莪術(shù)油乳膏外用對(duì)大鼠的長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn)研究

李文靜 劉 軍 包亞男 洪 博

齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，黑龍江齊齊哈爾 161006

莪術(shù)性溫，味辛、苦，來(lái)源于姜科植物蓬莪術(shù)、廣西莪術(shù)或溫郁金的干燥根莖[1-2]。有行氣破血、消積止痛的功效，屬活血化瘀要藥[3-4]。具有抗腫瘤、抗菌、升高白細(xì)胞、抗炎等藥理作用[5-8]。莪術(shù)中主要含揮發(fā)油、黃酮類、萜類等化學(xué)成分[9-11]。其中，莪術(shù)油的臨床應(yīng)用較廣泛，具有行氣活血、消積止痛、活血化瘀、增強(qiáng)機(jī)體免疫能力之功效[12-14]。多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，莪術(shù)油可改善乳腺癌癌前病變大鼠的血液黏度等指標(biāo)，其活血化瘀的藥理作用可能是防治乳腺癌的作用機(jī)制之一[15-17]。

正常乳腺組織惡化成帶有惡性腫瘤的乳腺組織是一個(gè)漸進(jìn)的過(guò)程，在乳腺癌變之前這一發(fā)展過(guò)程是可逆的。根據(jù)中醫(yī)理論，血瘀是乳腺癌癌前病變重要辯證，所以，本研究在以往的文獻(xiàn)研究基礎(chǔ)上，著眼于中醫(yī)藥的活血化瘀理論，結(jié)合大量的前期試驗(yàn)數(shù)據(jù)研制了莪術(shù)油乳膏用于乳腺增生的防治。該制劑制備工藝簡(jiǎn)單且質(zhì)量可控，為進(jìn)一步完善該制劑的開(kāi)發(fā)，長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)是必不可少的，本研究旨在考察外用藥莪術(shù)油乳膏對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠長(zhǎng)期連續(xù)經(jīng)皮給藥的毒性反應(yīng)及皮膚局部用藥的安全性。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及試劑

BP211D 精密電子天平（上海耀壯檢測(cè)儀器設(shè)備有限公司，精密度為0.1 mg）；Velocity 14R 臺(tái)式離心機(jī)（澳大利亞Dynamica 公司）；ADVIA2120 型全自動(dòng)血球分析儀（德國(guó)西門子公司）；AU5421 型全自動(dòng)生化分析儀（日本Olympus 公司）。莪術(shù)（批號(hào)：20150329）藥材購(gòu)自亳州市國(guó)峰藥業(yè)銷售有限公司，產(chǎn)地為安徽亳州，經(jīng)齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院中藥研究室郭麗娜教授鑒定為姜科植物蓬莪術(shù)Curcuma phaeocaulis的干燥根莖。乳膏基質(zhì)[齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院提供，由十六醇、聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）-8 蜂蠟、單硬脂酸甘油酯、甘油、月桂醇硫酸鈉、白凡士林和純化水組成]。

1.2 研究對(duì)象

雌性美國(guó)斯?jié)娎鄹瘛ざ嗬祝⊿prague Dawley，SD）大鼠體重為200～230 g，購(gòu)自于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證編號(hào)：SCXK（京）2007-0001，本研究經(jīng)過(guò)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核同意開(kāi)展。動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境：溫度20～25℃，相對(duì)濕度40%～70%。換氣次數(shù)10～15 次/h，照明時(shí)間每日12/12 h 交替照明。

1.3 方法

1.3.1 制劑制備 莪術(shù)油提?。喝》鬯楹蟮妮g(shù)藥材10 g，置于揮發(fā)油提取裝置的燒瓶中，最終得提取液為50 mL。取莪術(shù)油提取物10 mL，加入白凡士林18 g，十六醇28 g，PEG-8 蜂蠟18 mL 和單硬脂酸甘油酯32 g 于研缽中，置水浴加熱至75℃熔化，作為油相。另取月桂醇硫酸鈉24 g、甘油70 mL 和蒸餾水500 mL加熱至同樣溫度，作為水相。將水相細(xì)流狀攪拌條件下加至油相中，溫度降至60 ℃時(shí)加入主藥，繼續(xù)研磨直至冷卻即得。置于棕色試劑瓶中保存?zhèn)溆?，乳膏中莪術(shù)油含量為0.014 mL/g。

1.3.2 動(dòng)物分組及給藥 將30 只雌性SD 大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照（乳膏基質(zhì)）組，完整皮膚組和破損皮膚組3 組，每組10 只。給藥前24 h 用電推給大鼠胸部剃毛，脫毛部位為以乳頭為圓心，1 cm 為半徑的圓。破損皮膚組用針頭在剃毛后大鼠皮膚上劃“井”字至滲血[18]。將待測(cè)乳膏及空白基質(zhì)分別應(yīng)用于對(duì)應(yīng)組的大鼠胸部，用藥劑量為10 mg/cm2，每天2 次，連續(xù)給藥3 個(gè)月。

1.3.3 一般情況觀察 試驗(yàn)期間每日記錄各組大鼠的攝食、行為活動(dòng)、精神狀態(tài)、食欲等日常情況，及大鼠有無(wú)死亡情況。每周固定時(shí)間給大鼠稱重1 次，并適當(dāng)調(diào)整給藥劑量。期間如果發(fā)現(xiàn)有中毒反應(yīng)的大鼠應(yīng)馬上隔離，并觀察、記錄，如何有死亡大鼠應(yīng)及時(shí)進(jìn)行病理學(xué)檢查。

1.3.4 血液樣品測(cè)定 用全自動(dòng)血球分析儀對(duì)大鼠腹主動(dòng)脈血進(jìn)行血常規(guī)檢查：紅細(xì)胞（red blood cell，RBC）、白細(xì)胞（white blood cell，WBC）、血紅蛋白（haemoglobin，HGB）、中性粒細(xì)胞百分比（neutrophil percentage，NEUT）、血小板計(jì)數(shù)（platelet count，PLT）、單核細(xì)胞百分比（monocyte percentage，MONO）、淋巴細(xì)胞比值（lymphocyte ratio，LYMPH）、嗜酸細(xì)胞百分比（eosinophilic percentage，EO）、嗜堿細(xì)胞百分比（basophile percentage，BASO）。

取血球分析剩余的全血離心10 min（速度4000 r/min，半徑10 cm），用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血液生化各項(xiàng)指標(biāo)：谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（aminotransferase，ALT）、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（gamma-glutamyl transferase，GGT）、總膽汁酸（total bile acid，TBA）、總膽紅素（total bilirubin，TBil）、血清前白蛋白（preserum albumin，PA）、尿素（Urea）、尿酸（uric acid，UA）、肌酐（creatinine，Crea）。

1.3.5 病理檢查3 個(gè)月后，對(duì)各組大鼠進(jìn)行解剖，觀察心、肝、脾、肺、腎、卵巢等主要臟器的外觀及硬度等有無(wú)明顯病變。通過(guò)公式（質(zhì)量/體重×100%）計(jì)算各主要臟器系數(shù)，主要臟器及皮膚標(biāo)本進(jìn)行HE 染色試驗(yàn)（200×）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析及LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組大鼠一般情況結(jié)果的比較

實(shí)驗(yàn)期間，三個(gè)實(shí)驗(yàn)組大鼠生長(zhǎng)發(fā)育良好，均未出現(xiàn)中毒反應(yīng)，且無(wú)死亡現(xiàn)象。各組大鼠行為活動(dòng)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），肉眼觀察臟器的形態(tài)和硬度等均未見(jiàn)異常。各組大鼠的食量和體重在正常范圍內(nèi)增長(zhǎng)，給藥前后的體重組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；給藥前后的體重同組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（表1）。

表1 三組大鼠給藥前后體重的比較（g，±s）

表1 三組大鼠給藥前后體重的比較（g，±s）

組別只數(shù)給藥前給藥3 個(gè)月后t 值P 值空白對(duì)照組完整皮膚組破損皮膚組10 10 10 208.02±5.39 209.08±4.35 206.34±5.47 367.23±8.47 363.82±7.62 367.84±7.82 50.148 55.769 53.515 0.000 0.000 0.000

2.2 三組大鼠血常規(guī)指標(biāo)的比較

連續(xù)外用給藥3 個(gè)月后，破損皮膚組的WBC 高于空白對(duì)照組，破損皮膚組的HGB 低于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；BASO 在三組中無(wú)表達(dá)，EO 在三組表達(dá)水平接近，均為0.03%；其余指標(biāo)組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（表2）。

表2 三組大鼠血常規(guī)指標(biāo)的比較（±s）

表2 三組大鼠血常規(guī)指標(biāo)的比較（±s）

與空白對(duì)照組比較，aP＜0.05；“-”表示無(wú)數(shù)據(jù)

組別只數(shù) RBC（×1012/L）WBC（×109/L）HGB（g/L）NEUT（%）MONO（%）BASO（%）EO（%）LYMPH（%）PLT（×109/L）空白對(duì)照組完整皮膚組破損皮膚組F 值P 值10 10 10 8.31±0.13 8.08±0.29 8.19±0.08 3.458 0.162 6.64±0.32 6.05±0.33 7.79±0.34a 13.394 0.027 153.08±5.94 145.43±5.60 138.44±5.72a 7.621 0.049 0.34±0.04 0.36±0.05 0.39±0.11 4.902 0.339 0.035±0.00 0.039±0.01 0.041±0.01 5.126 0.305 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00--0.03±0.01 0.03±0.01 0.03±0.00 1.471 0.799 0.68±0.06 0.74±0.06 0.82±0.06 2.210 0.150 839.39±13.28 863.04±15.62 903.76±44.27 4.350 0.056

2.3 三組大鼠血液生化指標(biāo)的比較

連續(xù)外用給藥3 個(gè)月后，破損皮膚組的PA 水平高于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；其余指標(biāo)組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（表3）。

表3 三組大鼠血液生化指標(biāo)的比較（±s）

表3 三組大鼠血液生化指標(biāo)的比較（±s）

與空白對(duì)照組比較，aP＜0.05

組別只數(shù)AST（U/L）ALT（U/L）GGT（U/L）TBA（μmol/L）TBil（μmol/L）PA（g/L）Urea（mmol/L）UA（μmol/L）Crea（μmol/L）空白對(duì)照組完整皮膚組破損皮膚組F 值P 值10 10 10 141.84±7.31 134.36±11.21 125.64±9.76 2.551 0.254 45.04±4.12 39.86±5.96 38.20±4.23 3.574 0.061 2.36±0.76 2.22±0.82 2.24±0.61 1.221 0.652 9.31±1.17 10.36±1.54 10.45±2.54 3.911 0.051 1.85±0.23 2.37±0.53 2.01±0.66 3.353 0.099 1.05±0.29 2.25±0.32 3.13±0.67a 4.732 0.001 7.11±0.97 6.42±1.09 6.26±1.53 3.045 0.052 93.45±7.18 93.03±11.58 89.27±9.80 2.495 0.556 34.42±6.30 36.52±6.23 30.77±2.81 2.932 0.176

2.4 三組大鼠主要臟器系數(shù)結(jié)果的比較

各組大鼠的臟器系數(shù)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（表4）。

表4 三組大鼠主要臟器系數(shù)結(jié)果的比較（%，±s）

表4 三組大鼠主要臟器系數(shù)結(jié)果的比較（%，±s）

組別只數(shù)心肝脾肺腎卵巢空白對(duì)照組完整皮膚組破損皮膚組F 值P 值10 10 10 1.32±0.12 1.35±0.10 1.14±0.16 1.373 0.212 8.19±0.95 8.43±0.66 7.52±0.97 1.195 0.371 0.79±0.10 0.73±0.12 0.69±0.12 3.152 0.055 1.61±0.12 1.66±0.13 1.56±0.19 2.987 0.056 2.83±0.36 2.77±0.51 2.51±1.80 1.995 0.164 0.09±0.03 0.09±0.03 0.09±0.04 1.080 0.979

3 討論

乳腺增生癥與內(nèi)分泌功能紊亂密切相關(guān)，治療包括一般治療、藥物治療和手術(shù)治療[19]。一般治療是指平時(shí)注意清淡飲食，禁食辛辣刺激及含有雌激素的食物，保持良好的心情和規(guī)律作息。如果疼痛癥狀比較明顯，可以選擇服用一些中成藥來(lái)進(jìn)行藥物治療，如乳癖消等，或一些激素類西藥，比如三苯氧胺等[20]；但是有一些乳腺增生形成結(jié)節(jié)，性質(zhì)難以明確的需要手術(shù)治療。其中，藥物是最常用的治療手段，但口服藥物的副作用限制了其應(yīng)用。中藥外用制劑在乳腺增生的治療上具有靶向性好、毒副作用小等特點(diǎn)。

本研究中，莪術(shù)油乳膏對(duì)大鼠體重?zé)o明顯影響，比較各組大鼠行為活動(dòng)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），肉眼觀察臟器的形態(tài)和硬度等均未見(jiàn)異常；皮膚破損組的HGB 水平低于空白對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；皮膚破損組PA 水平高于空白對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；其余指標(biāo)與空白對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。個(gè)別指標(biāo)在破損皮膚組的差異表現(xiàn)可能是皮膚破損后，外用藥物刺激所致，但對(duì)于正常皮膚組各指標(biāo)均無(wú)顯著影響，提示對(duì)正常皮膚無(wú)刺激等副作用。

綜上所述，本研究的外用莪術(shù)油乳膏對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠未見(jiàn)明顯的長(zhǎng)期毒性。