動(dòng)脈超聲結(jié)果顯示，各組小鼠的主動(dòng)脈中膜厚度比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.8965，P=0.4302）（圖4）。

圖4 各組實(shí)驗(yàn)小鼠主動(dòng)脈中膜厚度的比較（±s，n=5）

2.5 瑞舒伐他汀對(duì)斑塊穩(wěn)定性的影響

與模型組比較，瑞舒伐他汀組的斑塊易損指數(shù)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）（圖5，封三）。

圖5 瑞舒伐他汀對(duì)斑塊穩(wěn)定性的影響（n=5）

2.6 瑞舒伐他汀對(duì)血管鈣化程度的影響

與模型組比較，瑞舒伐他汀組的血管鈣化面積降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）（圖6，封三）。

3 討論

動(dòng)脈粥樣硬化是冠心病的主要潛在病因，是脂質(zhì)代謝失調(diào)以及涉及單核細(xì)胞與功能紊亂的內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合，包括其募集到動(dòng)脈壁易感區(qū)以及分化為巨噬細(xì)胞并發(fā)育成泡沫細(xì)胞的炎癥過程的綜合結(jié)果[1，3]。泡沫細(xì)胞的積累使動(dòng)脈內(nèi)膜出現(xiàn)脂肪條紋，進(jìn)而隨著疾病的發(fā)展，泡沫細(xì)胞逐漸積累，導(dǎo)致形成動(dòng)脈粥樣硬化斑塊[1，4]。他汀類藥物是臨床驗(yàn)證有效的膽固醇合成抑制劑。他汀類藥物在降低血脂以及冠心病的一、二級(jí)預(yù)防中的作用已在多項(xiàng)大規(guī)模臨床試驗(yàn)一致地被證實(shí)[2]。然而，相關(guān)研究表明，他汀類藥物的作用可能遠(yuǎn)不止其降低血脂水平的作用[5-6]。他汀類藥物可能通過與血脂降低依賴無關(guān)的機(jī)制防止動(dòng)脈粥樣硬化來保護(hù)心血管系統(tǒng)。瑞舒伐他汀已顯示出幾項(xiàng)有益的特征，包括半衰期長、安全性良好以及較低可能與細(xì)胞色素P450 發(fā)生藥物相互作用等[7]。本研究利用ApoE-/-小鼠，探索瑞舒伐他汀在動(dòng)脈粥樣硬化形成后的作用效果以及在斑塊穩(wěn)定性和血管鈣化方向的改善情況。

引起動(dòng)脈粥樣硬化過程最廣泛使用的動(dòng)物模型是ApoE-/-小鼠[8]。ApoE-/-小鼠在正常的飲食條件下會(huì)發(fā)展為明顯的高膽固醇血癥，到3 個(gè)月大時(shí)會(huì)在主動(dòng)脈竇和主動(dòng)脈近端形成富含泡沫細(xì)胞的脂肪病變[9-10]，并在8～9 個(gè)月后出現(xiàn)纖維性病變[9，11-12]。這些小鼠的動(dòng)脈粥樣硬化病變具有人類和其他物種所特有的特征[9，11，13]，它們含有氧化特異性表位[14]，并且黏附分子VCAM-1 和ICAM-1 以及TF 的表達(dá)在該小鼠品系中被上調(diào)[15-16]。ApoE-/-小鼠對(duì)類似人的西方飲食（富含膽固醇）和藥理治療敏感[17-18]。

本研究發(fā)現(xiàn)瑞舒伐他汀在高膽固醇血癥ApoE-/-小鼠中具有抗動(dòng)脈粥樣硬化的特性，除了降低血清TG 外，并沒有降低膽固醇和降低炎癥的作用。實(shí)際上，在實(shí)驗(yàn)條件下，瑞舒伐他汀治療既不影響血漿脂質(zhì)（TC），也不影響治療期間膽固醇的總體暴露。Sparrow 等[19]也觀察到類似的結(jié)果。據(jù)報(bào)道，他汀類藥物在降低野生型和ApoE-/-小鼠的膽固醇水平方面均無效，這可能是由于缺乏LDL 受體（ApoE 的配體之一），或由于在該種小鼠體內(nèi)發(fā)生的HMG-CoA 還原酶補(bǔ)體代償性增加所致[19-21]。瑞舒伐他汀不具有很強(qiáng)的降膽固醇活性，這使得能夠評(píng)估其抗炎和抗血栓形成作用，并獨(dú)立于藥物的降膽固醇特性來考慮它們。在ApoE-/-小鼠內(nèi)皮中易發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化的部位，VCAM-1 和ICAM-1 的表達(dá)會(huì)上調(diào)，這一數(shù)據(jù)與相關(guān)報(bào)道[15]的研究結(jié)果一致。Kleeman 等[22]研究表明，瑞舒伐他汀可以降低血管壁中促動(dòng)脈粥樣硬化性細(xì)胞因子（如MCP-1 和TNF-α）的表達(dá)。但在本項(xiàng)研究中并未得到相似結(jié)果。

血管內(nèi)膜-中膜厚度是指內(nèi)膜回聲至中膜-外膜回聲之間的垂直距離，超聲測試模式測量動(dòng)物血管厚度大大提高了測量血管厚度的方便性和準(zhǔn)確性，而這一技術(shù)也在各種研究中逐漸普及[23]。本研究結(jié)果顯示，瑞舒伐他汀組的斑塊易損指數(shù)低于模型組（P<0.01），并且可以評(píng)估不同主動(dòng)脈段的斑塊穩(wěn)定性情況。血管鈣化是指發(fā)生于血管軟組織內(nèi)的不適當(dāng)?shù)拟}化，是動(dòng)脈粥樣硬化后期的病理表現(xiàn)，表現(xiàn)為血管壁僵硬性增加，順應(yīng)性降低，易引發(fā)血栓形成，斑塊破裂，是心腦血管疾病高發(fā)病率和高死亡率的重要原因。本研究發(fā)現(xiàn)ApoE-/-模型組小鼠主動(dòng)脈弓部位的血管有較多的鈣鹽沉積，即血管發(fā)生較為嚴(yán)重的硬化，瑞舒伐他汀組未有鈣鹽沉積。并且可以考慮不同主動(dòng)脈段的血管硬化情況。

綜上所述，瑞舒伐他汀可通過非降脂途徑降低ApoE-/-小鼠的動(dòng)脈粥樣硬化程度，并可改善斑塊的易損性以及血管鈣化程度。